Name: בתארו תקנה Dependent גורם שעתוק של transcriptome MicroRNA (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: חקור כיצד גורם שעתוק מווסת את ה-transcriptome של microRNA באמצעות כריית נתונים, ניתוח ביואינפורמטי ו-shRNA. שיטה זו משלבת מקורות מידע שונים לתיאור מקיף של דינמיקת תעתיק microRNA תלויי פעילות גורם השעתוק.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי מענק מטעם קרן המחקר גלובל CLL. האוניברסיטה של ​​מרכז טקסס MD Anderson Cancer נתמך בחלקו על ידי המכון הלאומי לבריאות בארה&quot;ב באמצעות מענק תמיכה במרכז לחקר הסרטן (P30CA16672).

1. זהה אתרי קישור גורם שעתוק ב האמרגן של גני MicroRNA שימוש בגישת כריית הנתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש דפדפן הגנום באוניברסיטת קליפורניה בסנטה קרוז (UCSC) כדי לחלץ immunoprecipitation הכרומטין הנתונים רצף (שבב) שנוצר כחלק האנציקלופדיה של אלמנט דנ&quot;א הפרויקט (קידוד). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את דפדפן שולחן בדפדפן הגנום UCSC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במפרטים הבאים כדי לחלץ את השולחן: clade: (יונקים), הגנום: (אדם), הרכבה: (Feb2009 (GRch37 / hg18)), קבוצה: (תקנה), מסלול (TxnFactorChIP), שולחן: (weEncoderesTFbsCo7steredv3), באזור : (הגנום), תבנית פלט (כל הגנים משולחן שנבחר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את הפלט של 1.1.2 כקובץ TXT ו- לתוך גיליון אלקטרוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למיין ולסנן עבור גורם שעתוק של עניין (למשל, STAT2). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש ברשימת יזמי microRNA מבוסס על חתימת אפיגנטיקה H3K4me3 הזמינה ב Baeer et al. 9 </sup&gt;. העתק רשימה זו לתוך קובץ .txt. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להתאים פי קואורדינטות על גנום האדם, למפות את הנתונים מ -1.1 ו -1.2 (למשל, STAT3 מחייבים על יזמי microRNA משוערים) ולקבוע זיקת מחייב החציוני באמצעות הקוד שנכתב ב- C חדה כפי שהמתואר משלים קידוד קובץ 1. </li></ol> 2. השתמשו shRNA כדי דאון-להסדיר את הביטוי של גורם שעתוק של ריבית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט 1.5 x 10 6 תאי 293 שורת תאי כליה עוברית אנושית בצלחת 10 סנטימטרים על כ 50% מפגש (DMEM עם 10% FBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי Transfect מ 293 קו תא הכליה עוברי אנושי עם 5 מיקרוגרם של חלבון פלואורסצנטי הירוק (GFP) lentivirus המכיל shRNA מופנים אל גורם השעתוק של עניין עם 5 מיקרוגרם של וקטורי אריזה באמצעות מגיב transfection עבור תאים חסידים על פי הפרוטוקול של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כביקורת, transfect את התאים מן 293 שורת תאי כליה עוברית אנושית עםמקושקשות shRNA ואת וקטורי אריזה על פי הפרוטוקול של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור תערובת transfection על תאים עבור 16 שעות (ב 37 ° C, CO 2 באינקובטור), ולאחר מכן שנה בתקשורת עד 10 מ&quot;ל התקשורת 10% טרי DMEM עם FBS 10%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המתן 48 transfection שעות שלאחר, בצנטריפוגה תרבית תאים (300 XG, 5 דק &#39;) ולאסוף supernatant זיהומיות. סנן את supernatant דרך פילטר מזרק 0.45 מיקרומטר (קרום יצטט תאית חינם פעיל שטח 25 מ&quot;מ) כדי להסיר את כל תאים צפו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכז את supernatant לאסוף את lentivirus באמצעות מכשיר מסנן ultracentrifugal עם סף של 100 kDa. ספין ב 950 XG עבור 30 - 60 דקות עד נפח כבר להתרכז פחות מ 250 μl. אחסן את הנגיף המרוכז ב -80 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transfect התאים עם lentivirus. הסר lentivirus קפוא מהמקפיא -80 ° C ו להפשיר לטמפרטורת החדר. העברת 100 μl של supernatant ויראלי לצינור טרי 1.5 מיליליטר microfuge. