Name: הערכה של ריאות גרורה במודלי גידול עכבר החלב על ידי בזמן אמת כמותי PCR (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: למד כיצד לזהות ולכמת mRNA ספציפי מתאי גידול בריאות עכבר באמצעות QRT-PCR בזמן אמת. שיטה זו מספקת מדידה כמותית מדויקת של ריאות גרורה במודלים אונקולוגיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המעבדה יה נתמכת על ידי מימון מחקר מאגודה אמריקנית לסרטן מוסדי מענק מחקר (IRG-97-219-14) הוענק למרכז הסרטן הולינגס בMUSC, על ידי מימון מחקר ממענק משרד ההגנה (W81XWH-11-2- 0229) בMUSC, ועל ידי פרסים מדאגת הקרן (לESY).

הפרוטוקול כדלקמן הנחיות ותקני טיפול בבעלי החיים של האוניברסיטה הרפואית של דרום קרוליינה (MUSC) והטיפול בבעלי חיים המוסדי שלה וועדת שימוש (IACUC). 1. ריאות Dissection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתיחת גידול החלב (אופציונאלי בהתאם למטרות מחקר והאם הזרקת ניתוח גידול ראשוני או וריד זנב בוצעה). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכבר באמצעות מנה קטלנית של ההרדמה isoflurane לפי IACUC ורגולצית אוניברסיטה. לאשר מתת חסד, על ידי נקע בניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על לוח הקצף, סיכה עם סיכות לנתיחה על ידי הצבת עכבר על גבה עם גפיים התפשטות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ריסוס עכבר עם 70% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים, לתפוס את החלק התחתון של בעלי החיים במרכז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במספריים, לחתוך כלפי מעלה לכיוון הצוואר דרך העור, נזהר שלא לנקב את חלל הצפק של העכבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקצץ עור באיברים לחשוף רקמת גידול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את רקמת גידול ויחסי ציבורeserve ידי שיטה מועדפת, כגון הקפאה או קיבעון, לניתוח נוסף (לא נידון בהרחבה בפרוטוקול זה). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתיחת רקמת ריאה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם רקמת גידול הייתה לקצור כפי שתוארה לעיל, להצמיד כל עור עודף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים, לתפוס הצפק בקצה תחתון של בעלי החיים ולהתחיל לחתוך כלפי מעלה לכיוון בסיס הצוואר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לחתוך לאורך הצדדים שמאל וימין של להיות זהיר, כדי למנוע ניתוק כל כלי דם שעלול לדמם לתוך חלל בית חזה כלוב הצלעות. הסר את עצמות צלעות על ידי חיתוך שמאלה וימינה דרך מנות סרעפת והעליונה של כלוב הצלעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים לתפוס את קנה הנשימה של העכבר ולמשוך קדימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק את קנה הנשימה עם מספריים לנתיחה ולהסיר ריאות מעכבר. הערה: הלב עשוי להישאר מחובר לריאות. במקרה זה, לנתח בזהירות לב מריאות להיות זהיר, כדי לאסוף את כל חמש האונות (ראה איור 1 </strong&gt;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף בעדינות עם PBS להסיר דם עודף. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערכה גסה של רקמת ריאה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשרות 1: in vivo הדמיה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדמיה לוציפראז, ~ 10 דקות לפני הדמיה, נותן חיות 150 מ&quot;ג / קילוגרם מינון של luciferin ידי הזרקת intraperitoneal (IP). ריאות תמונת in vivo בבעלי חיים בהרדמה או על ההסרה לאחר הנתיחה (איור 2) 5. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשרות 2: הערכה גולמית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק ריאות תחת מיקרוסקופ סטריאו לדמיין גושים סרטניים. הערה: אם התאים GFP שכותרתו, מסוגל סטראו הקרינה המכיל קוביית אור עם מקסימום עירור / פליטה המתאימה (למשל ליד 470/510 ננומטר) כדי לזהות GFP ניתן להשתמש כדי לבחון ריאות stereoscopically לקרינה לפני העיבוד. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם ריאות הן להיות מנותחות באופן מיידי, המשך לסעיף &quot;בידוד RNA&quot;. אחרת, הצמד רקמות הקפאה באמצעות liquחנקן id או קרח יבש. חנות ב -80 מעלות צלזיוס. </li></ol></li></ol> בידוד 2. RNA הערה: ניתוח הנציג, RNA היה מבודד באמצעות ערכת בידוד RNA (ראה חומרי רשימה). בעוד הניתוח הנוכחי משתמש המוצר של יצרן אחד ספציפי, מגוון רחב של ערכות בידוד זמין ממספר ספקים מכובדים. בנוסף, שיטות צנטריפוגה שאינה מבוססות ערכה הן גם אופציה. צריך גם להיות מוכן cDNA ממדגם RNA השליטה חיובי, כגון קו סלולארי או פלסמיד, לניתוח עקום סטנדרטי. לחלופין, שליטה חיובית ספציפית לסט הבדיקה תחל ניתן לרכוש (ראה חומרי רשימה). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם באמצעות רקמה קפוא בעבר, לאסוף רקמה קפוא בקרח יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Homogenize רקמות באמצעות אחת מהשיטות כגון הבאות: מכתש ועלי טחינה שבוצעה על ידי יד על קרח יבש לאחר הקפאת רקמה בחנקן נוזלי; homogenizer רקמות או התקן ניתוק מכאנילהצעתו של היצרן; sonication, או שיטה מועדפת אחרת. הערה: ניתוח הנציג, השיטה המועדפת להומוגניזציה היא sonication. