Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, רוחב מחיצת גרעין, וסטריאטום ספציפי ברחם Electroporation בC57BL / 6 העכבר

המטרה הכוללת של מניפולציה זו של תאים in vivo היא לשנות באופן ספציפי תאים של אזורים מסוימים במערכת העצבים המרכזית של קליפת המוח דמוית העכבר, ההיפוקמפוס, התלמוס, ההיפותלמוס, גרעין המחיצה הצדדית והסטריאטום. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח הנוגעות להתפתחות ותפקוד המוח, למשל, באמצעות זיהוי מפלי איתות שונים וקביעת רמת התמיינות התאים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת מניפולציה מהירה ויעילה של סוגי תאים שונים במערכת העצבים המרכזית ללא ייצור גוזל זמן של עכברים מהונדסים גנטית.

בדרך כלל, ההדגמה של שיטה זו מועילה, מכיוון שאנשים חדשים בשיטה זו יתקשו לעתים קרובות למצוא את מיקום האלקטרודה הנכון, שהוא קריטי לאלקטרופורציה ספציפית. כדי להתחיל בהליך זה, יש לחתוך את חלל הבטן של עכבר בהריון מורדם בעזרת אזמל. מנע את התייבשות חלל הבטן הפתוח על ידי הרטבתו בתמיסת מלח מתיל אלכוהול חמה 0.9%.

לאחר מכן, חלץ בזהירות את קרני הרחם באמצעות זוג מלקחיים טבעתיים. לאחר מכן, מקם עובר E14 כך שלא יהיו כלים גלויים מעל אתר הניקוב. כדי לקבל הדמיה טובה יותר, השתמש באלקטרודה של 5 מילימטר כדי לאתר את הזווית והמיקום של האזור הרצוי במוח לטרנספקציה.

עבור אלקטרופורציה ברחם של אזור קליפת המוח, יש להזריק לאט 1.5 עד שני מיקרוליטרים של תמיסת ה-DNA בחדר הצדדי השמאלי. וודא שעומק ההחדרה הוא מילימטר עד שניים, הנמדד מדופן הרחם. לאחר מכן, בדוק אם יש צבע כחול-ירוק עם תיחום חד.

להדמיה טובה יותר, השתמש באלקטרודה של 5 מילימטר כדי לאתר את הזווית והמיקום של המיקום הרצוי במוח לטרנספקציה. לאחר מכן, הניחו את מרכז משוטי אלקטרודות הפלטינה בגודל שלושה מילימטר ממש לפני פרימורדיית האוזן, וודאו שהם לא ממוקמים מעל כלי הדם או השליה. לאחר מכן, הפעל מתח כדי להתחיל בטרנספקציה.

עבור אלקטרופורציה ברחם של היווצרות ההיפוקמפוס, הזריק שני מיקרוליטרים של תמיסת DNA בחדר הצדדי הימני של עובר E15. לאחר מכן, מקם את הקוטב השלילי של משוטי אלקטרודות הפלטינה של שלושה עד חמישה מילימטר ממש לפני פרימורדיום האוזן, ואת הקוטב החיובי באמצע פרימורדיום האוזן. לאחר מכן, הפעל מתח כדי להתחיל בטרנספקציה.

עבור אלקטרופורציה ברחם של גרעין המחיצה הצדדית והסטריאטום, הזריק מיקרוליטר אחד של תמיסת DNA בחדר הצדדי הימני של עובר E12. לאחר מכן, הנח את האלקטרודות בגודל 5 מילימטר בגובה פרימורדיית האוזן. לאחר מכן, הפעל מתח כדי להתחיל בטרנספקציה.

עבור אלקטרופורציה ברחם של התלמוס וההיפותלמוס, הזריק 1 עד 1.5 מיקרוליטר של תמיסת DNA בחדר הצדדי של עובר E12 עד E13. לאחר מכן, המתן שתיים עד שלוש דקות עד שהתמיסה תתפזר לחדר השלישי. לאחר מכן, הניחו את האלקטרודות בגודל 5 או 3 מילימטר ממש מאחורי פרימורדיית האוזן.

לאחר מכן, הפעל מתח כדי להתחיל בטרנספקציה. סכימה זו מציגה את המיקומים המתאימים לקוטב החיובי והשלילי עבור טרנספטינג של אזורים בקליפת המוח. וזה מראה את מיקומי הקוטב החיובי והשלילי למעבר תצורות ההיפוקמפוס.

מיקומי הקוטב החיובי והשלילי למעבר הסטריאטום וגרעין המחיצה הצדדית מוצגים כאן. והמיקומים המתאימים של האלקטרודות להעברת התלמוס וההיפותלמוס מוצגים כאן. הספציפיות של טרנספקציה תלויה בגודל האלקטרודה.

הגדלת גודל משוט האלקטרודה מפחיתה את הספציפיות של הטרנספקציה. זה בולט במיוחד בשלבים עובריים צעירים יותר, אך נראה גם בשלבים עובריים מאוחרים. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך 15 דקות אם היא מבוצעת כראוי.

בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לטפל בעוברים ובאימהות בזהירות רבה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להעביר אזורים ספציפיים במערכת העצבים המרכזית של העכבר השחור 6.