Name: זיהוי של Metal Oxide חלקיקים בדגימות היסטולוגית על ידי מיפוי darkfield מיקרוסקופית והיפרספקטרליות משופרים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: למד לזהות חלקיקי Metal Oxide בדגימות היסטולוגיות באמצעות מיקרוסקופיית darkfield משופרת ומיפוי היפרספקטרלי. שיטה זו מאפשרת זיהוי מהיר ומדויק של ננו-חלקיקים בביולוגיה ובנוירומדיצינה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים לגינטר אוברדורסטר, ד"ר לרפואה ולאליסון אלדר, דוקטורט (אוניברסיטת רוצ'סטר) ולמרי פריים, דוקטורט (אוניברסיטת סטוני ברוק) על שיתופי פעולה במחקר בבעלי חיים שהביאו לדגימות רקמה לניתוח. בנוסף, המחברים מודים: כריסטינה רוטונדי (Albany Medical College Histology Core); רני סלרס, DVM, PhD וברברה קנלה, PhD (מתקן היסטולוגיה ופתולוגיה השוואתית של מכללת אלברט איינשטיין לרפואה); לאונרדו בזרה ואחלם אבו-עוואד (חברי צוות המחקר של ברנר); ולזלי קראוס, ביירון צ'יטהאם ואליזה ג'ונסון (CytoViva). עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענק CDC-NIOSH OH-009990-01A1 ומרכז NanoHealth and Safety במדינת ניו יורק, שהוענק ל-S.B.

<ol><li>Sun, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytosis+of+a+single+mesoporous+silica+nanoparticle+into+a+human+lung+cancer+cell+observed+by+differential+interference+contrast+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Bioanal+Che%22%5BJournal%5D)">Endocytosis of a single mesoporous silica nanoparticle into a human lung cancer cell observed by differential interference contrast microscopy.</a> Anal Bioanal Che. 391 (6), 2119-2125 (2008).</li>
<li>Anselme, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interaction+of+cells+and+bacteria+with+surfaces+structured+at+the+nanometre+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomate%22%5BJournal%5D)">The interaction of cells and bacteria with surfaces structured at the nanometre scale.</a> Acta Biomate. 6 (10), 3824-3846 (2010).</li>
<li>Anshup, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+gold+nanoparticles+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Langmui%22%5BJournal%5D)">Growth of gold nanoparticles in human cells.</a> Langmui. 21 (25), 11562-11567 (2005).</li>
<li>Weinkauf, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+dark+field+microscopy+for+rapid+artifact+free+detection+of+nanoparticle+binding+to+Candida+albicans+cells+and+hyphae%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Enhanced dark field microscopy for rapid artifact free detection of nanoparticle binding to Candida albicans cells and hyphae.</a> Biotechnol. 4 (6), 871-879 (2009).</li>
<li>Sondi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silver+nanoparticles+as+antimicrobial+agent%3A+a+case+study+on+E+coli+as+a+model+for+Gram+negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Colloid+Interface+Sc%22%5BJournal%5D)">Silver nanoparticles as antimicrobial agent: a case study on E coli as a model for Gram negative bacteria.</a> J Colloid Interface Sc. 275 (1), 177-182 (2004).</li>
<li>Berry, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Possible+exploitation+of+magnetic+nanoparticle+cell+interaction+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mater+Chem%22%5BJournal%5D)">Possible exploitation of magnetic nanoparticle cell interaction for biomedical applications.</a> J Mater Chem. 15 (5), 543-547 (2005).</li>
<li>Chithrani, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidating+the+mechanism+of+cellular+uptake+and+removal+of+protein+coated+gold+nanoparticles+of+different+sizes+and+shapes%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Elucidating the mechanism of cellular uptake and removal of protein coated gold nanoparticles of different sizes and shapes.</a> Nano Lett. 7 (6), 1542-1550 (2007).</li>
<li>Chithrani, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+the+size+and+shape+dependence+of+gold+nanoparticle+uptake+into+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Determining the size and shape dependence of gold nanoparticle uptake into mammalian cells.</a> Nano Lett. 6 (4), 662-668 (2006).</li>
<li>Elechiguerra, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+silver+nanoparticles+with+HIV+1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nanobiotechnol%22%5BJournal%5D)">Interaction of silver nanoparticles with HIV 1.</a> J Nanobiotechnol. 3 (6), 1-10 (2005).</li>
<li>Carlson, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+cellular+interaction+of+silver+nanoparticles+size+dependent+generation+of+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem%22%5BJournal%5D)">Unique cellular interaction of silver nanoparticles size dependent generation of reactive oxygen species.</a> J Phys Chem. 112 (43), 13608-13619 (2008).</li>
<li>Roth, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperspectral+microscopy+as+an+analytical+tool+for+nanomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22WIREs+Nanomed+Nanobiotechnol+In+Press%22%5BJournal%5D)">Hyperspectral microscopy as an analytical tool for nanomaterials.</a> WIREs Nanomed Nanobiotechnol In Press. , (2015).</li>
<li>Williams, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maize+kernel+hardness+classification+by+near+infrared+%28NIR%29+hyperspectral+imaging+and+multivariate+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chim+Act%22%5BJournal%5D)">Maize kernel hardness classification by near infrared (NIR) hyperspectral imaging and multivariate data analysis.</a> Anal Chim Act. 653 (2), 121-130 (2009).</li>
<li>Ziph Schatzberg, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperspectral+imaging+enables+industrial+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Industrial+Photonic%22%5BJournal%5D)">Hyperspectral imaging enables industrial applications.</a> Industrial Photonic. , (2014).</li>
<li>Sun, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSun%2C+DW+%22Hyperspectral+imaging+for+food+quality+analysis+and+contro%22">Hyperspectral imaging for food quality analysis and contro</a>. , Elsevier. (2010).</li>
<li>ElMasry, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperspectral+imaging+for+nondestructive+determination+of+some+quality+attributes+for+strawberry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Food+En%22%5BJournal%5D)">Hyperspectral imaging for nondestructive determination of some quality attributes for strawberry.</a> J Food En. 81 (1), 98-107 (2007).</li>
<li>Mortimer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+of+hyperspectral+imaging+microscopy+for+semi+quantitative+analysis+of+nanoparticle+uptake+by+protozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Sci+Techno%22%5BJournal%5D)">Potential of hyperspectral imaging microscopy for semi quantitative analysis of nanoparticle uptake by protozoa.</a> Environ Sci Techno. 48, 8760-8767 (2014).</li>
<li>Sarlo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+distribution+of+20+nm+100+nm+and+1000+nm+fluorescent+polystyrene+latex+nanospheres+following+acute+systemic+or+acute+and+repeat+airway+exposure+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Toxico%22%5BJournal%5D)">Tissue distribution of 20 nm 100 nm and 1000 nm fluorescent polystyrene latex nanospheres following acute systemic or acute and repeat airway exposure in the rat.</a> Toxico. 263, 117-126 (2009).</li>
<li>Husain, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+instillation+of+low+doses+of+titanium+dioxide+nanoparticles+in+mice+leads+to+particle+retention+and+gene+expression+changes+in+the+absence+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Appl+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Pulmonary instillation of low doses of titanium dioxide nanoparticles in mice leads to particle retention and gene expression changes in the absence of inflammation.</a> Toxicol Appl Pharmacol. 269, 250-262 (2013).</li>
<li>Meyer, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+uptake+and+associated+toxicity+of+silver+nanoparticles+in+Caenorhabditis+elegan%5BTitle%5D)+AND+%22Aquatic+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Intracellular uptake and associated toxicity of silver nanoparticles in Caenorhabditis elegan.</a> Aquatic Toxicol. 100, 140-150 (2010).</li>
<li>Badireddy, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((characterization+and+abundance+of+engineered+nanoparticles+in+complex+waters+by+hyperspectral+imagery+with+enhanced+darkfield+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Sci+Technol%22%5BJournal%5D)">characterization and abundance of engineered nanoparticles in complex waters by hyperspectral imagery with enhanced darkfield microscopy.</a> Environ Sci Technol. 46 (18), 10081-10088 (2012).</li>
<li>Dettmeyer, R. F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDettmeyer%2C+RF+%22Staining+techniques+and+microscopy+Forensic+histopathology+fundamentals+and+perspectives%22">Staining techniques and microscopy Forensic histopathology fundamentals and perspectives</a>. , Springer Verlag. Berlin Heidelberg. vol 26 issue 453 370 (2011).</li>
<li>Titford, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+the+development+of+microscopical+techniques+for+diagnostic+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histotechnol%22%5BJournal%5D)">Progress in the development of microscopical techniques for diagnostic pathology.</a> J Histotechnol. 32 (1), 9-19 (2009).</li>
<li>Kumar, G. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKumar%2C+GL+%22Special+stains+and+H%26E%22">Special stains and H&E</a>. , Dako North America. Carpinteria, California. (2014).</li>
<li>Manolakis, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperspectral+image+processing+for+automatic+target+detection+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Lincoln+Laboratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Hyperspectral image processing for automatic target detection applications.</a> Lincoln Laboratory Journal. 14 (1), 79-116 (2003).</li>
<li>Mercer, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+fibrotic+response+to+aspiration+of+multi+walled+carbon+nanotubes%5BTitle%5D)+AND+%22Part+Fibre+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Pulmonary fibrotic response to aspiration of multi walled carbon nanotubes.</a> Part Fibre Toxicol. 8 (1), 21(2011).</li>
<li>Kim, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperspectral+reflectance+and+fluorescence+imaging+system+for+food+quality+and+safety%5BTitle%5D)+AND+%22T+Am+Soc+Ag+En%22%5BJournal%5D)">Hyperspectral reflectance and fluorescence imaging system for food quality and safety.</a> T Am Soc Ag En. 44 (3), 721-730 (2001).</li>
<li>Mercer, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrapulmonary+transport+of+MWCNT+following+inhalation+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Part+Fibre+Toxico%22%5BJournal%5D)">Extrapulmonary transport of MWCNT following inhalation exposure.</a> Part Fibre Toxico. 10 (1), 38(2013).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

