כימות של גרורות סרטן השחלות תוך הצפק

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לקבוע את נטל הגידול היחסי של גרורות סרטן שחלות תוך-צפקי במודל עכברי קסנוגרפט אורתוטופי סינגני. שיטה חדשנית זו להדמיה וכימות של עומס הגידול היחסי יכולה לעזור לנו לענות על שאלות מפתח בוויסות גרורות סרטן השחלות. היתרון המהותי של טכניקה זו הוא שעל ידי ביטול ערבוב של ספקטרום פלואורסצנטי, פלואורסצנציה אוטומטית של רקמות מוסרת מהתמונות, ומאפשרת מדידה של עומס גידול סטנדרטי ויחסי.

טכניקה זו מעניקה תובנות בגרורות סרטן השחלות האנושיות עם השלכות על ניטור יעילות הטיפולים. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שאנו משלבים טכניקת הדמיה חזקה עם הליך אנליטי לחילוץ נתונים כמותיים מהתמונות. מי שידגים את ההליך היום יהיה יואיינג ליו, מנהל תוכנית המעבדה של מעבדת הסטאק.

לאחר 10 שבועות של צמיחת תאי גידול, הנח את גופו של כל עכבר מורדם למערכת הדמיה אופטית של בעלי חיים קטנים, אחד בכל פעם. סרוק את כל העכברים בקבוצה בכל נקודת זמן. כדי לצפות בתאי גידול המסומנים פלואורסצנטית, בצע רכישה רב-ספקטרלית כדי לאסוף בסך הכל חמש תמונות.

בחר חשיפה סטנדרטית של 15 שניות, שתיים על שתיים, שדה ראייה של 16 סנטימטרים ועצירת F של 1.1. לאחר מכן, רכשו תמונת השתקפות של החיה כולה באמצעות אור לבן ממסנן עירור פתוח, מסנן פליטה פתוח, חשיפה סטנדרטית של 0.2 שניות עם שניים על שניים, ושדה ראייה של 16 סנטימטרים, עם עצירת F של 2.8. לאחר המתת חסד, השתמש במספריים לדיסקציה מחודדת כדי לחתוך את העור מלפנים לאורך קו האמצע הגחוני של העכבר, מהחלק העליון של הירכיים ועד לתחתית כלוב הצלעות.

הפרד בעדינות את העור מרקמת הצפק, הקפד לא לנקב את דופן הצפק. לאחר מכן חותכים לרוחב, הן לאורך החלק התחתון של כלוב הצלעות, והן בחלק העליון של הירכיים, ליצירת שני דשי עור. הנח את העכבר על צדו הגחוני בסורק, כך שחלל הצפק פונה כלפי מטה כאשר דשי העור פתוחים.

סרוק את העכבר עם איבריו באתרו, באמצעות אותם פרמטרים ששימשו בעבר עבור העכבר החי. כעת, המשיכו לנתח את העכבר על ידי חילוץ הכבד, האומנטום, הלבלב, הקיבה, הסרעפת והמעי הדק והגס בטכניקות סטנדרטיות. כמו כן, הסר את הצפק השמאלי והימני, השחלות, הכליות, המזנטריה ולבסוף, את כרית השומן.

התבונן, ספר ורשום כל אחד מהגידולים הנראים לעין על האיברים. השתמש בקליפר כדי למדוד את הקוטר של כל גידול. ייעד גידולים בקוטר של פחות משני מילימטרים כקטנים, בין שניים לחמישה מילימטרים כבינוניים וגדולים מחמישה מילימטרים.

לאחר מכן, הניחו את האיברים על תבנית סריקת האיברים, שנמצאת באיור 4 של פרוטוקול הטקסט הנלווה, והשתמשו בה כדי לארגן את המיקום של כל איבר במהלך הסריקה הבאה. השתמשו ב-PBS כדי לשמור על לחות האיברים. סרוק כל גיליון איברים באמצעות מערכת ההדמיה האופטית של בעלי חיים קטנים והפרמטרים ששימשו בעבר.

לאחר הסריקה, הניחו את האיברים בפורמלדהיד 10%, ועבדו אותם להיסטולוגיה בטכניקות סטנדרטיות. על מנת להפחית את כמות הקרינה האוטומטית בכל סריקה מולטי-ספקטרלית, טען תחילה את החלבון הפלואורסצנטי האדום בקובץ ספקטרלי vivo ואחריו את הרצפה האוטומטית בקובץ האדום in vivo בחלון התמונות הלא מעורבות, ובחר בביטול ערבוב. לאחר מכן ייצא את קבצי ה-dot bip בפורמט dot tif ללא קנה מידה של 16 סיביות, וטען אותם לתמונה J, על ידי מעבר לקובץ, פתיחה ולאחר מכן בחירת קובץ ה-tif הנכון של 16 סיביות.

