זיהוי של Metal Oxide חלקיקים בדגימות היסטולוגית על ידי מיפוי darkfield מיקרוסקופית והיפרספקטרליות משופרים

המטרה הכוללת של הליך זה היא לזהות ננו-חלקיקי תחמוצת מתכת בדגימות היסטולוגיות על ידי מיקרוסקופ שדה כהה ומיפוי היפר-ספקטרלי. זה מושג על ידי זיהוי אזור עניין בדגימת בקרה חיובית המכילה ננו-חלקיקים ולכידת תמונת שדה כהה. השלב השני הוא יצירת תמונה היפרספקטרלית או קוביית נתונים של אזור העניין באמצעות המצלמה ההיפרספקטרלית.

לאחר מכן, נוצרת ספריית ייחוס ספקטרלית מקוביית נתוני הבקרה החיובית, המסוננת כנגד בקרה שלילית כדי להסיר תוצאות חיוביות מוטעות. השלב האחרון הוא להשתמש בספריית הייחוס הספקטרלית כדי למפות מול דגימות ניסיוניות כדי לזהות ולאתר ננו-חלקיקים מאותו הרכב. בסופו של דבר, מיקרוסקופ שדה כהה משופר ומיפוי היפר-ספקטרלי משמשים לזיהוי ננו-חלקיקי תחמוצת מתכת בדגימות היסטולוגיות בצורה מהירה יותר ופחות עתירת משאבים מאשר טכניקות אחרות כגון מיקרוסקופ אלקטרונים.

שיטה זו מציעה מספר יתרונות על פני טכניקות הדמיה ואפיון ננו-חומרים קונבנציונליות, כגון מיקרוסקופ אלקטרונים. בדוגמה זו הכנת הדגימה היא בדרך כלל מינימלית ולא הרסנית. רכישת וניתוח תמונות דורשת פחות זמן ועלות, וניתן ליישם אותה להדמיית ננו-חלקיקים במגוון מטריצות.

אנשים ידעו שהמתודולה לפעמים מתקשים מכיוון שיצירת דגימות הבקרה החיוביות המתאימות וספריות ספקטרליות ייחוס היא מאתגרת וגוזלת זמן. אך לאחר השלמת השלבים הראשוניים הללו, ניתן להעריך דגימות ניסוי די מהר. בעוד ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי חדירה עורית של ננו-חלקיקים, ניתן ליישם אותה גם על דגימות ביולוגיות אחרות כגון שטיפת סימפונות ומריחות דם, כמו גם דגימות לא ביולוגיות, כגון מסננים המשמשים בהערכות חשיפה תעסוקתית.

הטכניקה הזו פלאר סוסה, סטודנטית לרפואה מהמעבדה שלי התחל בחיבור והדלקה של מקור האור, בקר הבמה, המצלמה האופטית, המצלמה ההיפרספקטרלית ומערכת המחשב. לאחר מכן הרם את ה-stage והמעבה למצב ההפעלה ומרח בזהירות שלוש עד חמש טיפות של שמן טבילה מסוג A על עדשת הקבל. אם נוצרות בועות כלשהן, נגב את השמן ומרח אותו מחדש על העדשה.

לאחר מכן, מקם את הדגימה על הבמה והרם לאט את המעבה עד ששמן הטבילה יוצר מגע עם הצד התחתון של המגלשה. זה יהיה מורגש דרך טבעת התאורה המתבהרת במהירות שבה השמן יוצר מגע עם המגלשה. כשהמעבה במקומו, עבור למטרה של 10 x ולאחר מכן התמקד ויישר את הקבל כדי למקסם את הבהירות במידת הצורך, כוונן את כפתורי יישור המעבה כדי למרכז את הנקודה הבהירה.

פתח את תוכנת ההדמיה האופטית. מקד את הדגימה באמצעות כפתור המיקוד האובייקטיבי העדין. לאחר מכן מצא אזור מעניין.

כוונן את מיקוד המעבה לפי הצורך כדי לאזן את התאורה. לחץ על לשונית ההגדרות בשורת התפריטים ולחץ על כפתור לכידת תמונה. לאירוע לכידה.

בחר את פורמט התמונה הרצוי והקצה שם קובץ לתמונה. בנוסף, בחר את ערך ברירת המחדל של זמן-lapse ולבסוף לחץ על אישור. לאחר מכן, עבור לתפריט החשיפה ובחר את הגדרות החשיפה היוצרות את התמונה בעלת הניגודיות הגבוהה ביותר.