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בריןg את הנפח בצינור עד 1 מיליליטר עם מדיום בסרום מופחת. להוסיף ברומיד hexadimethrine עד 1 מ&quot;ל ההשעיה וירוס עבור ריכוז סופי של 10 ng / ml, מערבבים בעדינות ונותנים לתערובת לעמוד במשך 5 דקות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה 5 x 10 6 תאים עבור כל התמרה בעדינות resuspend התא גלולה ב 0.5 מ&quot;ל של התקשורת המכיל וירוס. בואו התאים להישאר בחממה 4 - 24 שעות, ולאחר מכן להוסיף 0.5 מ&quot;ל של מדיום עם FBS 20% לריכוז סופי של 10% FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתן 48 עד 72 שעות ו להכתים את התאים עם יודיד propidium (PI) וחלבון פלורסנט ירוק (GFP) על פי הוראות היצרן. הגן על התאים מפני אור ולהשתמש סדרן FACS למדוד את שיעורי GFP + / PI - תאים. מאז כתמי PI תאים מתים בלבד, שיעור זה הוא אומדן של יעילות transfection בתאים חיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיינו את אוכלוסיית תאים חיובית ביטוי של GFP (+ GFP) על ידי סדרן FACS כפי שתואר לעיל 10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש Westeסופג rn החיסונית כפי שתואר לעיל 10 כדי לקבוע את רמות פקטור שעתוק של עניין לפני ואחרי הדבקה של תאים בעלי עניין (למשל, תאים CLL) עם shRNA המיועד. </li></ol> 3. לקבוע את רמת הביטוי של transcriptome MicroRNA בתאים transfected עם תמלול Factor-shRNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד RNA באמצעות ערכה מסחרית על פי הפרוטוקול של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייבל RNA להכליא אותו microRNA microarray 11. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את microRNA לידי ביטוי באופן דיפרנציאלי בתאים transfected עם שעתוק גורם shRNA או עם פקדים וקטור ריק 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אמת את תוצאות microarray עבור מיקרו RNA לידי ביטוי ביותר דיפרנציאלי באמצעות בזמן אמת 5 PCR. </li></ol> 4. לקבוע את החפיפה בין ביואינפורמטיקה וגישת shRNA בתיאור transcriptome Dependent גורם שעתוק <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי Detסמור היחסי הצפוי וצופה גני microRNA כי נמל גורם שעתוק מחייבים אתרי היזמים שלהם והיו downregulated בתאי transfected-shRNA גורם שעתוק, בצע את הפעולות הבאות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג את היחס בין הגנים כי הנמל גורם שעתוק של עניין microRNA האמרגן / הכולל שלהם מהרשימה שנוצרה 1.3. רשימה זו היא היחס הצפוי (למשל, גני microRNA עם STAT3 אתרי קישור / גני microRNA הכוללים נבדקו = 0.25). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את מספר גנים שהיו downregulated בתאי transfected שעתוק הגורם-shRNA מהרשימה שנוצרה 3.3 ויש לו גורם שעתוק של אתרי קישור עניין מהרשימה שנוצרה 1.3. מספר / זה סה&quot;כ גנים downregulated הוא היחס הנצפה (למשל, הגנים microRNA עם STAT3 אתרי הקישור / המספר הכולל של מיקרו-רנ&quot;א downregulated = 0.6). </li></ol></li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש χ2 סטטיסטיקה להשוות את היחסים ציינו וצפויים שנוצרו לעיל לקבוע אם הרשימה של גנים שהיו downregulated בתאי transfected שעתוק הגורם-shRNA מועשרת עם גורם שעתוק מחייבים אתרי האמרגן שלהם. </li></ol>