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניתוח שהוצג באיור 3, להכין מאגר תמוגה (בתנאי בערכת בידוד RNA) ו- 2-mercaptoethanol ביחס של 20 μl 2-mercaptoethanol לכל 1 מיליליטר של חיץ תמוגה. רקמה גלולה ב300 חיץ תמוגה μl בתוספת 2-mercaptoethanol לכל 30 גרם של רקמה וsonicate במשך 10 שניות עם sonicator נקבע על משרעת של 30%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם משתמש במכתש ועלי, רקמת קרקע גלולה במאגר תמוגה 300 μl לאחר הטחינה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף K proteinase 10 μl לחיץ 590 μl TE (10 מ&quot;מ טריס-HCl, pH 8.0; 1 mM EDTA). להוסיף פתרון K 600 proteinase μl לכל 300 μl (כלומר לכל 30 מ&quot;ג) של רקמה. דגירה של 10 דקות ב RT. הערה: זמן עיכול עשוי להשתנות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה דגימות ≥13,000 גרם במשך 10 דקות כדי להסיר שאריות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת supernatant לצינורות חדשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 450 אתנול μl (96% -100%) לכל 900 μl של supernatant כדי לזרז RNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את 700 μl של תערובת lysate / אתנול לעמודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה דגימות ≥13,000 גרם דקות 1 כדי לאגד RNA לטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל פסולת נוזלית ולהוסיף supernatant נותר לעמודה ספין שוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שכל lysate הוא הסתובב בטור, להוסיף 350 μl של הצפת לשטוף 1 לחלק העליון של דגימות עמודה ו צנטריפוגות ב≥13,000 גרם במשך 30 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל נוזל מהטור ולהחליף עליון חלק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן DNase על ידי ערבוב 5 יחידות של DNase אני אנזים עם 5 μl של 10x DNase ו -40 μl של מים חופשיים DNase / RNase לדגימה (נפח כולל של 50 μl / מדגם). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של DNase לערבב לכל עמודה והדגירה במשך 15 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 350 μl של הצפת לשטוף 1 לעמודה ו צנטריפוגות סםPles ב≥13,000 גרם במשך 30 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל נוזל מהטור ולהחליף עליון חלק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 600 μl של הצפת לשטוף 2 לעמודת ספין 30 שניות ב≥13,000 ז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל נוזל מהטור ולהחליף עליון חלק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 250 μl של הצפת לשטוף 2 ו צנטריפוגות 2 דקות ב≥13,000 ז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים חלק מעמודה לתוך צינור אוסף חדש וזורקים צינור איסוף ישן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 50-100 μl של מים חופשיים RNase / DNase לעמודה ודגירת דקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין 1 דקות ב≥13,000 ז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> eluate שנאסף באמצעות עמודה כדי להגדיל את תשואת RNA להפעיל מחדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשימוש מיידי, לשמור על דגימות קרח ולהמשיך לכימות. לשימוש מאוחר יותר, הצמד הקפאת קרח יבש או חנקן נוזלי. חנות במקפיא -80 ° C עד צורך. </li></ol> 3. ראשית סטרנד סינתזה הערה: ניתוח הנציג, טרנסקריפטאז התגובה (RT) בוצעה Fערכת סינתזת irst סטרנד cDNA המיועדת לqRT-PCR (ראה חומרי רשימה). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם דגימות נאספו בעבר, להפשיר צינורות על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד כמות RNA באמצעות ספקטרופוטומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות 0.5-2 מיקרוגרם של רנ&quot;א הכל, לבצע סינתזת גדיל ראשונה באמצעות טרנסקריפטאז ליצור מניית cDNA. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב, צינורות RNase / PCR ללא DNase / צלחות סטרילי, להכין את תערובת התגובה (טבלת 1). מערבבים בעדינות וצנטריפוגה. לתכנת מכונה סטנדרטית PCR (טבלה 2). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל תגובה מוגמרת לנפח רצוי (בדרך כלל 50-100 μl) באמצעות nuclease ללא מים סטריליים. </li></ol> 4. בזמן אמת PCR הערה: ניתוח הנציג, ירוק SYBR היה בשימוש. עם זאת, כל שיטה העדיפה ניתן להחליף בהתאם לשיקול דעתו של המשתמש. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש cDNA שליטה חיובי, להגדיר עקומה סטנדרטית עבור כל קבוצת פריימר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניתוח הראה שn איור 3, להכין את העקומה סטנדרטית לHER2 האנושי באמצעות היצרן מומלץ cDNA בקרה החיובי (ראה חומרי רשימה). לGAPDH עכבר, להשתמש בcDNA ריאות שליטה השלילי כדי ליצור עקומה סטנדרטית. עבור כל בדיקה, סדרתי לדלל cDNA 1: 4 כדי לייצר 5 תקנים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את מספר הדגימות כוללת, אשר צריך לכלול את העקומה סטנדרטית ודגימות ניסוי. הערה: הניתוח שתואר כאן, 2-3 חזרות ניסיוניות לדגימה נותחו. ניתוח עקום סטנדרטי בוצע כדי ליצור מודל רגרסיה ליניארית פשוט שניתן ליישם על מנת לקבוע את הסכום היחסי של HER2 וGAPDH לדגימה לחשב כמות מנורמלת סופית. ניתוח זה גם יבטיח כי יעילות פריימר היא נאותה לניתוח ביד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בRNase / צינור סטרילי, ללא DNase, להכין תערובת אב (לוח 3). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב עמון תערובת אמןלא לדגימה. בהיקף של עד למדגם אחד או יותר. השתמש בתערובת אב כל גן ניסויי של עניין, כמו גם בקרה פנימית כגון GAPDH. השתמש בצבעי יסוד לGAPDH בריכוז סופי של 200 ננומטר. הערה: הבקרה הפנימית היא שימושית במיוחד כאשר מנסים להבחין בין מקור תא האנושי ועכבר. הערה: ריכוז פריימר לHER2 היה מותאם ונקבע על ידי היצרן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן צלחת בדיקה המכילה cDNAs μl 1 מתאים לכל דגימה סטנדרטית או ניסיונית. להקצות מדגם cDNA לפחות 1 / גם עבור כל בדיקה פריימר. להוסיף 19 μl של תערובת אמן בכל טוב עבור כל בדיקה פריימר. הערה: נתוני הנציג באיור 3, דגימות cDNA נותחו בשני עותקים עבור כל בדיקה פריימר וגרף כממוצע של שתי דגימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תגובה לרוץ בqRT-PCR מכונה באמצעות מומלצת או נבדקה פרוטוקול PCR בעבר. ראה טבלת 4 </sטרונג&gt; לפרוטוקול PCR משמש לנתונים הנציג באיור 3 ואיור 4. </li></ol>