כאן, הרמה מוגדרת ל-0.0%הרווח מוגדר ל-2.8 דציבלים ומהירות התריס מוגדרת ל-56 אלפיות השנייה. צלמו את התמונה על ידי לחיצה על לחצן התמונה בשורת התפריטים. שנה את המטרה ל- 40 x ו- 100 x.

לכידת תמונות בהגדלות גבוהות יותר, ודא שמוביל האור מופנה למצלמה ההיפרספקטרלית, ולאחר מכן פתח את תוכנת ההדמיה ההיפרספקטרלית לרכישת קוביות הנתונים HSI בתוכנה פתח את המיקרוסקופ ההיפרספקטרלי בשורת התפריטים ובחר בקרות מיקרוסקופ HSI. כאן הגדר את ההגדלה האובייקטיבית ואת הנתיב הבטוח. לאחר מכן, שנה את לכידת השטח בהגדרות, ושנה את מספר השורות.

במחקר זה השתמשנו ב-720 להגדיר את זמן החשיפה. כאן השתמשנו ב-0.25 שניות. השאר השאר כברירת מחדל ולחץ על תצוגה מקדימה HSI כדי להציג את התמונה.

התבונן בגרף העוצמה המתקבל המייצג את עוצמת אורך הגל הגבוה ביותר כאשר המשתמש נע על פני ציר ה-x של מרכז השדה של המצלמה. הזז את הסמן כדי ליצור קו מתאר מדויק של התרשים. זה יגרום למחוון עוצמה מספרי להופיע בצד שמאל.

מקד את התמונה על סמך תצוגה מקדימה זו על ידי התאמת מיקוד המטרה העדין כדי לחדד את הפסגות בתמונה זו. לאחר מכן, בצע אופטימיזציה של עוצמת האור על ידי התאמת בהירות המקור, מיקוד מעבה, או בטל את התצוגה המקדימה והתאם את זמן החשיפה בתוכנה. לחץ על לכידה וצפה בארבעה חלונות חדשים עם השמות הזמינים.

רשימת להקות. זום מספר אחת. מספר אחד, גלילה ופס RGB מספר אחד מופיעים.

הגדל את חלון רצועת ה-RGB מספר אחת מכיוון שזו קוביית הנתונים, שתשמש לכל ההפניות העתידיות. ימין? לחץ על קוביית נתונים זו, שמור אותה כקובץ tiff ולחץ על אישור. לחץ לחיצה ימנית בחלון תמונת קוביית הנתונים ושמאל לחץ על ספקטרום פרופיל Z.

כאשר חלון הפרופיל הספקטרלי המוקפץ מופיע משמאל, לחץ על הפיקסלים המעניינים ביעד קוביית הנתונים. המבריקים ביותר הם אלה שניתן לזהות בביטחון כמייצגים את החומר המעניין. בתפריט ניתוח החלקיקים, בחר בכלי סינון החלקיקים כדי לזהות חלקיקים הנמצאים בקוביית הנתונים.

בערכת החלון המוקפץ החדשה, המקסימום הספקטרלי חייב לחרוג מהערך, ולכן הוא גבוה מפיקסלים ברקע, אך נמוך מהחומרים המעניינים. הנתונים התקפים המקסימליים הם 16,000. בחלון הכלי לסקירת מסנן חלקיקים, לחץ על בחר הכל.

לאחר מכן לחץ על ייצוא לספרייה ספקטרלית והקצה את השם לספרייה הספקטרלית שלך. לאחר בחירת דגימה שתשמש כבקרה שלילית, השג מספר קוביות נתונים מהדגימה. באמצעות המצלמה ההיפרספקטרלית נדרשת לפחות אחת, אך ניתן לצלם יותר.

כדי להגביר את הסלקטיביות כאשר קוביית נתוני הבקרה השלילית פתוחה, לחץ על סנן ספריה ספקטרלית תחת תפריט הניתוח הממוקם בסרגל הכלים הראשי של התוכנית, לחץ על פתח קובץ חדש ובחר את הספריה הספקטרלית שנוצרה בעבר עבור הפקד החיובי כקובץ הקלט, לחץ על אישור. בחלון הספרייה הספקטרלית של מסנן cyto viva. לחץ על התמונה ובחר את שם קובץ הפלט עבור הספרייה הספקטרלית של ההתייחסות, ולחץ על אישור.

לאחר מכן, לחץ על שם הקובץ של קוביית נתוני הבקרה השלילית שלך כתמונת מקור. התוכנה תנתח את הספרייה הספקטרלית ותסיר כל ספקטרום התואם לכל ספקטרום של קוביית נתוני הבקרה השלילית. השג קוביות נתונים מדגימות הניסוי כשקוביית הנתונים הניסיונית פתוחה.