<ol><li>Bentwich, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+hundreds+of+conserved+and+nonconserved+human+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Identification of hundreds of conserved and nonconserved human microRNAs.</a> Nat Genet. 37, 766-770 (2005).</li>
<li>Hata, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+of+microRNAs+in+cardiovascular+biology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Functions of microRNAs in cardiovascular biology and disease.</a> Annu Rev Physiol. 75, 69-93 (2013).</li>
<li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%3A+target+recognition+and+regulatory+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs: target recognition and regulatory functions.</a> Cell. 136, 215-233 (2009).</li>
<li>Piriyapongsa, J., Jordan, I. K., Conley, A. B., Ronan, T., Smalheiser, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor+binding+sites+are+highly+enriched+within+microRNA+precursor+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Direct%22%5BJournal%5D)">Transcription factor binding sites are highly enriched within microRNA precursor sequences.</a> Biol Direct. 6, 61(2011).</li>
<li>Rozovski, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+transducer+and+activator+of+transcription+%28STAT%29-3+regulates+microRNA+gene+expression+in+chronic+lymphocytic+leukemia+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer%22%5BJournal%5D)">Signal transducer and activator of transcription (STAT)-3 regulates microRNA gene expression in chronic lymphocytic leukemia cells.</a> Mol Cancer. 12, 50(2013).</li>
<li>Turner, M. J., Slack, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+control+of+microRNA+expression+in+C.+elegans%3A+promoting+better+understanding%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional control of microRNA expression in C. elegans: promoting better understanding.</a> RNA Biol. 6, 49-53 (2009).</li>
<li>Cui, Q., Yu, Z., Pan, Y., Purisima, E. O., Wang, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+preferentially+target+the+genes+with+high+transcriptional+regulation+complexity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs preferentially target the genes with high transcriptional regulation complexity.</a> Biochem Biophys Res Commun. 352, 733-738 (2007).</li>
<li>Yamakuchi, M., Lowenstein, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiR-34%2C+SIRT1+and+p53%3A+the+feedback+loop%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">MiR-34, SIRT1 and p53: the feedback loop.</a> Cell Cycle. 8, 712-715 (2009).</li>
<li>Baer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+promoter+DNA+hypermethylation+and+hypomethylation+is+associated+with+aberrant+microRNA+expression+in+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Extensive promoter DNA hypermethylation and hypomethylation is associated with aberrant microRNA expression in chronic lymphocytic leukemia.</a> Cancer Res. 72, 3775-3785 (2012).</li>
<li>Hazan-Halevy, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT3+is+constitutively+phosphorylated+on+serine+727+residues%2C+binds+DNA%2C+and+activates+transcription+in+CLL+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">STAT3 is constitutively phosphorylated on serine 727 residues, binds DNA, and activates transcription in CLL cells.</a> Blood. 115, 2852-2863 (2010).</li>
<li>Melo, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+TARBP2+mutation+in+human+cancer+impairs+microRNA+processing+and+DICER1+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">A TARBP2 mutation in human cancer impairs microRNA processing and DICER1 function.</a> Nat Genet. 41, 365-370 (2009).</li>
<li>Akira, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+roles+of+STAT+family+proteins%3A+lessons+from+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Functional roles of STAT family proteins: lessons from knockout mice.</a> Stem Cells. 17, 138-146 (1999).</li>
<li>Frank, D. A., Mahajan, S., Ritz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+lymphocytes+from+patients+with+chronic+lymphocytic+leukemia+contain+signal+transducer+and+activator+of+transcription+%28STAT%29+1+and+STAT3+constitutively+phosphorylated+on+serine+residues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">B lymphocytes from patients with chronic lymphocytic leukemia contain signal transducer and activator of transcription (STAT) 1 and STAT3 constitutively phosphorylated on serine residues.</a> J Clin Invest. 100, 3140-3148 (1997).</li>
<li>Calin, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+profiling+reveals+distinct+signatures+in+B+cell+chronic+lymphocytic+leukemias%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">MicroRNA profiling reveals distinct signatures in B cell chronic lymphocytic leukemias.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 11755-11760 (2004).</li>
<li>Consortium, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+user%27s+guide+to+the+encyclopedia+of+DNA+elements+%28ENCODE%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+biology%22%5BJournal%5D)">A user's guide to the encyclopedia of DNA elements (ENCODE).</a> PLoS biology. 9, e1001046(2011).</li>
<li>Miranda, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pattern-based+method+for+the+identification+of+MicroRNA+binding+sites+and+their+corresponding+heteroduplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A pattern-based method for the identification of MicroRNA binding sites and their corresponding heteroduplexes.</a> Cell. 126, 1203-1217 (2006).</li>
<li>Consortium, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489, 57-74 (2012).</li>
<li>Lau, J. C., Hanel, M. L., Wevrick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+and+imprinted+epigenetic+modifications+of+the+human+NDN+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific and imprinted epigenetic modifications of the human NDN gene.</a> Nucl Acids Res. 32, 3376-3382 (2004).</li>
<li>Corcoran, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+of+mammalian+microRNA+promoters+emerge+from+polymerase+II+chromatin+immunoprecipitation+data%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Features of mammalian microRNA promoters emerge from polymerase II chromatin immunoprecipitation data.</a> PLoS One. 4, e5279(2009).</li>
<li>Bhattacharyya, M., Feuerbach, L., Bhadra, T., Lengauer, T., Bandyopadhyay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+transcription+start+site+prediction+with+multi-objective+feature+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Stat+Appl+Genet+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">MicroRNA transcription start site prediction with multi-objective feature selection.</a> Stat Appl Genet Mol Biol. 11, Article 6 (2012).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין אינטרסים פיננסיים מתחרים.