ליכולים להיות מושגת על דגימות רקמה שעברו צביעה היסטולוגית קונבנציונלית, זיהוי וניתוח של חלקיקי תחמוצת מתכת באמצעות שילוב של EDFM, מיפוי HSI, וטכניקות ניתוח תמונה. אמנם יש גמישות בהכנת מדגם להיסטולוגיה או אימונוהיסטוכימיה (למשל, באמצעות רקמות קבועות או קפוא; סוג של כתם), חשובה שהדגימות הם מחולק לעובי של 5-10 מיקרומטר להדמיה אופטימלית. דוגמאות משמשות כאן היו קבוע פורמלין ולפני חתך עם microtome סיבובי עד 6 מיקרומטר עובי מוטבע פרפין, רכוב על שקופיות מיקרוסקופ הזכוכית, מוכתם hematoxylin ו eosin וcoverslipped. רקמות עור חזיריות משיתוף הפעולה טוקסיקולוגיה החדירה עורית vivo לשעבר שמשו למחקר זה. הרקמות נחשפו לחלקיקי תחמוצת מתכת (אלומינה, סיליקה, ceria) במתלים מימיים. איתור של האזור (ים) של עניין (eleme ניגודיות גבוההNTS) עם EDFM הוא צעד ראשון קריטי המאפשר מיפוי HSI לאחר מכן וניתוח. דגימות בקרה חיוביות ושליליות חייבים להיות צילמו וניתחו ראשון כדי ליצור ספריית רפאים להתייחסות. הספקטרום שנאסף מהביקורת החיובית מיוצא לספריית רפאים ביקורת חיובית. לאחר מכן, כל הספקטרום מתמונות השליטה השליליות מופחתים ספריית הרפאים של הבקרה החיובית על מנת לשפר את הספציפיות (להפחית חיוביים שגוי). ספריית רפאים המסוננת וכתוצאה מכך נחשבת RSL המשמש לניתוח חומרים של עניין. כל דגימות הרקמה לעבור את אותו תהליך ההדמיה וממופות נגד RSL. התמונה המתקבלת תכיל אזורים רק עם אלמנטים של עניין על רקע שחור. תמונה זו אז יכולה להיות מנותחת עם ImageJ באמצעות פונקציות הסף וניתוח חלקיקים שלה כדי לקבל את השטח של חלקיקים ממופים לשדה הראייה. נתונים מספריים המתקבלים מImageJ יכולים להיות יצואאד לגיליון אלקטרוני לניתוח נוסף. חשוב לקחת בחשבון כי כדגימות ביולוגיות הן שונות בהמהות מזה, ושיטות צביעה עשויות להשפיע להדמיה באמצעות EDFM וHSI, צריכה להיקבע הגדרות החשיפה בהתאם למה שמייצר את תמונת ניגודיות גבוהה הטובה ביותר עבור סוג מסוים של מדגם. למרות ירידה של תוצאות חיוביות שגויות יכולה להיות מושגת באמצעות הסינון של ספריות רפאים, זה הוא חיוני כדי להשיג פקדים שליליים אמינות שנמנעו זיהום עם האלמנט של עניין, כפי שהספקטרום המתאים לזיהום זה עלול להיות מסונן מספריית הרפאים של הבקרה החיובית , הגדלת שיעורים שליליים כוזבים. כמו כן, מגוון עוצמת הספקטרום שניתן לזהות עם תוכנת הדמיה היפרספקטראלית לא יכול לעלות את המגבלה של תוכנה המסוימת (לצורך מחקר זה, שהוא 16,000 יחידות): אזורים עם מספר גבוה של חלקיקים שנצברו המייצרים spעוצמות ectral מעל גבול עוצמת נותרות מחוץ לספריית הרפאים, בשל הסיכון של הגדלת מספר שלילית שווא. בעוד מערכת HSI מקנה יתרונות רבים על פני שיטות מסורתיות, יש כמה חסרונות ומגבלות לשקול. הוא אחד שהכמות הגדולה של נתונים שנאספו אופטיים עשויים לדרוש כוח מחשוב משמעותי. נוסף הוא שHSI יכול להיות זמן אינטנסיבי, במיוחד בשלבים הראשונים כאשר ספריות רפאים התייחסות נוצרות. כמו כן, זמן הדמיה עשוי לדרוש כמה דקות ללכידת תמונה, מה שהופך את איטי יותר מאשר ההדמיה darkfield פשוטה; עם זאת, הוא עדיין מהיר יותר מביצוע הכנת דגימה והדמיה על ידי מיקרוסקופי אלקטרונים. בנוסף, מערכות מורכבות עלולות לגרום לספקטרום אופייני מרובה, הדורש הפיתוח של בקרות מאוד מיוחדות ולהפוך את הקמת ספריות סטנדרטיות, אוניברסליות התייחסות קשה 26. לבסוף, טקתוצאות nique ברזולוציה נמוכה יותר מאשר טכניקות probe- או אלקטרון-מיקרוסקופי, כגון מיקרוסקופ כוח אטומי או במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים, אשר יכול לפתור אטומים בודדים. הרזולוציה של טכניקה זו היא מוגבלת בשל האופי פוטוניים, שמונע ממנו להיות כלי דיוק גבוה למדידת גודל חלקיקים ברמת ננומטר או לאיתור חומרים בדיוק ברמה תת-מיקרון. בעוד הטכניקה עשויה להיות מסוגל להצביע חלקיקים בתוך תאי רקמה מסוימים או אברונים תאיים גדול מ -1 מיקרומטר (כגון גרעין תא), האברונים או תכונות קטנים יותר מאתגרים לדמיין בצורה מדויקת בשיטה זו. כן, יש לציין, שניתן ברזולוציה מרחבית שלה, שיטה זו לא יכולה להבדיל בין חלקיקים וagglomerates 11 בודדים. שיקולים אחרים כוללים: חומרים מסוימים (כגון מתכות אצילות) יש החזרה ופרופילי רפאים ברורים הרבה יותר גבוהות, אשר יכול לגרום להם קל יותר analyze ומפת spectrally עם הכלי הזה. אחרים, כגון תחמוצות מתכתיות למחצה נחקרו במחקר זה וננו מבוסס פחמן 24, 27, עשויים להיות מאתגרים יותר בשל ההרכב, הצורה הבסיסית שלהם, ובהתאם למטריצה. בשני מחקרים שאיפה עכברי על ידי מרסר et al., מערכת דומה לזו שהועסקה במחקר זה נעשה שימוש על מנת לאתר צינורות פחמן ובריאות באיברים משני המבוססים על ניגודיות הגבוהה להפליא שלהם עם רקמות הסובבות. עם זאת, מיפוי היפרספקטראלית לא הפגין באו מחקר, ככל הנראה משום שצורתו הייחודית של סיבי פחמן הייתה תכונה מספיקה לזיהוי. שיקול נוסף נוגע באופן ספציפי לרקמות: מאז הפקדת חלקיקים של עניין לאיברים ספציפיים באמצעות תהליכי biophysical נורמלים היא בלתי צפויה (ולעתים קרובות עצמו את הנושא של מחקר), קביעת בקרה חיובית ישימה יכולה להיות קשה ודורש שיקול של איך דור של מטר השליטהight להשפיע על המצב חומרי של עניין. לדוגמא, אם ספריית רפאים נוצר מחלקיקים וטהור של עניין, זה עלול להיות קשה כדי למפות את הספרייה לאותם חלקיקים ברקמות או תאים עקב שינויים בספקטרום כתוצאה משינוי של החלקיק (למשל, כתוצאה משינוי ב pH, פירוק, מסכת, חלבון מחייב) ומייקרו-הסביבה הכללית או מטריצה. לבסוף, הטכניקה מוגבלת בטבע חצי כמותית שלה: זה יכול להיות רק כמותי כמו שיטות מיקרוסקופיה דו ממדים אחרות של החלטה דומה, מה שאומר שלא ניתן להשתמש בם בקלות לבצע משימות כגון אפיון נטל איבר כולל של חומר. בסך הכל, EDFM וHSI לספק מספר יתרונות על פני שיטות הדמיה nanomaterial ואפיון קונבנציונליות, כגון TEM, HAADF ודסק&quot;ש. EDFM / HSI מאפשר רכישה מהירה תמונה וניתוח, אשר חוסך זמן ועלות בהשוואה לconven האינטנסיבי יותרטכניקות tional. בנוסף, הכנת מדגם לEDFM / HSI היא בדרך כלל גם מינימאלית ולא הרסני, אשר חוסך זמן וגם מאפשר ניתוח גמיש יותר של מדגם נתון שכן הוא עשוי לשמש לטכניקות אחרות. יתר על כן, HSI הוא תכליתי, המאפשר ניתוח של חומרים ננומטריים של יצירות רבות ובמגוון רחב של מטריצות. צוות המחקר הוא עובד כדי לחדד את השיטה המתוארת כאן לחומרים אחרים וסוגי מדגם, כוללים הערכה מעמיקה של הספציפיות של הטכנולוגיה. השלב הבא קריטי תחת חקירה על ידי צוות המחקר הוא אימות של טכניקות אלה נגד סטנדרטים זהב מסורתיים (למשל, ראמאן, TEM, SEM) לחומרים וסוגי רקמות של עניין.