לחץ על התפריט הספקטרלי בתפריט המשנה שיטות מיפוי פתח את ממפה הזווית הספקטרלית. בחר את שם קוביית הנתונים הניסיונית בחלון המוקפץ ולחץ על אישור. אם לא מופיעים שמות קבצים, לחץ על פתח קובץ חדש ובחר בקוביית הנתונים הניסיונית.

לאחר מכן לחץ על אישור בחלון המוקפץ שנקרא אוסף חבר קצה, SAM, לחץ על ייבוא בשורת התפריטים. לאחר מכן בחר מתוך קובץ הספרייה הספקטרלית. פתח את ספריית ההפניות הספקטרלית שנוצרה קודם לכן ולחץ על OK.

בחלון המוקפץ החדש שנקרא ספריית קלט ספקטרלית, לחץ על בחר את כל הפריטים, לחץ על אישור. לאחר מכן לחץ לחיצה ימנית על צבע ובחר. החל צבעי ברירת מחדל על הכל לחץ על בחר הכל ולאחר מכן החל, ולאחר מכן בחר את שם קובץ הפלט ולחץ על אישור.

פתח את תפריט שכבת-העל בחלון קוביית הנתונים ובחר סיווג. לאחר מכן נווט אל שם קובץ הפלט ולחץ על אישור. בתפריט חלון כלי הכיתה האינטראקטיבי, פתח את תפריט האפשרויות ובחר את מחלקות המיזוג כדי ליצור ערכת צבעים אחידה.

על מנת להקל על ניתוח הנתונים באמצעות תוכנות אחרות, בחר ספקטרום יחיד מרשימת מחלקות הבסיס. לאחר מכן בחר את כל המחלקות למעט לא מסווג כדי להתמזג לבסיס. לאחר מכן לחץ על אישור.

לאחר מכן, לחץ על צבע הבסיס שנבחר וכל הספקטרום התואם יוצג בצבע זה. כדי לקבל תמונה אמאטית שתציג את הספקטרום התואם על רקע שחור, לחץ על תיבת הצבעים הלא מסווגים, שהיא שחורה כברירת מחדל, היתרון המשמעותי ביותר של הטכניקה הוא יכולתה לזהות ננו-חלקיקי תחמוצת מתכת בדגימות היסטולוגיות על ידי מיקרוסקופ שדה כהה ומיפוי היפרספקטרלי. תמונות אלה מדגימות תהליך זה באמצעות דגימות עור היסטולוגיות.

בעוד שחלקיקים מסוימים ברורים בקלות בשדה האפל, תמונה אופטית, חלקיקים נוספים מתגלים באמצעות הדמיה היפרספקטרלית. מוצגת כאן רקמת עור חזירית בשכבת האפידרמיס, שנחשפה לננו-חלקיקי אילומינה. מקבץ ננו-חלקיקים בעל ניגודיות גבוהה נמצא מופקד מעל שכבת הקרנית בשכבת העור, שנחשפה לננו-חלקיקי סיליקה.

ניתן לראות ננו-חלקיקים מרובים בעלי ניגודיות גבוהה מופקדים על רקמת החיבור. לבסוף, ברקמה התת עורית, שנחשפה לננו-חלקיקים הסוריים. ניתן לראות מספר ננו-חלקיקים מפוזרים בעלי ניגודיות גבוהה מופקדים לאורך זיהוי ננו-חלקיקי השומן בשיטה זו.

בדגימות רקמה אחרות כגון ריאות, כבד, טחול, כליות ובלוטות לימפה אפשרי. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע ניתוח תמונה על מנת לענות על שאלות נוספות כגון ספירת החלקיקים ומיקום החלקיקים. יש לשקול שיקולים וחסרונות מסוימים כגון הצורך בבקרות מיוחדות ביותר והמגבלות על הרזולוציה של הדמיה פוטונית עם אלה של שיטות קונבנציונליות.

בעת בחירת הטכניקות האנליטיות המתאימות ביותר לחקירת שאלות מחקר ספציפיות, בחרנו להדגים את היישום הספציפי הזה מכיוון שיש לו פוטנציאל להשלים את מחקר הננוטוקסיקולוגיה הנוכחי והעתידי. זה יכול גם ליידע מחקר לגבי ספיגה, הפצה, חילוף חומרים והפרשה של ננו-חלקיקים בכל איברים ורקמות.