המנגנון שבבסיס RNA פולימראז II- השעתוק התלוי של גני המקודדים חלבונים, נחקר בהרחבה. בעוד אלמנטים אלה מהווים רק 1% - 2% של הגנום האנושי, ראיות מפרויקט הקידוד מראים כי למעלה מ -80% של הגנום האנושי עשויים לעבור שעתוק 17 ומה מסדיר את התעתיק של רצפי דנ&quot;א ללא קידוד נותר ברובה לא ידוע 6 . מספר מחקרים, אשר הצביעו על כך Pol II הוא גם אחראי על שעתוק של גנים מסוימים שאינם המקודדים חלבונים כולל <sup...

מייקרו RNA הוא RNAs רגולטוריות קידוד הלא קטן אנדוגני כי בדרך כלל לתפקד כמו רגולטורים שליליים של ביטוי mRNA ברמת posttranscriptional. כ -1,000 ללא קידוד 20 עד 25 מיקרו-רנ&quot;א ארוך נוקלאוטיד נמצאים בגנום האנושי 1,2. מיקרו RNA לווסת ביטוי גנים באמצעות זיווג בסיס הקנונית בין רצף זרע של microRNA ורצף המשחק זרע המשלים, הנמצא בדרך כלל על האזור מתורגמת &#39;3 (UTR) של תעתיקי היעד. באופן קולקטיבי, מיקרו-רנ&quot;א לווסת יותר מ -30% של הגנים המקודדים חלבונים 3, אבל רק מעט מאוד ידוע על שעתוק מ- DNA של מיקרו-רנ&quot;א. הועלתה השערה כי הסדרת שעתוק microRNA דומה לזה של mRNA 4,5. בפרט, בדומה לפעילותה בקידום שעתוק של גנים המקודדים חלבונים, גורמי שעתוק נחשבים להפעיל שעתוק של מיקרו-רנ&quot;א 6. תמלול גורם-מ &#39;גומלין icroRNA דווח כגורם אפנן של ביטוי גנים 7, והוא רשאי גם טופס היזון חוזר ולולאות-קדימה להאכיל. לדוגמה, Yamakuchi et al. דיווח לולאת משוב שבו p53 גורם הביטוי של microRNA34a, אשר בתורו מעכב תרגום של SIRT מדכא p53 ו- p53 ובכך להגדיל פעילות 8. בעוד דוגמאות ספציפיות הביטוי תלויה גורם שעתוק של מיקרו-רנ&quot;א דווחו, שיטה מקובלת המספק מידע על איך גורם שעתוק של עניין מסדיר את הביטוי של-transcriptome microRNA חסר. מטרת הפרוטוקול הציע בזאת היא לספק תיאור המעמיק של רגולציה גורמת תלויה שעתוק של-transcriptome microRNA. על ידי שילוב של נתונים זמינים לציבור, כלי ביואינפורמטיקה בטכנולוגיית microarray, חוקרים העוקבים אחר אלגוריתם זה יהיה מסוגל לתפוס בסולם גנומי איך כלגורם שעתוק לכל סוג תא של עניין מסדיר את הביטוי של transcriptome-microRNA וכדי לחקור תרומה משוערת של mRNA-גורם שעתוק ויסות ביטוי microRNA.

