הזרקת intracerebroventricular של פפטידים עמילואיד-β בעכברים נורמליים כדי לגרום בחריפות גירעונות אלצהיימר דמוי קוגניטיבית
16 במרץ 2016
העמילואיד-β (Aβ) -injected במודל חיה מאפשרת לממשל של כמות לבין מינים מוגדרים של שברי Aβ ומפחית הבדלים אינדיבידואליים בתוך כל קבוצת לימוד. פרוטוקול זה מתאר את intracerebroventricular (ICV) הזרקה של Aβ ללא מכשירים stereotactic, המאפשרת הפקה של ליקויים התנהגותיים אלצהיימר דמויי בעכברים נורמליים.
המטרה הכוללת של הליך כירורגי זה היא לבצע הזרקה תוך מוחית של עמילואיד בטא ללא מכשירים סטריאוטקטיים, ולגרום באופן חריף להפרעות התנהגות דמויות אלצהיימר בעכברים רגילים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הנוירוביולוגיה, כגון גילוי תרופות למחלת אלצהיימר. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאנו יכולים לבצע הזרקה ישירה של בטא A לאזור התוך מוחי של העכברים ללא עזרה של מכשירים סטריאוטקטיים, והיא מאפשרת לנו לחקות חריגות התנהגות דמויות אלצהיימר בעכברים מבלי לחכות לתהליך ההזדקנות.
ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול או אבחון של מחלת אלצהיימר, מכיוון שניתן להשתמש בה כדי לחקור את הפתולוגיה במורד הזרם של עמילואיד בטא, ולסנן מועמדים לתרופות. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו, מכיוון שמציאת המיקום המדויק של ברגמה על גולגולת של בעל חיים עשויה להיות קשה. כדי להתחיל בהליך זה, הכינו A-beta מילי-מולרית אחת עם DMSO.
לאחר מכן, יש לדלל אותו פי עשרה ב-PBS. לאחר מכן, הכינו תמיסת PBS המכילה 10% DMSO ככלי להזרקת ICV. לאחר מכן, עטפו את המיקרו-מזרק במחט נירוסטה בגודל 26 באמצעות רצועות Parafilm על מנת להתאים את אורך המחט להזרקה מבוקרת עומק.
עטפו בצפיפות את המזרק מספר פעמים כדי שהפרפילם לא יידחס במהלך החדרת המחט, ואורך המחט יישאר קבוע. לאחר מכן, חותכים את שכבות רצועות הפרפילם כדי להתאים את אורך המחט ל-3.8 מילימטרים בין קצה המחט לפרפילם. לאחר מכן, שטפו את המזרק פעמיים עם אתנול 70%.
לאחר מכן יש לשטוף את המזרק במים מזוקקים. יבש אותו לחלוטין במכסה אדים למשך 30 דקות לפחות, והשאיר את המזרק הנקי מתחת לאור UV למשך 20 דקות נוספות לפני ההזרקה. בשלב זה, הניחו עכבר מורדם בן שבעה שבועות על מחצלת חמה.
לאחר מכן, יש למרוח טיפות PBS סטריליות או משחה על שתי העיניים כדי למנוע יובש בקרנית במהלך ההליך. לאחר מכן, אשר הרדמה מספקת על ידי הערכת רפלקס הנסיגה של צביטת הבוהן. לאחר מכן, הכינו שתי מראות עם קווים אנכיים מרובים המצוירים על המשטחים כדי לספק הפניות להזרקה הניצבת של המזרק.
הניחו מראה אחת ממש ליד גוף העכבר, ואת השנייה מול הראש. שמור על M1 מקביל לקו האמצע הדמיוני בין שתי עיני העכבר וסדר את M2 בניצב ל-M1, כך ששני המישורים יוצרים זווית של 90 מעלות. לאחר מכן, רססו אתנול 70% על מצח העכבר, ושפשפו אותו עם צמר גפן יבש.
כדי לאתר את הברגמה, הניחו את האגודל והאצבע המורה ישירות מעל העיניים ולחצו מעט על המצח כלפי מטה עד ששתי העיניים בולטות. במקביל, גרור את עור המצח לאחור על מנת למזער את תנועת הגולגולת מתחתיו. אתר את מקום ההזרקה בעזרת סרט חייט בעומק של 2.4 מילימטרים מתחת לגולגולת.