<ol><li>Gupta, G. P., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+metastasis%3A+building+a+framework%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cancer metastasis: building a framework.</a> Cell. 127 (4), 679-695 (2006).</li>
<li>Bos, P. D., Nguyen, D. X., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+metastasis+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Modeling metastasis in the mouse.</a> Curr Opin Pharmacol. 10 (5), 571-577 (2010).</li>
<li>Kim, I. S., Baek, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+for+breast+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Mouse models for breast cancer metastasis.</a> Biochem Biophys Res Commun. 394 (3), 443-447 (2010).</li>
<li>Saxena, M., Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rebuilding+cancer+metastasis+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Rebuilding cancer metastasis in the mouse.</a> Mol Oncol. 7 (2), 283-296 (2013).</li>
<li>Yang, S., Zhang, J. J., Huang, X. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+for+tumor+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Mouse models for tumor metastasis.</a> Methods Mol Biol. 928, 221-228 (2012).</li>
<li>Rampetsreiter, P., Casanova, E., Eferl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+modified+mouse+models+of+cancer+invasion+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today+Dis+Models%22%5BJournal%5D)">Genetically modified mouse models of cancer invasion and metastasis.</a> Drug Discov Today Dis Models. 8 (2-3), 67-74 (2011).</li>
<li>Condeelis, J., Segall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+cell+movement+in+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of cell movement in tumours.</a> Nat Rev Cancer. 3 (12), 921-930 (2003).</li>
<li>Massoud, T. F., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+imaging+in+living+subjects%3A+seeing+fundamental+biological+processes+in+a+new+light%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new light.</a> Genes Dev. 17 (5), 545-580 (2003).</li>
<li>Zinn, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+bioluminescence+imaging+in+small+animals%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Noninvasive bioluminescence imaging in small animals.</a> ILAR J. 49 (1), 103-115 (2008).</li>
<li>Tseng, J. C., Kung, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+bioluminescence+imaging+of+mouse+tumor+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Quantitative bioluminescence imaging of mouse tumor models.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2015 (1), (2015).</li>
<li>Radonic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guideline+to+reference+gene+selection+for+quantitative+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR.</a> Biochem Biophys Res Commun. 313 (4), 856-862 (2004).</li>
</ol>

ESY ומאא אינם מועסק על ידי FirstString המחקר בע&quot;מ ולא מחזיקים שום אינטרס כלכלי בחברה. FirstString ריסרץ &#39;סיפק את נתוני ההדמיה לוציפראז שהוצג בכתב היד הזה. GSG הוא נשיא ומנכ&quot;ל של מחקר FirstString. CLG הנו עובד מחקר FirstString. יש לי GSG וCLG אופציות שהונפקו על ידי מחקר FirstString.