<table><tbody><tr><td>Lipofectamin 2000</td><td>Life Technologies</td><td>11668027</td><td></td></tr><tr><td>0.45 ומיקרו; מסנן מזרק m</td><td>Thermo Scientific (Nalgene)</td><td>190-2545</td><td></td></tr><tr><td>מכשיר מסנן אולטרה-צנטריפוגלי Amicon עם סף של 100&nbsp; kDa</td><td>Merck Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Merck Millipore</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reagent</td><td>Life Tachnologies (Invitrogen)</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>293 קו תאים אנושי</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>85120602</td><td></td></tr></tbody></table>

בתארו תקנה dependent גורם שעתוק של transcriptome microrna

Describing a Transcription Factor Dependent Regulation of the MicroRNA Transcriptome

בעוד תקנה שעתוק של גנים המקודדים חלבונים נחקרה בהרחבה, מעט מאוד ידוע על איך גורמי שעתוק המעורבים שעתוק של RNA ללא קידוד, במיוחד של מיקרו-רנ&quot;א. כאן, אנו מציעים אסטרטגיה ללמוד את התפקיד הפוטנציאלי של גורם שעתוק בוויסות שעתוק של מיקרו RNA באמצעות נתונים זמינים לציבור, משאבים חישוביים ונתונים קצב העברת נתונים גבוה. אנו משתמשים חתימת אפיגנטיים H3K4me3 לזהות יזמי microRNA ו immunoprecipitation הכרומטין (שבב) נתוני -sequencing מפרויקט קידוד לזהות יזמי microRNA מעשירים עם גורם שעתוק אתרי קישור. על ידי transfecting תאים בעלי עניין עם shRNA מיקוד גורם שעתוק של עניין והכפפת התאים למערך microRNA, אנחנו לומדים את השפעת גורם שעתוק זה על transcriptome microRNA. כדוגמא המחשה נשתמש המחקר שלנו על השפעת STAT3 על transcriptome microRNA של ly הכרוניתלוקמיה mphocytic (CLL) תאים.

STAT3 הוא גורם שעתוק אשר בדרך כלל גורם שעתוק של גנים שיש להם אפופטוטיים אנטי ואפקטים שגשוג 12. אם STAT3 להשפיע גם על transcriptome RNA ללא קידוד לפי שעה לא ברור. בכל תאי CLL STAT3 עובר פוספורילציה constitutively על סרין 707 שאריות 10,13. Phosphoserine STAT3 הסעות לגרעין, נקשר ל- DNA, ומפעיל גנים הידועים בכך שהם מופעלים על ידי טירוזין pSTAT3 בסוגי תאים אחרים 10. בגלל CLL מאופיין הסרת הפיקוח הגלובלי של הרשת microRNA <...

כאן אנו מציעים אסטרטגיה לחקור את ההשפעה של גורם שעתוק מעניין על טרנסקריפטום המיקרו-RNA באמצעות נתונים זמינים לציבור, משאבים חישוביים ונתוני תפוקה גבוהה ממערכי מיקרו-RNA לאחר העברת תאים עם RNA קטן (sh)RNA המכוון לגורם שעתוק מעניין.

בתארו תקנה Dependent גורם שעתוק של transcriptome MicroRNA

While the transcription regulation of protein coding genes was extensively studied, little is known on how transcription factors are involved in ...