כננו משמש יותר ויותר במגוון רחב של תעשיות ויישומים, יש צורך בשיטות ההדמיה ננו ואפיון שיותר מהירים, זולים, ונוחים יותר משיטות מסורתיות, כגון מיקרוסקופ אלקטרונים. כדי להמחיש את ננו-חלקיקי אינטראקציות (NP) עם תאים, רקמות, ומערכות חיים, רבות טכניקות אופטיות להיות מועסקים, כוללים התערבות ההפרש לעומת זאת (DIC) מיקרוסקופיה 1 וגישות המבוסס על שדה חלוף, כגון השתקפות כוללת פנימית (TIR) ​​או כמעט, מיקרוסקופ סריקת שדה אופטי (NSOM) 2,3. עם זאת, אלה הם גישות אנליטיות מתקדמות, מחוץ להישג ידם של רוב המעבדות אינן מומחים 4. מיקרוסקופ אלקטרונים, כוללים מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM), שימש גם ללמוד אינטראקציה עם NP 5,6,7,8 תאים. darkfield טבעתי זווית גבוהה במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (HAADF) סריקה נעשה שימוש כדי לחקור את האינטראקציה של צירופים ועם וירוסים 9. מיקרוסקופיה confocal היא טכניקה פופולרית אחרת המשמשת ללמוד NP-תא אינטראקציות 10. בשנים האחרונות, טכניקות מבוססות darkfield הדמיה היפרספקטראלית (HSI) שימשו ככלי אנליטי מבטיח ללימוד צירופים ובמטריצות ביולוגיות 11. מערכות HSI ליצור ייצוג תלת-ממדי של נתונים מרחביים ורפאים, המכונים קובייה או דטה קיוב 12. המפה המרחבית של וריאציה רפאים משמשת לזיהוי חומרים. פרופילי רפאים של חומרים ידועים יכולים להיות שנוצרו ומשמשים כספריות התייחסות להשוואה לדגימות ידועות. אחד היתרונות הגדולים עם מערכות HSI הוא היכולת שלה לשלב הדמיה עם ספקטרוסקופיה, ובכך לבסס את המיקום והפצה של צירופים ולא ידועים בvivo או vivo לשעבר, כמו גם המקשר אותם לחלקיקי התייחסות נוספות של הרכב ידוע, דומה. ישנם מספר יתרונות שלבאמצעות מערכות HSI על שיטות הדמיה קונבנציונליות: הכנת מדגם מינימאלית נדרש; הכנת מדגם היא בדרך כלל לא הרסנית בטבע; רכישת תמונה וניתוח הוא מהירה יותר; הטכניקה היא חסכונית 13; וההפצה וניתוח מרחבי של תרכובות מעורבים הרכב ו / או במטריצות מורכבות נעשה בקלות רבה יותר 14. למחקר ננו מעורב דגימות יקרות, אחד השיקולים החשובים ביותר היא הזמינות של שיטת הדמיה אינה הרסנית, המאפשרת לפוטנציאל לבחון שוב ושוב דגימות בשיטות אחד או יותר. חוזר או ניתוחים מרובים עשויים להיות רצויים לפתח מערכי נתונים מקיפים שלא יהיו זמין משיטה אחת. לעניין זה, לומד תכונות אופטיות שלה הוא הדרך הבטוחה ביותר כדי לנתח את המדגם. באמצעות מערכת HSI מיקרוסקופ darkfield המשופר (EDFM) וללמוד את התגובה האופטית של המדגם - כלומר reflectance, אלא גם ספיגה והעברה - זיהוי ואפיון תכונה ניתן לבצע 15. נקודות קצה אפיון אפשריים כוללות הערכה של גודל יחסי וצורה של חלקיקים או agglomerates והפצה של חלקיקים בתוך מדגם. במאמר זה, אנו מתארים שיטות מיפוי במיוחד עבור חלקיקי תחמוצת מתכת ברקמה שלאחר המוות באמצעות מערכת HSI מבוססת על אלגוריתם התאמת פיקסל-רפאים המכונה ממפה רפאים זווית (SAM). בחרנו יישום מסוים זה כי יש לו את הפוטנציאל כדי להשלים נוכחית ועתידיים במחקר nanotoxicology vivo, שבו מודלים של בעלי החיים משמשים כדי להעריך את ההשלכות הבריאותיות של חשיפה לננו המהונדס. יישום של שיטה זו יכול גם להודיע ​​מחקר משלוח סמים בקנה מידה ננומטרי שמנצל דגמי רקמה או בעלי חיים. בקליטה מסוימת, ננו-חלקיקים, הפצה, חילוף חומרים, והפרשה לאורך organs ורקמות יכולים להיחקר עם מערכת זו. מגוון רחב של יישומים נחקר לשימוש במחקר ביו-רפואי 11. שיטה זו יכולה להיות מנוצלת להערכה של דגימות ביולוגיות שונות (כגון סוגי רקמות שונות, דגימות שטיפה ברונכואלוואולרית, וכתמי דם) שנחשפו לחלקיקים של מגוון רחב של יצירות יסודות 16-19. יתר על כן, שיטה זו היא שימושית לחקר ננו-חלקיקי biodistribution in vivo ובמבחנה, שהוא רלוונטי ללימודי משלוח סמים בקנה מידה ננומטרי 11. מעבר לדגימות ביולוגיות, EDFM וHSI ניתן להשתמש כדי להעריך חלקיקים בדגימות סביבתיות, כגון שפכים 20. הערכת חשיפה תעסוקתית ניתן להקל על ידי השימוש בטכניקה זו, שכן היא עשויה לשמש כדי להעריך את היעילות של ציוד מגן אישי במניעת חדירת ננו-חלקיקים. יתר על כן, te המחקרבבוקר כרגע הוא מפתחת EDFM דומה ופרוטוקול HSI להערכת דגימות אמצעי סינון של חלקיקים שנאספו מהערכות חשיפה תעסוקתיות. בעוד הכנת הסוגים השונים מדגם אלה לEDFM וHSI עשויה להשתנות, חשוב שהם מוכנים באופן כזה שהם יכולים להיות דמיינו בקלות על ידי המערכת האופטית. בדרך כלל, המדגם צריך להיות מוכן כאילו זה יהיה דמיין באמצעות מיקרוסקופיה brightfield המסורתית. ישנן מספר מערכות הדמיה היפרספקטראלית זמינות 11 מסחרי.