פרוטוקול זה מתאר שימוש בqRT-PCR להעריך גרורות תאים סרטניים החלב לריאות תוך שימוש במודל עכבר xenograft. הוא הכיר בכך שטכניקות אחרות, כוללים הדמיה bioluminescent, זמינות והם גם יעילים לאיתור גרורה למרות שיש ערכים משלהם ומגבלות. הנתונים שהוצגו עולה כי qRT-PCR מספק אמצעי אפקטיבי של גילוי mRNA הנגזר גידול ברקמת ריאה לכימות של גרורות כוללת. מוצע כי ניתוח qRT-PCR מספק שיטה משנית שיכול להשלים או לבצע במקום טכניקות הדמיה אלה. טכניקה זו עשויה להיות מתאימה ביותר עבור סביבות מחקר עם גישה מוגב...

ניתוח qRT-PCR מוצע כשיטת להערכת גרורות סרטנית. שיטה זו מוצע כאלטרנטיבה עבור משתמשים שמעוניינים בהערכת גרורות אבל אין גישה לציוד ספציפי כגון ציוד ההדמיה in vivo או מסוגל stereoscope הקרינה. דיון בשיטות נפוצות הוא שהוצגו אחרי הפגנה לאיך ניתוח qRT-PCR יכול לשמש גם כנפרד או כשיטת לוויה להעריך גרורות. יש הליך זה הפוטנציאל לספק ניתוח כמותי של נטל גרורתי. שיטות סטנדרטית של ניתוח ברוטו, כוללים הדמיה של ריאות תחת סטראו, כמו גם חתך סידורי אחרי hematoxylin ו eosin מכתים (H &amp; E) של רקמת ריאה, הן לכימות, אך מסתמכות במידה רבה על פרמטרים הגדרת משתמש לספירת 2-5. בעת ההערכה כל ריאות באמצעות סטראו, גרורות משטח רק גדולות הם Visible וניתוח דורש חוקר להיות בעל ידע סביר של מבנה האנטומי ריאות כדי לקבוע מה מהווה נגע גרורתי. תיוג ניאון של תאים סרטניים עם סמן כגון GFP ושימוש בסטראו המכיל קוביית אור עם מקסימום עירור / הפליטה המתאימה (למשל ליד 470/510 ננומטר לGFP) מסייע בתהליך זה, אבל הגושים סרטניים משטח רק לזיהוי . בנוסף, הקרינה מזיהום דם, שהוא נראה באותם פרמטרים כמו GFP, עלולה להוביל לזיהוי שגוי של נגעים גרורתי אפשריים. חתך של הריאה ואחרי צביעת H &amp; E לדמיין גרורות ריאות הוא שיטה שימושית להעריך micrometastases ותהליכים מיקרוסקופיים אחרים, כולל חדירת תאי מערכת חיסון, אך לעתים קרובות דורש שימוש בכל רקמת הריאה להטבעת פרפין, חתך, ונהלים מכתים. לכן, נהלים במורד הזרם אינם אידיאליים הבאים metho זהד. למרות כימות, הליך זה דורש החוקר להעריך במספר רב של סעיפי ריאות מוכתמים לכל בעלי חיים על מנת להבטיח שהניתוח מהווה את כל מבנה 3D של הריאות. כתוצאה מכך, זה סוג של בדיקה הוא לצרוך זמן, יכול להוביל לספירת שגיאה, ומסתמך במידה רבה על ניתוח שיקול דעת חוקר. כמה בטכניקות ההדמיה vivo (למשל MRI, PET, SPECT) משמש כיום לבצע או לבדוק תהליכים ביולוגיים במודלים של מכרסמים ניסיוניים 8. בvivo ההדמיה bioluminescent היא שיטה נפוצה המשמשת לרכישת נוף ברוטו של גרורות 9. טכניקה זו מיושמת בדרך כלל על מנת להעריך את הנוכחות של פעילות העיתונאית לוציפראז בשל ההצטברות של תאים סרטניים, שמתוכננים להכיל אלמנט תגובת לוציפראז, שמתגוררים באיברים מסוימים כמו בלוטת החלב לאחר השתלת תאים סרטניים והריאות על גרורות ספונטניות 10. יזואליזציה של פעילות העיתונאית לוציפראז מושרה על ידי הנוכחות של מצע luciferin (D-luciferin). בלוציפראז מזרז decarboxylation חמצוני של D-luciferin לoxyluciferin יצירת פליטת אור. בעוד אינפורמטיבי, שיטה זו מוגבלת על ידי מספר גורמים, כולל יציבות מצע (כלומר מחצית חיים קצרים), הפצה הולמת של מצע שתלוי איך הוא מועבר לחיות ניסוי, ורגישות נמוכה של גילוי 9. הכשרון עיקרי לטכניקה זו הוא שהיא אינה פולשני, יכולה להתבצע על בעלי חיים, ויכולה להוביל לזיהוי של גרורות תאים סרטניים באיברים רבים שאולי לא נקצר בדרך כלל בנתיחת 9,10. היבט חיובי אחד בvivo טכניקות הדמיה הוא שרקמת הריאה היא באין מפריע ומאפשרת לנהלים משניים כמו הטבעת פרפין או כפי שהוצג כאן, ניתוח qRT-PCR. עם זאת, בגלל qRT-PCR הוא theoretically מדד רגיש יותר של זיהוי, הערכה גולמית עשוי שלא לחשוף את המספרים נמוכים של תאי גידול הנוכחיים בריאות. אמנם שימושי, ניתן להחליף את טכניקות ההדמיה שתוארו לעיל או בתוספת שיטת qRT-PCR תיארה כרגע. יש qRT-PCR הפוטנציאל לספק מידה רגישה של mRNA הנגזר גידול בתוך ריאות.