המטרה הכללית של מתודולוגיה זו היא לתאר כיצד גורם שעתוק רצוי מווסת את טרנסקריפטום ה-microRNA. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בנוגע לשאלה האם גורמי שעתוק המווסתים את השעתוק של גנים מקודדי חלבון מעורבים גם בשעתוק של microRNAs. היתרון המרכזי של מתודולוגיה זו הוא שהיא משלבת כריית נתונים, נתונים מעבדה וניתוח ביואינפורמטי כדי לספק תיאור מקיף של שעתוק גני microRNA התלוי בפעילותו של גורם השעתוק הרצוי.למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי האינטראקציה בין שעתוק גני microRNA לבין פעילותו של גורם השעתוק status, חשוב לזכור כי זוהי שיטה תיאורית ויש לאשר קשר כזה באמצעות בדיקות נוספות. כדי להתחיל, פתחו דפדפן גנומי, כגון דפדפן הגנום של University of California Santa Cruz, על מנת להוציא נתוני ריצוף של שיקוע חיסוני של כרומטין (chromatin immunoprecipitation sequencing). לאחר הכניסה לאתר, עברו לתפריט העליון, בחרו ב-Tools ופתחו את ה-Table Browser.הזינו את המפרטים, כפי שמוצג כאן, לתיבות המתאימות, ולאחר מכן בחרו ב-Get Output כדי להפיק את הטבלה. שמרו את הפלט כקובץ טקסט. לאחר מכן, ייבאו את הקובץ לגיליון אלקטרוני.לאחר המעבר לתוכנת הגיליונות, מיינו את עמודת השמות וסננו את התוצאות עבור גורם שעתוק הרלוונטי, כגון STAT2. לאחר מכן, העתיקו את רשימת מקדמי ה-microRNA המבוססת על החתימה האפיגנטית H3K4me3 והדביקו את הרשימה לקובץ txt. לאחר מכן, השתמשו בקוד הנלווה שנכתב ב-SQL ומסופק בקבצי הנתונים המשלימים כדי למפות את הנתונים שנאספו ולקבוע את חציוני זיקת הקישור.ראשית, העבירו 1.5 מיליון תאי HEK293 לצלחית של 10 סנטימטרים והוסיפו DMEM מועשר ב-10% FBS. דגרו את התאים למשך 24 שעות עד שיגיעו לכ-50% התלכדות (confluency). לאחר מכן, החליפו את המצע.לאחר מכן, הוסיפו חומר טרנספקציה בשילוב עם 5 µg של Lentivirus עם חלבון פלואורסצנציה ירוק המכיל את ה-shRNA המטרה ו-5 µg של וקטורים לאריזה, בהתאם להוראות היצרן. כביקורת, בצעו טרנספקציה לצלחת תאים זהה באמצעות shRNA scrambled ווקטורי האריזה. דגרו את תערובת הטרנספקציה על התאים למשך 16 שעות, ולאחר מכן החליפו את המצע ל-10 mL של מצע DMEM טרי המועשר ב-10% FBS.48 שעות לאחר הטרנסווקציה, הסיר את המצע מהתאים. לאחר מכן, סבב בצנטריפוגה במשך חמש דקות כדי לאסוף את העלייה (supernatant) הזיהומית. סנן את העלייה באמצעות מסנן מזרק של 0.45 מיקרון כדי להסיר תאים צפים.בשלב הבא, העבירו את המצע למכשיר סינון אולטרה-צנטריפוגלי עם סף של 100 kilodaltons. צנטריפוגו את המצע כדי לרכז את ה-Lentivirus עד שנפח הנוזל יהיה פחות מ-250 microliters. העבירו את הנוזל שנותר לקריו-מבחנה ואחסנו את הנגיף המרוכז בטמפרטורה של minus 80 degrees Celsius עד למועד השימוש.כאשר תהיו מוכנים להמשיך, הוציאו את ה-Lentivirus הקפוא מהמקפיא בטמפרטורה של 80- מעלות והביאו את המבחנה לטמפרטורת החדר. העבירו 100 µL של עלנוזיר (supernatant) ויראלי למבחנת מיקרופוג רעננה בנפח 1.5 mL והוסיפו 900 µL של מצע ללא סרום. לאחר מכן, הוסיפו 10 ng/mL של hexadimethrine bromide לתוך תרחיף הנגיף בנפח 1 mL.ערבבו את המבחנה בעדינות, והניחו לתערובת לעמוד במשך חמש דקות. אספו חמישה מיליון תאים עבור כל טרנסדוקציה מתוכננת, ולאחר מכן השהו בעדינות את משקע התאים ב-0.5 milliliters של מצע המכיל וירוס. העבירו את התאים לפלטה בעלת 12 בארות והדגירו אותם למשך ארבע עד 24 שעות.לאחר מכן, הוסיפו 0.5 milliliters נוספים של מצע המכיל 20%FBS. 48 עד 72 שעות לאחר התעתוק (transduction), קצרו את התאים וצבעו אותם ב-propidium iodide בהתאם להוראות היצרן. לאחר הצביעה, הגנו על התאים מהאור והשתמשו ב-facts כדי להעריך את יעילות הטרנספקציה על ידי מדידת שיעורי התאים החיוביים ל-GFP והשליליים ל-propidium iodide.לאחר מכן, אספו את אוכלוסיית התאים הממוינת החיובית ל-GFP והפיקו מהם את החלבונים. לבסוף, השתמשו ב-western blotting כדי לקבוע את רמות גורם השעתוק המיועד לפני ואחרי הדבקת התאים ב-shRNA המוגדר. לאחר הטרנסווקציה של תאי CLL עם STAT3 shRNA, רמות ה-STAT3 mRNA והחלבון STAT3 ירדו באופן משמעותי.בנוסף, מערך microRNA של תאי CLL הראה 23 סוגי microRNAs שהביטוי שלהם היה שונה באופן מובהק בין תאי CLL שעברו טרנספקציה עם STAT3 shRNA לבין תאי CLL שעברו טרנספקציה עם וקטור ריק. תוצאות מערך ה-microRNA תוקפו עבור שבעה מהגנים, המוצגים כאן, באמצעות quantitative RT-PCR. לאחר הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון chromatin immunoprecipitation, electromobility shift assay ו-difference assay כדי לאמת שגורם שעתוק זה נקשר למקדם (promoter) של גן מטרה ספציפי ומפעיל אותו.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן השילוב של ניתוח ביואינפורמטיקה, נתונים הזמינים לציבור והשתקה של גורם שעתוק באמצעות גישת shRNA, כדי לגלות כיצד גורם שעתוק זה מווסת את הביטוי של גנים של microRNA.