<table><tbody><tr><td>CytoViva 150 יחידה (מעבה)</td><td>CytoViva (אובורן, AL)</td><td></td><td>מותקן על מיקרוסקופ אולימפוס BX43</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אולימפוס BX43 - חריץ אנלייזר - HSI עם מטרות אוויר 10x ו-40x ומטרת טבילת שמן פי 100</td><td>המתקבלת באמצעות CytoViva (אובורן, AL)</td><td></td><td>לשימוש עם מעבה CytoViva 150 Unit</td></tr><tr><td>מצלמת Firewire דיגיטלית Dagexcel-M - מקוררת; כולל תוכנת</td> <td>Exponent 7הושג באמצעות CytoViva (אובורן, AL)</td><td></td> <td>מצלמת שדה אפל משופרת ותוכנה</td></tr><tr><td>מערכת הדמיה היפרספקטרלית CytoViva 1.4; כולל מצלמה היפרספקטרלית Pixelfly, בקר שלב XY, תוכנת הדמיה היפרספקטרלית ENVI</td><td>המתקבלת באמצעות CytoViva (אובורן, AL)</td><td></td> <td>מצלמה היפרספקטרלית ותוכנה</td></tr><tr><td>שקופיות מיקרוסקופ זכוכית מנוקות בחדר נקי (שקופיות זכוכית B)</td><td>Schott NEXTERION</td><td>1025087</td><td>פסולת וחפצים מופחתים בהשוואה לשקופיות מיקרוסקופ זכוכית קונבנציונליות להדמיה אופטימלית</td></tr><tr><td>כיסויי מיקרוסקופ זכוכית נקיים (#1.0; 22 מ"מ x 22 מ"מ x&nbsp; 1.45 מ"מ)</td> <td>Schott NEXTERION</td><td>מופחת בהתאמה אישית</td><td>פסולת וחפצים בהשוואה לכיסויי זכוכית קונבנציונליים להדמיה אופטימלית</td></tr><tr><td>סוג A שמן טבילה במיקרוסקופיה</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12368B</td><td>ספקים מרובים</td></tr><tr><td>70% איזופרופנול ב מים</td><td></td><td></td><td>מרובים</td></tr><tr><td>ספקים תוכנת ImageJ</td><td>המכונים הלאומיים לבריאות (NIH)</td><td></td> <td>תוכנת קוד פתוח בחינם להורדה מקוונת</td></tr><tr><td>של ננו-חלקיקי תחמוצת מתכת</td><td>המסופקים לצוות המחקר על ידי שותפים</td><td></td> תעשייתיים <td>אלומינה, סיליקה וננו-חלקיקי סריה בתרחיפים מימיים. בשל הסכם סודיות בין המחברים לשותפים בתעשייה, לא ניתן לחשוף מידע נוסף על המוצר.</td></tr></tbody></table>

זיהוי של metal oxide חלקיקים בדגימות היסטולוגית על ידי מיפוי darkfield מיקרוסקופית והיפרספקטרליות משופרים

Identification of Metal Oxide Nanoparticles in Histological Samples by Enhanced Darkfield Microscopy and Hyperspectral Mapping