מלאו את המזרק ב-10 מיקרוליטר של תמיסת A-beta או רכב. הנח את המזרק כך שיהיה בניצב למישור אתר ההזרקה. לאחר מכן, יישר את התמונות המשתקפות של המזרק בשתי המראות עם הקווים המצוירים על המראות.
התחל להחדיר את המחט עד שעטיפת הפרפילם נוגעת בעור. החזיקו את המזרק ביד אחת, והזריקו חמישה מיקרוליטרים של תמיסת ה-A-beta או הרכב ביד השנייה, לאט במשך חמש שניות ללא הפסקה, וודאו שהמזרק נשאר בניצב לכל אורכו. לאחר השלמת ההזרקה, המתן שלוש עד חמש שניות לפני הסרת המזרק.
הנח את האגודל והאצבע המורה בחזרה על הראש, והחזק אותו כלפי מטה כדי למנוע מהגולגולת תנועות מיותרות. ואז הסר את המזרק מבלי להטות. לאחר מכן, הנח את העכבר על כרית חמה להתאוששות.
כדי לוודא אם A-beta הוזרק לאזור ה-ICV היעד, בדוק את עקבות החדרת המחט לרקמת המוח כדי לראות אם היא הגיעה לאחד החדרים. אם ההזרקה לא הצליחה, אל תכלול את הנתונים של אותו נבדק מניתוח תוצאות הניסוי. בניסוי זה, נעשה שימוש בפפטיד A-beta באורך מלא של 42 חומצות אמינו לייצור תערובת של מונומרים A beta, אוליגומרים וסיבים.
באמצעות שלב המונומריזציה המושרה על ידי HFIP, התקבלו מונומרים הומוגניים יחסית. לאחר הדגירה של שבעה ימים, פותחו גדלים מגוונים של אגרגטים A-beta, שבהם טרימרים וטטרמרים היו המינים הדומיננטיים בין הצורות האוליגומריות של A-beta. במחקר זה, זיכרון עבודה מרחבי הוערך בעכברים שהוזרקו A-beta במבחן מבוך Y, שבו נרשמו רצף בחירות הזרוע ומספר כניסות הזרוע הכולל בזמן שכל עכבר הורשה לחקור בחופשיות את המבוך.
קבוצת העכברים שהוזרקו A-beta הראתה שיעורי חילופין נמוכים משמעותית, מה שמעיד על התפתחות של ליקויים קוגניטיביים. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך 20 דקות, כולל הליכי הרדמה, אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליכים אלה, חשוב לזכור להפוך את המחט לניצב למישור ההזרקה.
לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום גילוי תרופות למחלת אלצהיימר לחקור סינון in vivo של מועמדים לתרופות במודלים הנגישים הללו של מכרסמי אלצהיימר. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה כיצד לבצע הזרקה תוך מוחית ללא מכשירים סטריאוטקטיים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר הזרקה תוך-חדרית (intracerebroventricular) של Amyloid beta (Aβ) לעכברים בריאים ללא שימוש במכשירים סטריאוטקטיים. שיטה זו מאפשרת השראה חריפה של הפרעות התנהגותיות דמויות אלצהיימר, ובכך היא מסייעת למחקרים בביולוגיה של מערכת העצבים ולגילוי תרופות למחלת אלצהיימר.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- נוירוביולוגיה
- מחקר על מחלת אלצהיימר
רקע
- מודל בעל החיים המוזרק ב-Aβ מפחית את ההבדלים האינדיבידואליים בקבוצות המחקר.
- טכניקה זו מאפשרת הזרקה ישירה לאזור ה-intracerebroventricular.
- היא מדמה התנהגות דמוית אלצהיימר ללא צורך בהמתנה להזדקנות.
- איתור המיקום המדויק של ה-bregma עשוי להיות מאתגר עבור מתחילים.
מטרת המחקר
- להשראת הפרעות התנהגותיות דמויות אלצהיימר בעכברים רגילים.
- לחקר הפתולוגיה השלילית (downstream) של Amyloid beta.
- לסריקת מועמדים לתרופות פוטנציאליות למחלת אלצהיימר.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הזרקה תוך-חדרית (Intracerebroventricular) של Aβ.
- הכנת תמיסת Aβ בריכוז מילימולרי אחד עם DMSO.
- הערכה התנהגותית של הפרעות מושראות.
- בחינת השלכות לגילוי תרופות.
תוצאות עיקריות
- השראה מוצלחת של התנהגות דמוית אלצהיימר בעכברים.
- הוכחת היתכנות של השיטה ללא מכשירים סטריאוטקטיים.