<table><tbody><tr><td>2-מרקפטואתנול</td><td>פישר</td><td>BP176-100</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>תרמו מדעי</td><td>EN0521</td><td></td></tr><tr><td>ערכת בידוד RNA GeneJet</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0732</td><td></td></tr><tr><td>iScript שעתוק הפוך סופרמיקס עבור QRT-PCR</td><td>Bio-Rad</td><td>1708841</td><td></td></tr><tr><td>iTaq אוניברסלי SYBR ירוק סופרמיקס&nbsp;</td><td>ביו-רד</td><td>172-5121&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>בדיקה ירוקה PrimePCR SYBR: ERBB2, אנושי&nbsp;</td><td>ביו-רד</td><td>100-25636&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>תבנית PrimePCR לבדיקה ירוקה של SYBR: ERBB2, אנושי&nbsp;</td><td>ביו-ראד</td><td>100-25716&nbsp;</td><td></td></tr><tr>רצף <td></td><td></td><td>פריימר gapdh</td><td>עבור-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAACG Rev-CGCTCCTGGAAGATGGTGG</td></tr></tbody></table>

הערכה של ריאות גרורה במודלי גידול עכבר החלב על ידי בזמן אמת כמותי pcr

Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

מחלה גרורתית היא ההתפשטות של תאי גידול ממאירים מאתר הסרטן הראשוני לאיבר מרוחק, והוא הגורם העיקרי למוות הקשורים לסרטן 1. אתרים נפוצים של התפשטות גרורה כוללים ריאות, בלוטות לימפה, מוח, ועצם 2. מנגנונים המניעים את גרורות אזורים אינטנסיביים של חקר הסרטן. כתוצאה מכך, מבחני יעילים למדידת נטל גרורתי באתרים מרוחקים של גרורות הם אינסטרומנטלי לחקר הסרטן. הערכה של גרורות ריאה במודלים של גידול החלב מבוצעת בדרך כלל על ידי תצפית איכותית ברוטו של רקמת הריאה הבאה לנתיחה. שיטות כמותיות להערכת גרורות כיום מוגבלות לvivo לשעבר ובטכניקות הדמיה מבוססת vivo הדורשות פרמטרים הגדרת משתמש. רב של טכניקות אלה בכל רמת האורגניזם ולא הרמה התאית 3-6. למרות ששיטות הדמיה חדשות יותר ניצול מיקרוסקופיה רב-פוטון מסוגלות להעריך metastasis ברמה התאית 7, נהלים האלגנטיים ביותר שמתאימים יותר להערכת מנגנוני הפצה ולא הערכה כמותית של נטל גרורתי. הנה, שיטה במבחנה פשוטה להעריך כמותית גרורות מוצגת. שימוש בזמן אמת PCR (qRT-PCR), mRNA הספציפי תאים סרטניים יכול להתגלות בתוך רקמת הריאה עכבר.

מעבר לזמן שנדרש כדי לבצע את החיסון הראשוני של תאי גידול לבעלי החיים הניסיוניים ואם ביצוע, עיקרי בניתוח גידול vivo, קציר הרקמות, בידוד RNA, וניתוח qRT-PCR הוא הליך 1-2 יום (איור 1) . דוגמא לניתוח ברוטו היא ההדמיה bioluminescent להעריך תאים סרטניים בתוך רקמת הריאה. כאן, ניסוי tumorigenesis החלב בוצע כדי להעריך אם סו...

פרוטוקול זה מתאר כיצד להשתמש בזמן אמת PCR (qRT-PCR) כדי לזהות mRNA הספציפי תאים סרטניים המייצג גרורות בתוך רקמת הריאה עכבר.