ננו-חומרים נפוצים יותר ויותר בתעשייה, בייצור ובמחקר ביו-רפואי. הצורך בכלים וטכניקות המסייעים בזיהוי, לוקליזציה ואפיון של חומרים ננומטריים בדגימות ביולוגיות הולך וגובר. השיטות הזמינות כיום, כגון מיקרוסקופ אלקטרונים, נוטות להיות עתירות משאבים, מה שהופך את השימוש בהן לאסור עבור חלק גדול מקהילת המחקר. מיקרוסקופ שדה כהה משופר בתוספת מערכת הדמיה היפרספקטרלית עשוי לספק פתרון לצוואר בקבוק זה על ידי מתן אפשרות לאפיון מהיר וזול יותר של ננו-חלקיקים בדגימות היסטולוגיות. שיטה זו מאפשרת הדמיה בקנה מידה ננומטרי בניגודיות גבוהה כמו גם זיהוי ננו-חומרים. לטכניקה זו מכינים דגימות רקמה היסטולוגיות כפי שהיו מוכנות למיקרוסקופיה מבוססת אור. ראשית, דגימות בקרה חיוביות מנותחות כדי ליצור את ספקטרום הייחוס שיאפשר זיהוי של חומר מעניין בדגימה. בקרות שליליות ללא החומר המעניין מנותחות גם על מנת לשפר את הספציפיות (להפחית תוצאות חיוביות כוזבות). לאחר מכן ניתן לדמות ולנתח דגימות באמצעות שיטות ותוכנות למיקרוסקופיה היפרספקטרלית או להתאים אותן לספקטרום הייחוס הללו על מנת לספק מפות של מיקום החומרים המעניינים בדגימה. הטכניקה מתאימה במיוחד לחומרים בעלי ספקטרום החזר ייחודי ביותר, כגון מתכות אצילות, אך ישימה גם לחומרים אחרים, כגון תחמוצות מתכתיות למחצה. טכניקה זו מספקת מידע שקשה להשיג מדגימות היסטולוגיות ללא שימוש בטכניקות מיקרוסקופ אלקטרונים, שעשויות לספק רגישות ורזולוציה גבוהות יותר, אך הן עתירות משאבים וגוזלות זמן רב יותר ממיקרוסקופ אור.

מיקרוסקופיה היפרספקטרליות שימושית ליכולתה לזהות חומרים באופן דומה לספקטרופוטומטריה. כפי שצוין באיור 1, יש כל חומר כמה ספקטרום אופייני וצורה כללית של החזרתה, שהוא ייחודי. יתר על כן, איור 1 מדגים את אופי המטריצה ​​תלויה של פרופילי רפאים: פרופילי רפאים לכל אחת משלוש תחמוצות המתכת בדגימות רקמה היסטולוגית (פנל עליון) שונים מפרופילי רפאים לכל אחת משלוש תחמוצות המתכת בהשעיה מימית ( פנל תחתון). על ידי מיפוי פרופילי רפאים האופייניים לדגימות ידועות באותה המטריצה, הטכניקה שימושית לקביעת קיומו או העדרו של חומר, ויכולה גם חצי כמותית להשוות כמויות יחסי של חומר בדגימות. ספריות רפאים התייחסות נוצרו מדגימות עור שליטה חיובית מתאימות למיפוי לניסוידגימות עור. כפי שניתן לראות באיור 2, ספריות רפאים התייחסות המפה גם לבקרות החיוביות המתאימות ולא מפה לבקרות השליליות המתאימות. היתרון המשמעותי ביותר של הטכניקה הוא היכולת שלה לזהות רמות נמוכות של חומרים של עניין בדגימות, כמו גם כדי להבדיל אותם ממזהמים. . לדוגמא, ניתן להבחין צינורות בודדים בריאות במהלך השאיפה של מינונים נמוכים כמו 40 מיקרוגרם בחולדת 20-30 גרם 25 איור 3 מדגימה זאת בדגימות עור היסטולוגית: בעוד כמה חלקיקים ברורים בקלות בתמונה האופטית darkfield (עמודה 2), אחרים מזוהים באמצעות הדמיה היפרספקטראלית (עמודה 3) שאולי הוחמצה באמצעות מיקרוסקופ brightfield (טור 1) או בשיטות אחרות. השימוש בdarkfield HSI משמש גם כדי לשפר את הספציפיות על מיקרוסקופיה brightfield הפשוטה. אז תמונות אלה יכולים להיות כפופות ליותר צורות כמותית של ניתוח, nניתוח חלקיקי otably באמצעות ImageJ. יש מיקרוסקופיה darkfield המשופרת מספר יישומים שונים, גם בהיעדרו של הדמיה היפרספקטראלית. הראשון הוא היכולת שלה לייצר באיכות גבוהה, תמונות בחדות גבוהה. זו באה לידי הביטוי הטוב ביותר על ידי איור 3, שבו חלקיקים של עניין הם לזיהוי בקלות בהשוואה לעמיתיהם brightfield. תמונות אלה יכולים להיות כפופות גם לניתוח חלקיקים כמותי, אם כי בהעדר מיפוי היפרספקטראלית, זהירות היא הכרחית כדי למנוע מבלבל חלקיקים מזהמים מחלקיקים של עניין. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53317/53317fig1.jpg" /> ספריות איור 1. הפניה רפאים (מטריצת רקמה) בהשוואה לספריות רפאים (חלקיקים בתרחיף). נתון זה ממחיש את החשיבות של יצירת ספריית רפאים התייחסות מנאןomaterials של עניין באותו המטריצה ​​כדגימות ניסוי. השורה הראשונה מציגה את ספריית התייחסות רפאים (RSL) עבור כל חומר במחקר זה (אלומינה, סיליקה וceria). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53317/53317fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> RSL זה נוצר על ידי השיטה המתוארת בפרוטוקול זה, שבו דגימות רקמת שליטה חיובית סוננו נגד דגימות רקמת ביקורת שליליות. השורה השנייה מציגה ספריות רפאים (SL) שנוצרו מהחלקיקים של עניין בהשעיה נוזלית בשקופית זכוכית. לאלומינה, שיא bimodal באורכי גל של 500 ו -650 נמצא בRSL, ואילו שיא יותר מעוגל ופחות ייחודי שראה בSL ההשעיה אלומינה NP סביב 600. לסיליקה, שיא באורך גל של כ -650 היה הווה בRSL, ואילו שיא יותר מעוגל ופחות ייחודי שראה בSL ההשעיה NP סיליקה בarouND 600. לceria, שיא bimodal נמצא באורכי גל של 520 ו620 בRSL, ואילו שיא פחות ייחודי שראה בSL ההשעיה ceria NP בסביבות 560. הדבר מצביע על כך המטריצה ​​שבי הצירופים ומוטבעים יוצרת שינוי בספקטרום שיכול להיות משמעותי בעת בחירת הפקדים ליצור SL לניסוי ספציפי כ. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53317/53317fig2.jpg" /> ספריות רפאים 2. הפניה איור (מטריצת רקמה) ממופות על ביקורת חיובית ורקמת עור חזירי ביקורת שלילית. נתון זה משמש כאישור של RSLs כמתאים למיפוי לדגימות ניסוי, שבכל אחד RSL (עמודה שמאלית) מפות גם לביקורת חיובית (העמודה האמצעית) המקבילה שלה ולא המפה לה מקביל בקרה שלילית (עמודה ימנית). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53317/53317fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ h</a>ere כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53317/53317fig3.jpg" /> איור 3. מיפוי היפרספקטרליות של רקמת עור חזירי ניסיונית נחשפה לחלקיקי תחמוצת מתכת. שורות מלמעלה עד למטה מתאימות לשכבות שונות של העור, משטחי לשכבה העמוקה ביותר: האפידרמיס, הדרמיס, ורקמה התת עורית, בהתאמה. השורה הראשונה מציגה את השכבה הקרנית של האפידרמיס ממדגם עור שנחשף לצירופים ואלומינה בהשעיה; בשורה השנייה נחשפה לסיליקה צירופים ובהשעיה; והשורה השלישית לceria צירופים ובהשעיה. כל עמודה מתארת ​​את אותו האזור של העור צילם בטכניקות שונות. העמודה הראשונה המתאימה למיקרוסקופיה brightfield (בר = 50 מיקרומטר mag .; קנה המידה 40X), שבו השטח המגודר בכיכר אדומה היה מוגדל (mag 100X; סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר) עם מיקרוסקופ darkfield המשופר (EDFז) בטור השני, שבו חצים לבנים מצביעים על ניגודיות הגבוהה צירופים. העמודה השלישית הושגה עם מצלמה היפרספקטראלית (HSI), המציגה את הצירופים וניגודיות גבוהה זהות (חצים לבנים). תמונות EDFM וHSI נלקחו בהגדלה 100X; בר סולם = 10 מיקרומטר. הטור הרביעי מציג את תמונת HSI הממופה נגד RSL בהתאמה לכל קבוצת חשיפה, שבו צירופים ואלומינה מוצגות בצירופים וירוקים, סיליקה באדום, וצירופים וceria בצהוב, בהתאמה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53317/53317fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