- מתן תובנות לגבי הפתולוגיה של Amyloid beta.
- סיוע בסריקת מועמדים לתרופות.
מסקנות
- שיטה זו מהווה כלי בעל ערך למחקר על מחלת אלצהיימר.
- היא מאפשרת הערכה מהירה של שינויים התנהגותיים.
- עשויה להאיץ תהליכי גילוי תרופות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הזרקה תוך-חדרית תוך-מוחית (intracerebroventricular) חריפה של amyloid-β בעכברים בריאים מאפשרת מידול מהיר של ליקויים קוגניטיביים דמויי אלצהיימר, תוך עקיפת הצורך במודלים המבוססים על הזדקנות. גישה זו מספקת מערכת מבוקרת לבחינת פתולוגיה המונעת על ידי עמילואיד ולהערכת טיפולים פוטנציאליים in vivo. השיטה תומכת בתיקוף יעדים (target validation) בשלבים מוקדמים ומאיצה את קבלת ההחלטות הפרה-קליניות עבור פורטפוליוים של מחלת אלצהיימר.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בדיקה ישירה של הפתוגניות של amyloid-β והשפעות המשך בהקשר מבוקר in vivo.
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי בידוד amyloid-β כמשתנה הבלתי תלוי הגורם לליקויים קוגניטיביים.
- תומך בתיקוף תפקודי של מטרות עבור היפותזות טיפוליות ממוקדות-amyloid.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק מודל חיה הניתן לשחזור לצורך סריקה התנהגותית של תרכובות מועמדות המכוונות לפתולוגיה עמילואידית.
- מנstandardizes את השראת הגירעון הקוגניטיבי, ובכך תומך בפיתוח של בדיקות התנהגותיות כמותיות.
- מאפשר הערכה מהירה וניתנת להרחבה של יעילות התרכובות במערכת רלוונטית למחלה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתואם עם אסטרטגיות של ביומרקרים תרגומיים באמצעות מידול של ליקוי קוגניטיבי חריף הקשור לעומס עמילואיד.
- מגשר בין שלב הגילוי לוולידציה פרה-קלינית על ידי אספקת פלטפורמה להערכת יעילות in vivo.
- תומך בקידום מועמדים מותאם-סיכון בהתבסס על תוצאות התנהגותיות כמותיות.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
מודל זה משתלב ברצף שבין השלב המוקדם של הגילוי לשלב הפרה-קליני, ומאפשר בדיקה מונחית-השערות וזיהוי מובילים עבור תוכניות מחקר למחלת אלצהיימר.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות על מנגנוני amyloid-β והשפעות קוגניטיביות עקיפות.
- סריקה: מספקת תוצרי התנהגות סטנדרטיים וניתנים לשחזור לצורך הערכת תרכובות.
- אנליטיקה: מספקת מדידות כמותיות של ביצועים קוגניטיביים לצורך ניתוח השוואתי.
- מחקר טרנסלציונלי: מציעה רצף ממחקרים מכניסטיים לבחירת מועמדים פרה-קליניים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמת in vivo לשימוש חוזר עבור מחקר וסריקה מתמשכים של מחלת האלצהיימר.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בהתערבויות המכוונות לאמילואיד ומפחית עמימות מנגונית.
- ערך תפעולי: מייעל את הקמת המודל, משפר את השחזוריות ותומך בתהליכי סריקה ניתנים להרחבה.
- ערך אסטרטגי: משפר את איכות קבלת ההחלטות לגבי המשך או הפסקת פיתוח (go/no-go) ואת הקצאת ההון באמצעות אספקת נתוני יעילות מהירים in vivo.
- השפעה על פורטפוליו: מאפשר תעדוף מותאם סיכון של מועמדים לטיפול במחלת אלצהיימר בהתבסס על תוצאות תפקודיות.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות טכנית בהזרקה תוך-חדרית מדויקת (intracerebroventricular injection) ובהערכה התנהגותית.
- נדרשת גישה למתקני בעלי חיים, למכשור הזרקה ולתשתית לבדיקות התנהגותיות.
- נדרש סטנדרטיזציה קפדנית בין חברי הצוות לגבי עומק ההזרקה ופרוטוקולים התנהגותיים.
- ייתכן צורך בהתאמה עבור זני עכברים שונים או עבור תכנונים שונים של amyloid-β.
- מגבלות פוטנציאליות כוללות שונות טכנית בדיוק ההזרקה וברגישות הבדיקה ההתנהגותית.