describing-transcription-factor-dependent-regulation-microrna

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

ספריית מזהה היעד הוא פלסמיד מבוסס, הגנום כולו אוסף של cDNA משובטים לשמש לזיהוי מטרות מירנה. כאן אנו מדגימים את השימוש והיישום.

הגנום כולו מסך עבור מטרות מירנה שימוש יעד המשימה ספריית מזהה

מיקרו RNA (miRNAs) הם הרגולטורים החשובים של ביטוי גנים הוכחו לשחק תפקיד תהליכים ביולוגיים רבים. כדי להבין טוב יותר מירנה-UTR אינטראקציות, יצרנו אוסף גנום רחב של 3 כתבים UTR בלוציפראז יחד עם הגן בלוציפראז הרומן מגיב assay, מערכת LightSwitch.

זיהוי מטרות של רנ&quot;א האדם עם מערכת Assay בלוציפראז LightSwitch באמצעות 3&#39;UTR-הכתב בונה microRNA מחקים בתאים חסיד

אנו מתארים כאן שיטה לוויסות טרופיזם של נגיף הפיקורנה על ידי שילוב רצפים משלימים למיקרו-רנ"א ספציפיים בגנום הנגיפי.  ניתן להתאים פרוטוקול זה לכל סוגי הנגיפים השונים עם שינויים המבוססים על אורך ואופי מחזור החיים שלהם.