הערכה של ריאות גרורה במודלי גידול עכבר החלב על ידי בזמן אמת כמותי PCR

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לזהות את הכמות של MRNA ספציפי מתאי גידול בריאה, כשיטה לניתוח גרורות. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מהווה מדד כמותי של גרורות. כדי לבצע נתיחה של גידול בריאה, לאחר הרדמה של עכבר באמצעות מנה קטלנית של isofluorine בהתאם לפרוטוקול הכתוב, הנח את העכבר על לוח ספוג על גבו כאשר הגפיים פרושות, והשתמש בסיכות נתיחה כדי לקבע אותו ללוח.לאחר ריסוס העכבר באתנול, השתמשו בפינצטה כדי לתפוס את החלק התחתון של בעל החיים במרכז, ובאמצעות מספריים, גזרו כלפי מעלה לכיוון הצוואר דרך העור, תוך הקפדה לא לנקב את חלל הפריטונאום של העכבר. כעת, תפסו את הפריטונאום בקצה התחתון של בעל החיים, והתחילו לגזור כלפי מעלה לכיוון בסיס הצוואר. גזרו בזהירות לאורך הצדדים השמאלי והימני של כלוב הצלעות, תוך הקפדה לא לקרוע כלי דם שעלולים לדמם לתוך חלל בית החזה.הסר את עצמות הצלעות על ידי חיתוך שמאלה וימינה, דרך הסרעפת והחלקים העליונים של כלוב הצלעות. לאחר מכן, בעזרת פינצטה, אחז בטרכיאה של העכבר ומשוך קדימה, והשתמש במספרי ניתוח כדי לנתק את הטרכיאה לפני הוצאת הריאות מהעכבר. השתמש ב-PBS כדי לשטוף בעדינות את רקמת הריאה.לאחר מכן, לאחר הערכה מאקרוסקופית של רקמת הריאה בהתאם לפרוטוקול הכתוב, אם יש לנתח את הריאות באופן מיידי, יש להמשיך לבידוד RNA. כדי לבודד RNA מרקמה, התחילו בהומוגניזציה של הרקמה באמצעות אחת השיטות המפורטות בפרוטוקול הכתוב. הכינו באפר ליזיס (lysis buffer) מקיט לבידוד RNA, והוסיפו 20 µL של tumor captoethanol לכל 1 mL של באפר ליזיס.יש להשעות כל 30 גרם של רקמה ב-300 מיקרוליטר של בופר ליזיס, ולבצע סוניקציה לרקמה למשך 10 שניות באמצעות סוניקטור המכוון ל-30% amplitude. יש להוסיף 10 מיקרוליטר של protinase K ל-590 מיקרוליטר של בופר TE, ולהוסיף 600 מיקרוליטר מהבופר ל-300 מיקרוליטר של רקמה שעברה סוניקציה. יש להדגיר בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.בשלב הבא, סבבו את הדגימות בצנטריפוגה במהירות של 13,000 ×g ומעלה למשך 10 דקות כדי להסיר את השאריות. לאחר מכן, העבירו את הנוזל העליון למבחנות חדשות. הוסיפו 450 µL של אתנול לכל 900 µL של נוזל עליון כדי להשקיע את ה-RNA.לאחר מכן, העבירו 700 µL מתערובת הליזאט והאתנול לעמודת RNA. סובבו שוב במהירות של 13,000 ×g ומעלה למשך דקה אחת כדי לקשור את ה-RNA לעמודה. לאחר מכן, השליכו את השאריות הנוזליות, הוסיפו את supernatant שנותר לעמודה, וסובבו שוב.בשלב הבא, יש להוסיף 350 µL של wash buffer one לחלק העליון של העמודה, ולסובב את הדגימות בצנטריפוגה למשך 30 שניות. יש לשפוך את השאריות הנוזליות ולהחזיר את העמודה לשפופרת. יש להכין DNase על ידי ערבוב של five units של אנזים DNase one עם 5 µL של 10X DNase buffer, ו-40 µL של DNase RNase free water עבור כל דגימה.הוסיפו 50 µL של תערובת DNase לכל עמודה, והדגירו בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. לאחר מכן, הוסיפו 350 µL של wash buffer one לעמודות וסובבו את הדגימות בצנטריפוגה למשך 30 שניות. לאחר ריקון תמיסת הפסולת, הוסיפו 600 µL של wash buffer two, וסובבו למשך 30 שניות נוספות.