מיקרוסקופיה משופרת של שדה כהה והדמיה היפר-ספקטרלית עם מיפוי ספקטרלי מאפשרים סינון, לוקליזציה וזיהוי של חומרים בקנה מידה ננומטרי בדגימות היסטולוגיות עם מהירות ודיוק משופרים בהשוואה לשיטות מסורתיות. מטרת מאמר זה היא לספק שיטות להדמיית שדה כהה ומיפוי היפרספקטרלי של ננו-חלקיקי תחמוצת מתכת בדגימות היסטולוגיות.

זיהוי של Metal Oxide חלקיקים בדגימות היסטולוגית על ידי מיפוי darkfield מיקרוסקופית והיפרספקטרליות משופרים

Nanomaterials are increasingly prevalent throughout industry, manufacturing, and biomedical research. The need for tools and techniques that aid in the ...

המטרה הכללית של הליך זה היא לזהות ננו-חלקיקי תחמוצת מתכת בדגימות היסטולוגיות באמצעות מיקרוסקופיה בשדה חשוך ומיפוי היפר-ספקטרלי. הדבר מושג תחילה על ידי זיהוי אזור עניין בדגימת ביקורת חיובית המכילה ננו-חלקיקים ולקיטת תמונה בשדה חשוך. השלב השני הוא יצירת תמונה היפר-ספקטרלית או קוביית נתונים של אזור העניין באמצעות המצלמה ההיפר-ספקטרלית.בשלב הבא, נוצרת ספריית ספקטרום ייחוס מקוביית הנתונים של הבקרת החיובית, אשר מסוננת מול בקרת שלילית כדי להסיר תוצאות חיוביות שגויות. השלב הסופי הוא שימוש בספריית הספקטרום הייחוס למיפוי מול דגימות ניסוייות, במטרה לזהות ולאתר ננו-חלקיקים בעלי הרכב זהה. בסופו של דבר, מיקרוסקופיית שדה חשוך משופרת ומיפוי היפר-ספקטרלי משמשים לזיהוי ננו-חלקיקי תחמוצת מתכת בדגימות היסטולוגיות באופן מהיר יותר ופחות תובעני במשאביו מאשר טכניקות אחרות, כגון מיקרוסקופיית אלקטרונים.שיטה זו מציעה מספר יתרונות על פני טכניקות קונבנציונליות של דימוי ואפיון ננו-חומרים, כגון מיקרוסקופיה אלקטרונית. זאת מכיוון שהכנת הדגימות היא בדרך כלל מינימלית ולא הרסנית. רכישת תמונות וניתוחן דורשים פחות זמן ועלות, וניתן להחיל אותם לדימוי ננו-חלקיקים במגוון של מטריצות.חוקרים עשויים להיתקל לעיתים בקשיים בשימוש בשיטה זו, מכיוון שיצירת דגימות ביקורת חיובית מתאימות וספריות ספקטרומיות של ייחוס היא מאתגרת וגוזלת זמן. אך ברגע ששלבים ראשוניים אלו הושלמו, ניתן להעריך דגימות ניסיוניות במהירות רבה. בעוד ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי חדירה עורית של ננו-חלקיקים, ניתן להחילה אותה גם על דגימות ביולוגיות אחרות כגון שטיפה ברונכו-אלבולארית ומריחי דם, וכן על דגימות לא ביולוגיות, כגון מסננים המשמשים בהערכות חשיפה תעסוקתית.פלאר סוזה, סטודנט לרפואה מהמעבדה שלי, תדגים את הטכניקה הזו. התחילו בחיבור ובהפעלה של מקור האור, בקר הבמה, המצלמה האופטית, המצלמה ההיפר-ספקטרלית ומערכת המחשב. לאחר מכן, העלו את הבמה ואת הקונדנסור למצב העבודה וטפטפו בזהירות שלוש עד חמש טיפות של שמן טבילה Type A על עדשת הקונדנסור. אם נוצרו בועות, נגבו את השמן ומרחו אותו שוב על העדשה.בשלב הבא, מקם את הדגימה על הבמה והעלה לאט את הקונדנסור עד ששמן הטבילה יבוא במגע עם הצד התחתון של העשייה. הדבר יבוא לידי ביטוי באמצעות טבעת הארה שבהירה במהירות בנקודה שבה השמן בא במגע עם העשייה. כאשר הקונדנסור במקומו, עבר לעדשה אובייקטיבית של 10x ולאחר מכן התאם את המיקוד ואת יישור הקונדנסור כדי למקסם את הבהירות; במידת הצורך, כוונן את כפתורי יישור הקונדנסור כדי למרכז את הנקודה הבהירה.פתחו את תוכנת הדימיון האופטי. התמקדו בדגימה באמצעות כפתור מיקוד העדשה העדין. לאחר מכן, מצאו אזור עניין.כוון את מיקוד הקונדנסור לפי הצורך כדי לאזן את התאורה. לחץ על לשונית ההגדרות (settings) בשורת התפריט ולחץ על כפתור לכידת התמונה (image capture). לצורך אירוע לכידה.בחרו את פורמט התמונה הרצוי והקצו שם קובץ לתמונה. בנוסף, בחרו את ערך ה-time lapse ברירת המחדל, ולבסוף לחצו על אישור. לאחר מכן, עברו לתפריט החשיפה ובחרו את הגדרות החשיפה היוצרות את התמונה בעלת הניגודיות הגבוהה ביותר.כאן, הרמה מוגדרת ל-0.0%. ההגבר מוגדר ל-2.8 decibels ומהירות התריס מוגדרת ל-56 milliseconds שניות. צלם את התמונה על ידי לחיצה על כפתור התמונה בסרגל התפריטים. שנה את העדשה ל-40 x ו-100 x.בעת לכידת תמונות בהגדלות גבוהות יותר, ודאו שמוליך האור מופנה למצלמה ההיפר-ספקטרלית, ולאחר מכן פתחו את התוכנה לדמיון היפר-ספקטרלי לצורך רכישת קוביי filmmakers נתוני HSI; בתוכנה פתחו את המיקרוסקופ ההיפר-ספקטרלי בשורת התפריטים ובחרו בבקרת מיקרוסקופ HSI. כאן הגדירו את הגדלת העדשה ואת הנתיב הבטוח. לאחר מכן, שנו את אזור הלכידה בהגדרות, ושנו את מספר השורות.במחקר זה השתמשנו ב-720 כדי להגדיר את זמן החשיפה. כאן השתמשנו ב-0.25 שניות. השאירו את שאר ההגדרות כברירת מחדל ולחצו על preview HSI כדי לצפות בתמונה.צפה בגרף העוצמה המתקבל, המייצג את העוצמה של אורך הגל הגבוה ביותר בעוד המשתמש נע לאורך ציר ה-x של מרכז שדה הראייה של המצלמה. הזז את הסמן כדי ליצור קווי מתאר מדויקים של הגרף. פעולה זו תגרום להופעת מחוון עוצמה מספרי בצד שמאל.מקדו את התמונה על בסיס תצוגה מקדימה זו על ידי כיוון המיקוד העדין של העדשה כדי להדגיש את הפסגות בתמונה. לאחר מכן, הגבילו את עוצמת התאורה על ידי כיוון בהירות המקור או מיקוד הקונדנסור, או בטלו את התצוגה המקדימה והתאימו את זמן החשיפה בתוכנה. לחצו על capture וצפו בארבעה חלונות חדשים שייפתחו עם השמות הזמינים.