תקנה מבוססת MicroRNA של Picornavirus כמיהות

דו ח זה מתאר שיטה מהירה ואמינה עבור אימות מטרות mRNA miRNAs הסלולר. משתמשת בשיטה biotinylated סינתטי מבוססת מגבר קדם חומצת גרעין נעול miRNA מחקה ללכידת המטרה mRNA. לאחר מכן, מצופים streptavidin beads מגנטי מועסקים הנפתח המטרה mRNA על כימות על ידי תגובת שרשרת של פולימראז qPCR.

הנועד מבוסס-ביוטין הנפתח Validate mRNA miRNAs מטרות של הסלולר

פיתחנו בדיקת כתב ביוגנזה של מיקרו-רנ"א אינטרוני, שתשמש בתאים במבחנה עם ארבעה פלסמידים: אחד עם miRNA אינטרוני, אחד עם המטרה, אחד כדי לבטא יתר על המידה חלבון רגולטורי, ואחד עבור Renilla luciferase. ה-miRNA עובד ויכול היה לשלוט בביטוי לוציפראז על ידי קשירה לרצף המטרה.

בדיקת כתב לניתוח התבגרות מיקרו-רנ"א אינטרוניים בתאי יונקים

כאן אנו מתארים זמנית אופטימיזציה הפוך transcriptase PCR כמותי (qRT-PCR) פרוטוקול בשילוב עם פלטפורמת microfluidic ככלי העלות והזמן תפוקה גבוהה יעיל ההקרנה microRNA (מירנה) רמות הביטוי, במיוחד כאשר עובדים עם כמויות מוגבלות של המדגם.

תפוקה גבוהה פרופיל MicroRNA: Multiplex אופטימליים qRT-PCR בקנה מידה Nanoliter על IFCs דינמי Fluidigm ArrayTM

Non-הרסני להדמיה נפח יכולה להיות מושגת רק על ידי טכניקות טומוגרפית, מתוכם היעילה ביותר היא טומוגרפיה רנטגן מיקרו ממוחשבת (CT).

ברזולוציה גבוהה 3D הדמיה של Ex-Vivo דגימות ביולוגיות באמצעות מיקרו-CT

אנו מתארים את השימוש של המכשיר הפסיקה זרימת לחקור הן את רדוקטיביים ו חמצוני חצאי...

מעקב אחר רדוקטיביים ו חמצוני חצאי תגובות של Monooxygenase פלבין תלויי באמצעות הופסק-Flow spectrophotometry

אנו מציגים שילוב של מיקרוסקופיה קריו אלקטרונים, ננוטכנולוגיה שומנים בדם, וניתוח מבנה מיושם כדי לפתור את מבנה הקרום הנכנס של שתי צורות FVIII הומולוגיות מאוד: אדם וחזירי. המתודולוגיה שפותחה במעבדה שלנו כדי לארגן helically שתי צורות FVIII רקומביננטי פונקציונליות על צינורות טעונים שלילי שומנים (LNT) הוא תאר.

ארגון סליל של דם קרישת פקטור VIII ביפידים צינוריות

בזאת אנו מתארים שיטות פשוטות להכנה של שלפוחית, אנקפסולציה של שעתוק ותרגום מכונה, והניטור של ייצור חלבון. מערכות תא ללא כתוצאה מכך יכולות לשמש כנקודת התחלה שממנו ניתן לבנות מחקה סלולרי מורכב יותר ויותר.

Encapsulation של תמלול נטול סלולרי ומכונות בתרגום לשלפוחית ​​לבניית מחקה סלולרי

חקור כיצד גורם שעתוק מווסת את ה-transcriptome של microRNA באמצעות כריית נתונים, ניתוח ביואינפורמטי ו-shRNA. שיטה זו משלבת מקורות מידע שונים לתיאור מקיף של דינמיקת תעתיק microRNA תלויי פעילות גורם השעתוק.

בתארו תקנה Dependent גורם שעתוק של transcriptome MicroRNA

גלה סרטונים נוספים