יש להסיר את הנוזל לפני הוספת 250 µL של wash buffer two, ולאחר מכן לסובב בצנטריפוגה למשך שתי דקות. העבירו את העמודה לשפופרת איסוף חדשה, והוסיפו לעמודה 50 עד 100 µL של מים נקיים מ-RNase ו-DNase. לאחר דקת דגירה, סובבו בצנטריפוגה למשך דקה אחת.העבירו שוב את התסנין שנאסף דרך העמודה כדי להגדיל את תנובת ה-RNA. לשימוש מיידי, שמרו את הדגימות על קרח. לשימוש מאוחר יותר, בצעו הקפאה מהירה (snap freeze) בקרח יבש או בחנקן נוזלי, ואחסנו בטמפרטורה של minus 80 degrees Celsius עד למועד השימוש.בעזרת ספקטרופוטומטר, קבעו את כמות ה-RNA. לאחר מכן, במבחנות או פלטות PCR סטריליות נקיות מ-RNase ו-DNase, השתמשו ב-0.5 עד 2 מיקרוגרם של RNA כולל כדי להכין את תערובת התגובה עבור התסנתזה הראשונה, כפי שמוצג בטבלה זו. ערבבו, סובבו בעדינות בצנטריפוגה, ותכנתו מכונת PCR סטנדרטית באמצעות התוכנית המוצגת כאן.בסיום התגובה, השתמש במים סטריליים נקיים מנוקלאז כדי לדלל את התגובה המוכנה לנפח הרצוי. לביצוע real time PCR, השתמש ב-cDNA של ביקורת חיובית, כגון HER2 אנושי, להקמת עקום סטנדרט עבור כל סט פריימרים, על ידי הכנת אחת עד ארבע דלולות סדרתיות של ה-cDNA ליצירת חמישה סטנדרטים. לאחר מכן, חשב את מספר הדגימות הכולל, שצריך לכלול את עקום הסטנדרט ואת הדגימות הניסוייות.לאחר מכן, בתוך מבחנות סטריליות נקיות מ-RNase ו-DNase, הכין תערובת מאסטר (master mix) עבור כל גן עניין ניסויי, וכן עבור בקרת פנימית, כגון gapdh. הכן פלטת בדיקה המכילה 1 µL של C DNase עבור כל דגימה סטנדרטית או ניסוית. הקצה לפחות דגימת C DNA אחת לבאר, עבור כל צמד פריימר ופרוב.הוסיפו 19 µL של תערובת מאסטר (mastermix) לכל באר, עבור כל צמד פריימר ופרוב. ניסוי ביולומינצנציה זה מדגים כי ריאות עכבר שטופלו ב-ACT1, המכוון לחלבון gap junction שנקרא Connexin 43, נראות שליליות לפעילות לוסיפראז, מה שמעיד על היעדר תאי גידול ברקמה. עם זאת, ניתוח של חתכי H&E של רקמת הריאה מראה מיקרו-מטסטזות שלא הוארו על ידי לוסיפראז, מה שמרמז כי דימות לוסיפראז אינו רגיש מספיק כדי לזהות מספרים נמוכים של תאי גידול.מוצגות כאן התוצאות מניסוי qRT-PCR, תוך שימוש בגשושית (probe) ספציפית ל-HER2, לצורך זיהוי תאי גידול אנושיים מסוג HER2 plus JIMT1 ברקמת ריאה של תאים שהושתלו במקור ברפידת השומן של הזיכרון (memory fat pad) בעכבר. למרות שלא נצפו גרורות נראות לעין באף אחת מהריאות, בשניים מתוך 11 הדגימות, qRT-PCR זיהה גרורות. באיור זה, הוכנה אנליזת עקומת סטנדרט כדי לקבוע את רמות ה-HER2 היחסיות, שנורמלו ל-gapdh של ריאת עכבר בסדרה של מספר תאים.התוצאות מעידות על כך שבדיקת ה-qRT-PCR, תוך שימוש בגשש HER2, הייתה רגישה מספיק כדי לזהות רמות HER2 כבר ב-10 תאים בלבד. לבסוף, ניתוח רגרסיה זה מציג את מספר התאים היחסי בכל דגימה של ריאה, כולל הביקורות החיוביות והשליליות. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו בתוך שש עד שמונה שעות, במידה והיא מבוצעת כראוי.בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לנקוט באמצעי זהירות כדי לשמור על שלמות ה-RNA במהלך בידוד ה-RNA ותגובת ה-reverse transcriptase. לאחר צפייה בסרטון זה, תגמירו להבנה טובה של אופן זיהוי גרורות ברקמת ריאה שלמה, באמצעות quantitative real time PCR.