רשימת ערוצים. הגדלה של ערוץ מספר 1. גלילה של ערוץ מספר 1 וערוץ RGB מספר 1 מופיעים.הגדילו את חלון ערוץ ה-RGB מספר אחת, שכן זהו קוביית הנתונים (data cube) שתשמש לכל הייחוסים הבאים. לחצו לחיצה ימנית על קוביית נתונים זו, שמרו אותה כקובץ tiff ולחצו על אישור. לחצו לחיצה ימנית בחלון תמונת קוביית הנתונים ולחצו לחיצה שמאלית על Z profile spectrum.כאשר חלון הפרופיל הספקטרלי הקופץ מופיע משמאל, לחצו על הפיקסלים הרלוונטיים ביעד של קוביית הנתונים. הפיקסלים הבהירים ביותר הם אלו שניתן לזהותם בוודאות כמי שמייצגים את החומר המבוקש. תחת תפריט ניתוח החלקיקים, בחרו בכלי סינון החלקיקים כדי לזהות חלקיקים הנמצאים בקוביית הנתונים.בחלון הפופ-אפ החדש שנפתח, יש להגדיר את ה-spectral max כך שיעלה על ערך מסוים, כדי שיהיה גבוה יותר מפיקסלי הרקע, אך נמוך יותר מחומרי העניין. המקסימום של נתונים תקפים הוא 16,000. בחלון כלי סקירת מסנן החלקיקים, לחץ על בחר הכל.לאחר מכן לחצו על export to spectral library והקצו שם לספריית הספקטרום שלכם. לאחר בחירת דגימה שתשמש כביקורת שלילית, השגימו מספר קוביות נתונים מהדגימה. בעזרת המצלמה ההיפר-ספקטרלית, נדרשת לפחות קובייה אחת, אך ניתן ללכוד יותר.כדי להגביר את הסלקטיביות כאשר קובץ הנתונים של הביקורת השלילית פתוח, לחץ על filter spectral library. בתפריט הניתוח (analysis) הממוקם בסרגל הכלים הראשי של התוכנית, לחץ על open new file ובחר את ספריית הספקטרום שנוצרה קודם לכן עבור הביקורת החיובית כקובץ הקלט, ולאחר מכן לחץ על okay. בחלון ה-filter cyto viva spectral library, לחץ על image ובחר את שם קובץ הפלט עבור ספריית הספקטרום הייחוס, ולחץ על okay.בשלב הבא, לחצו על שם הקובץ של קוביית נתוני בקרת השלילה כמעט תמונה מקור. התוכנה תנתח את הספריה הספקטרלית ותסיר כל ספקטרום התואם לספקטרום כלשהו מקוביית נתוני בקרת השלילה. השגו קוביית נתונים מהדגימות הניסיוניות כאשר קוביית הנתונים הניסיונית פתוחה.לחצו על התפריט הספקטרלי בתפריט המשני של שיטות המיפוי (mapping methods). פתחו את הממפה הזוויתית הספקטרלית (spectral angle mapper). בחרו את שם קובץ הנתונים הניסויי (data cube) בחלון הצף, ולחצו על אישור. אם לא מופיעים שמות קבצים, לחצו על "פתח קובץ חדש" (open new file) ובחרו את קובץ הנתונים הניסויי.לאחר מכן לחצו על אישור בחלון הקופץ שנקרא End Member collection, ב-SAM, לחצו על import בשורת התפריטים. לאחר מכן בחרו ב-Spectral Library file. פתחו את ספריית הספקטרום של הייחוס שנוצרה קודם לכן, ולחצו על אישור.בחלון הפופ-אפ החדש שנקרא Input Spectral Library, לחצו על select all items ואז על okay. לאחר מכן, לחצו קליק ימני על color ובחרו ב-Apply default colors to all, לחצו על select all ולאחר מכן על apply, ובסוף בחרו את שם קובץ הפלט ולחצו על okay.פתחו את תפריט השכבות (overlay menu) בחלון קובץ הנתונים (data cube) ובחרו בסיווג (classification). לאחר מכן, נווטו לשם קובץ הפלט ולחצו על אישור. בתפריט חלון כלי הסיווג האינטראקטיבי, פתחו את תפריט האפשרויות ובחרו במיזוג מחלקות (merge classes) כדי ליצור סכימת צבעים מאוחדת.כדי להקל על ניתוח הנתונים באמצעות תוכנות אחרות, בחרו ספקטרום בודד מרשימת מחלקת הבסיס. לאחר מכן, בחרו את כל המחלקות למעט הבלתי מסווגות (unclassified) כדי למזג אותן לתוך מחלקת הבסיס. לסיום, לחצו על אישור.בשלב הבא, לחצו על צבע הבסיס שנבחר וכל הספקטרומים התואמים יוצגו בצבע זה. כדי לקבל תמונה שתציג את הספקטרומים התואמים על רקע שחור, לחצו על תיבת הצבעים שאינם מסווגים, שהיא שחורה כברירת מחדל. היתרון המשמעותי ביותר של הטכניקה הוא יכולתה לזהות ננו-חלקיקי תחמוצת מתכת בדגימות היסטולוגיות באמצעות מיקרוסקופיה בשדה אפל ומיפוי היפר-ספקטרלי. תמונות אלו מדגימות תהליך זה באמצעות דגימות היסטולוגיות של עור.בעוד שחלק מהחלקיקים בולטים בבירור בתמונת השדה האפל האופטית, חלקיקים נוספים מזוהים באמצעות דימיון היפר-ספקטרלי. מוצגת כאן רקמת עור של חזיר בשכבת האפידרמיס, אשר נחשפה לננו-חלקיקי Illumina. צבר בעל ניגודיות גבוהה של ננו-חלקיקים נמצא שקוע מעל ה-stratum corneum בשכבה הדרמיסית, אשר נחשפה לננו-חלקיקי סיליקה.ניתן לראות ננו-חלקיקים מרובים בעלי ניגודיות גבוהה השקועים על רקמת החיבור. לבסוף, ברקמה התת-עורית שנחשפה לננו-חלקיקי Syria, ניתן לראות ננו-חלקיקים מפוזרים מרובים בעלי ניגודיות גבוהה השקועים לאורך התאי השומניים; זיהוי ננו-חלקיקים באמצעות שיטה זו.ניתן לבצע זאת גם בדגימות רקמה אחרות כגון ריאה, כבד, טחול, כליות וקשרי לימפה. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע ניתוח תמונה על מנת לענות על שאלות נוספות, כגון ספירת החלקיקים ומיקומם. יש לשקול שיקולים וחסרונות מסוימים, כגון הצורך בביקורות מתוחכמות במיוחד והמגבלות על רזולוציית הדימות הפוטוני, אל מול אלו של שיטות קונבנציונליות.בעת בחירת הטכניקות האנליטיות המתאימות ביותר לבחינת שאלות מחקר ספציפיות, בחרנו להדגים יישום זה מכיוון שיש לו פוטנציאל להשלים מחקרים נוכחיים ועתידיים בננו-טוקסיקולוגיה. הוא יכול גם לספק מידע למחקרים הנוגעים לספיגה, התפלגות, מטבוליזם והפרשה של ננו-חלקיקים באיברים וברקמות שונות.