לאחר מכן, עבור לתפריט התמונה, ובחר התאמה, ואז ניגודיות בהירות, והגדר את הערך המינימלי המוצג לאפס, ואת הערך המקסימלי המוצג לפלוס 35353. לאחר מכן, תחת תפריט תמונה, עבור לחפש טבלאות ובחר אדום חם. מודלים שונים של בעלי חיים ידרשו רמות בהירות שונות, אך חשוב לשמור על עקביות הבהירות לאורך מחקר נתון.

בעזרת הכלי בחירה ביד חופשית, ציירו אזור עניין חופשי סביב כל עוגב. יש להתקרב לגבולות העוגב. לאחר מכן, הקלד control ו- M כדי להשתמש בכלי המדידה לחישוב שטח הפנים של כל איבר.

רשום נתונים אלה בגיליון אלקטרוני. עם אזור העניין שצויר סביב כל עוגב, לחץ לחיצה ימנית ובחר שכפל כדי לכלול רק את העוגב. לאחר מכן, תחת תמונה, עבור להתאמה, ואז סף, והגדר את רמת הסף התחתונה לפלוס 1, 200 ואת רמת הסף העליונה לפלוס 1, 700.

כמו כן, בדוק את הרקע הכהה ולאחר מכן בחר אישור. פעולה זו תבחר רק את האזורים הזוהרים ביותר. התמונות עשויות לדרוש מניפולציה ידנית של מחווני הסף בתמונה J כך שהאזורים הבהירים ביותר ייבחרו בעבר עבור שלב הניתוח, כפי שמוצג לעיל.

מודלים שונים של מחלות ידרשו אילוצי סף שונים, אך חשוב לשמור על רמות הסף עקביות לאורך מחקר נתון. תחת ניתוח, בחר נתח חלקיקים ושנה את גודל הפיקסל בריבוע מ- 10 לאינסוף. בחר להציג קווי מתאר וסמן אם לבחור רק הצג תוצאות ולאחר מכן לחץ על אישור.

זה ימדוד הן את האזורים והן את הצפיפות המשולבת הגולמית של האזורים הבהירים הנחשבים לגידולים. רשום את ערכי שטח הפנים ואת הצפיפות המשולבת הגולמית של כל בחירת גידול יחד באותו גיליון מפוזר המכיל את שטחי הפנים של האיברים. לאחר מכן, תחת ניתוח, בחר כלים ועבור אל סרגל הכיול.

הוסף סרגל קנה מידה של כיול לתמונות של האיברים. מונטאז'ים יכולים להכיל מספר גדול יותר או קטן יותר של איברים כפי שמוכתב על ידי מחקר נתון. לאחר מכן, תחת קובץ, עבור אל שמור בשם, ושמור את המונטאז' גם כנקודה tif וגם כנקודה jpeg.

לאחר מכן, פתח את קובץ ה-jpeg הנקודה של האיברים, ועבור לתפריט הוספה כדי להוסיף תיבת טקסט לכל תמונה. הוסף/י תוויות עוגב על-ידי יצירת תיבת מלל מתחת לכל אחת משלוש שורות האיברים. פתח כל אחד מקבצי ה-tif של 16 סיביות של סריקות הגוף המלא לתמונה J לפי סדר מספר העכבר.

לאחר מכן, עבור לתפריט התמונה ובחר התאם ולאחר מכן ניגודיות בהירות. הגדר את הערך המינימלי המוצג לאפס ואת הערך המרבי המוצג לפלוס 35353. לאחר מכן, חזור לתפריט התמונה, וכדי לחפש טבלאות, ולאחר מכן בחר אדום חם.

לאחר השלמת הפעולה, שמור את המונטאז' גם כקובץ dot tif וגם כקובץ dot jpeg. קו תאי סרטן השחלות של עכברים ID8 המוזרק לעכברים 10 שבועות לפני ההדמיה זוהר בתעלה האדומה, וממשיך לעשות זאת לאורך כל הגדילה. הדמיה חיה באמצעות מערכת הדמיה אופטית של בעלי חיים קטנים מסוגלת להציג את תאי ה-ID8 המתרחבים בעכבר ומספקת גישה מדויקת יותר מאשר פשוט לשקול את העכבר על מנת להעריך את עומס הגידול.

לאחר המתת חסד והסרת שכבת העור הגחונית, ניתן לראות את האיברים השלמים ביתר פירוט. עם זאת, איברים בודדים המונחים על תבנית סריקת האיברים מציגים בבירור את עומס הגידול בכל איבר. עומס הגידול באומנטום ובלבלב, בשחלות ובמזנטריה של העכבר המוצג משמאל גדול בהרבה מאותם איברים בעכבר המוצגים מימין.

התצפית על עומס הגידול הדיפרנציאלי מאושרת כמותית הן מבחינת אזור שירות הגידול והן מבחינת עוצמת אות הגידול. לאחר שליטה, ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לדמות עד 18 עכברים חיים בשעה. דיסקציה והדמיה ex vivo של איברים בודדים אורכת כ-20 דקות לכל דגימה.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו תהודה מגנטית כמותית על מנת לטפל בהשערות כגון השפעת השמנת יתר על גרורות סרטן השחלות, כפי שמוצג במאמר מחקר הסרטן שלנו משנת 2015.