evaluation-lung-metastasis-mouse-mammary-tumor-models-quantitative

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

מודל orthotopic זה של סרטן הערמונית אנושי מאפשר כימות של גודל גידול, תאים סרטניים במחזור, והיווצרות של גרורות שונות לריאות. ככל שתאים חייבים לברוח האיבר העיקרי, להזין את זרם הדם, ולהשתיל לאתר משניים, מודל זה ביעילות משחזר את התרחיש בבני אדם.

מודל Murine orthotopic של אדם סרטן ערמונית גרורה

מטרת פרוטוקול זה היא לחקור גידולי שד. בטכניקה זו מסירים גידולי שד של עכברים ומכינים תאים ראשוניים מגידולים. פרוטוקול מיצוי ריאות כלול לחקר גרורות ריאות. יתר על כן, כלול פרוטוקול נוסף לניתוח פיברובלסטים עובריים של עכברים מעובר העכבר.

גידול ראשוני ובידוד תא MEF לחקר ריאות גרורה

אנו מתארים שיטה לזיהוי התפתחות קשריות גידול בריאות של מודל עכבר אדנוקרצינומה באמצעות טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת והשימוש בה לניטור שינויים בגודל הגוש לאורך זמן ובתגובה לטיפול. דיוק ההערכה אושר באמצעות כימות היסטולוגי של נקודת הקצה.

באמצעות טומוגרפיה מיקרו שחושבת הערכת התפתחות גידול ומעקב של תגובה לטיפול במודל עכברי של סרטן הריאות

כאן אנו מתארים את המודל והגישה לחקר הפונקציות של מקרופאגים מכתשית ריאתית בגרורות סרטניות. כדי להדגים את תפקידם של תאים אלה בגרורות, נעשה שימוש במודל הסינגני (4T1) של סרטן השד בשילוב עם דלדול המקרופאגים המכתשית עם ליפוזומים קלודרונאטיים.

לומד את התפקיד של מכתשיים מקרופאגים סרטן שד גרור

מודלים פרה-קליניים המעריכים טיפול אדג'ובנטי למיקוד גרורות לסרטן השד נעדרים. כדי להתמודד עם זה, פיתחנו מודל Murine של novo ריאתי אדמוקרצינומה החלב ריאתי, שבו טיפולים שניתנו הגדרה אדג'ובנטית (כריתה כירורגית לאחר ניתוח) ניתן להעריך את היעילות להשפיע על גרורות בעבר ריאתי seeded.

כירורגית נהלים ומתודולוגיה עבור מודל Murlin פרה קלינית של דה נובו גרורות סרטן החלב

מטרת מאמר זה היא לספק תיאור מפורט של הפרוטוקול וזמינותו גרורות בריאות (פומה). מודל זה מאפשר לחוקרים ללמוד אוסטאוסרקומה גרורתי (OS) גידול תאים של רקמת הריאה באמצעות קרינה פלואורסצנטית widefield או מיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר.

שיקולים מעשיים בלימוד כיבוש ריאות גרורתי אוסטאוסרקומה באמצעות וזמינותו גרורות בריאות

אנחנו מציגים את orthotopic מאתר השד סרטן ומודל כריתה רדיקלית בטכנולוגיה ביולומינסנציה לכמת את נטל הגידול לחקות התקדמות סרטן השד אנושי.

יצירת מודל של סרטן שד גרורתי Orthotopic מאתר וביצוע מאתר כריתה רדיקלית

עבודה זו מוגדרות מראש פרוטוקול מתקדם כדי להעריך במדויק את טעינת הגידול על ידי זיהוי של חלבון פלורסנט ירוק אותות biלומינסנציה, כמו גם שילוב של טכניקת גילוי מולקולרי כמותי.

לומדת משולשת סרטן השד שלילי באמצעות אורתובנושא שד סרטן השד מודל

הגישה המתוארת משלבת הזנב הנסיוני גרורות מוסר עם הדמיה vivo live בעלי חיים כדי לאפשר ניטור בזמן אמת של גרורות סרטן השד היווצרות וצמיחה בנוסף לקוונפיקציה של מספר גרורות וגודל בריאות.

שימוש משולב של הזנב וריד גרורה Assays ובזמן אמת ב Vivo הדמיה כדי לכמת מושבת סרטן השד ונטל בריאות

הזרקה תוך ורידי של תאים סרטניים משמשת לעתים קרובות במחקר גרורות, אבל נטל הגידול גרורתי יכול להיות קשה לנתח. כאן, אנו מדגימים מודל הזרקת וריד זנב של גרורות וכוללים גישה חדשנית לניתוח נטל גידול הריאות גרורתי שנוצר.

ניתוח פתולוגי של גרורות ריאות בעקבות הזרקת וריד זנב לרוחב של תאים סרטניים

כתב היד מתאר מתודולוגיה להקמה וכן ניטור גדילה אורכי של גרורות ריאה ספונטניות מגידולי שד בהזרקה אורתוטופית, הניתנת להתערבות בכל שלבי המפל הגרורתי.

ב Vivo הדמיה למדידת גרורות ריאה ספונטניות של תאי גידול שד בהזרקה אורתוטופית

למד כיצד לזהות ולכמת mRNA ספציפי מתאי גידול בריאות עכבר באמצעות QRT-PCR בזמן אמת. שיטה זו מספקת מדידה כמותית מדויקת של ריאות גרורה במודלים אונקולוגיים.

הערכה של ריאות גרורה במודלי גידול עכבר החלב על ידי בזמן אמת כמותי PCR

גלה סרטונים נוספים