identification-metal-oxide-nanoparticles-histological-samples

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

בסרטון זה, אנו מתארים את טכניקת מיקרוסקופ השדה האפל (DFM) בשילוב עם ניתוח מעקב אחר חלקיקים בודדים (SPT) כדי לנטר את האינטראקציה של ננו-מוטות זהב פלסמוניים עם קרום התא של קו עניין ספציפי. ניתוח משולב של DFM ו-SPT מאפשר הדמיה של תנועת הננו-מוט דרך קרום התא ברזולוציה מרחבית-זמנית גבוהה.

מיקרוסקופ Darkfield להמחשת דינמיקה דיפוזית של ננו-מוטות על קרום התא

ספקטרוסקופיה התמוטטות מושרה לייזר מבוצעת על איבר דק ורקמת גידול זוהתה בהצלחה אלמנטים טבעיים וגדוליניום המוזרק באופן מלאכותי (ה '), שהונפקו מחלקיקים המבוססים על ה'. תמונות של יסודות כימיים הגיעו לרזולוציה של 100 מיקרומטר ורגישות תת מ"מ כמותית. התאימות של ההתקנה עם מיקרוסקופיה אופטית סטנדרטית, מדגישה את הפוטנציאל שלה כדי לספק מספר רב של תמונות מאותה רקמה ביולוגית.

ספקטרוסקופיה התפלגות מושרה לייזר: גישה חדשה למיפוי של Nanoparticle וכימות ברקמות איברים

בגלל השימוש נרחב של החשיבות ופלדיום, זהב וקובלט   מתכות בציוד טכנולוגי גבוהה, השחזור והמיחזור שלהם מהווים אתגר תעשייתי חשוב. מערכת התאוששות המתכת המתוארת במסמך זה בעלות נמוכה פשוטה, אומרת לאיתור, הסר, והתאוששות היעילה של מתכות אלה מהמכרה העירונית.

איתור והשחזור של פלדיום, מתכות זהב וקובלט ממכרה העירונית באמצעות חיישנים / Adsorbents רומן יעודיים עם נקבוביות-בצורת גלגל עגלה ננומטריים

מתוארת שיטה לפיה ניתן להשתמש בננו-חלקיקי נקודה קוונטית (QD) למחקרים אימונוציטוכימיים קורלטיביים של רקמת פתולוגיה אנושית משובצת אפוקסי. אנו משתמשים ב-QDs מצומדים של שברי נוגדנים מסחריים המומחשים על ידי מיקרוסקופ אור פלואורסצנטי בשדה רחב ומיקרוסקופ אלקטרונים שידור.

מיקרוסקופי אלקטרונים בהירי-עור גומל באמצעות חלקיקי נקודה קוונטית

אנו מתארים הליך איתור אלמנטים כימיים נוכח באתרו בתוך התאים של האדם, כמו גם שלהם כימות במבחנה . השיטה הוא מתאים היטב לכל סוג התא, שימושי במיוחד עבור בדיקות כימיות כמותית של תאים בודדים בעקבות במבחנה חשיפה חלקיקי תחמוצת מתכת.

בחיי עיר זיהוי, כימות תא בודד של תחמוצת מתכת חלקיקים באמצעות ניתוח Microprobe גרעיני

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לזהות אשכולות בעלי חמצן מתכת דיסקרטית, polyoxometalates (פופונים), במגבלת המולקולה היחידה באמצעות פלטפורמה אלקטרונית מבוססת nanopore ביולוגי. השיטה מספקת גישה משלימה לכלי כימיה אנליטיים מסורתיים המשמשים בחקר מולקולות אלה.

אפיון פיסי ברזולוציה גבוהה של חלקיקים מתכתיים בודדים

המטרה של פרוטוקול זה היא לפרט גישה מוכחת להכנת דגימות הפלמונית ננו-חלקיק ולביצוע ספקטרוסקופיית חלקיקים בודדים עליהם בעזרת מיקרוסקופ בניגוד להפרעות דיפרנציאליות (DIC).

מבצע ספקטרוסקופיית על חלקיקי פלמונית עם מיקרוסקופ ניגוד מבוסס שידור מסוג Nomarski הפרעות דיפרנציאליות

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לקבל הדמיה היפרספקטראלית נתונים ולנתח את תכונות anisotropy אופטי של קריסטלים בודדים מבוססי לנתניד באמצעות מערכת הדמיה Hyperקטרלית.

הדמיה היפרספקטראלית ככלי לחקר Anisotropy אופטי ב לנתניד מבוססי גבישים בודדים מולקולריים

כאן, אנו מראים את השימוש במיקרוסקופיה מסורתית של שדה כהה כדי לפקח על הדינמיקה של nanorods זהב (AuNRs) על קרום התא. המיקום והכיוון של AuNRs יחיד מזוהים באמצעות ImageJ ו- MATLAB, והמדינות המפוזרות של AuNRs מאופיינים בניתוח מעקב אחר חלקיקים בודדים.

הדמיה של דינמיקה דיפוזיונית של ננו-ירדס זהב על קרום התא באמצעות מיקרוסקופיה אחת של ננו-חלקיקים בדארקפילד

מאמר זה מציג את השילוב של מודול מיקוד ספקטרלי ולייזר פולסים בעל פלט כפול, המאפשר הדמיה היפרספקטרלית מהירה של ננו-חלקיקי זהב ותאים סרטניים. עבודה זו נועדה להדגים את הפרטים של טכניקות אופטיות רב-מודאליות לא ליניאריות במיקרוסקופ סריקת לייזר סטנדרטי.

הדמיה ביומולקולרית של קליטת תאים של ננו-חלקיקים באמצעות מיקרוסקופיה אופטית רב-מודאלית לא ליניארית

כאן, אנו מציגים פרוטוקול המציג מצע שקוף ושטוח אופטית ללכידה וניתוח יעילים של חלקיקים מזהמים במי השתייה. מוצג כאן צינור ניתוח ננו-ממברנה מסיליקון (SNAP): צינור גמיש ללכידה, כימות וזיהוי של חלקיקים במדיה נוזלית.

ניתוח רב-מודאלי של מיקרופלסטיק במי שתייה באמצעות צינור ניתוח ננו-ממברנה מסיליקון

למד לזהות חלקיקי Metal Oxide בדגימות היסטולוגיות באמצעות מיקרוסקופיית darkfield משופרת ומיפוי היפרספקטרלי. שיטה זו מאפשרת זיהוי מהיר ומדויק של ננו-חלקיקים בביולוגיה ובנוירומדיצינה.

זיהוי של Metal Oxide חלקיקים בדגימות היסטולוגית על ידי מיפוי darkfield מיקרוסקופית והיפרספקטרליות משופרים

גלה סרטונים נוספים