הערכה של ריאות גרורה במודלי גידול עכבר החלב על ידי בזמן אמת כמותי PCR

המטרה הכוללת של הליך זה היא לזהות את הכמות של MRNA ספציפי מתאי גידול בריאה, כשיטה לניתוח גרורות. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מהווה מדד כמותי של גרורות. כדי לבצע נתיחה של גידול בריאה, לאחר הרדמה של עכבר באמצעות מנה קטלנית של isofluorine בהתאם לפרוטוקול הכתוב, הנח את העכבר על לוח ספוג על גבו כאשר הגפיים פרושות, והשתמש בסיכות נתיחה כדי לקבע אותו ללוח.

לאחר ריסוס העכבר באתנול, השתמשו בפינצטה כדי לתפוס את החלק התחתון של בעל החיים במרכז, ובאמצעות מספריים, גזרו כלפי מעלה לכיוון הצוואר דרך העור, תוך הקפדה לא לנקב את חלל הפריטונאום של העכבר. כעת, תפסו את הפריטונאום בקצה התחתון של בעל החיים, והתחילו לגזור כלפי מעלה לכיוון בסיס הצוואר. גזרו בזהירות לאורך הצדדים השמאלי והימני של כלוב הצלעות, תוך הקפדה לא לקרוע כלי דם שעלולים לדמם לתוך חלל בית החזה.

הסר את עצמות הצלעות על ידי חיתוך שמאלה וימינה, דרך הסרעפת והחלקים העליונים של כלוב הצלעות. לאחר מכן, בעזרת פינצטה, אחז בטרכיאה של העכבר ומשוך קדימה, והשתמש במספרי ניתוח כדי לנתק את הטרכיאה לפני הוצאת הריאות מהעכבר. השתמש ב-PBS כדי לשטוף בעדינות את רקמת הריאה.

לאחר מכן, לאחר הערכה מאקרוסקופית של רקמת הריאה בהתאם לפרוטוקול הכתוב, אם יש לנתח את הריאות באופן מיידי, יש להמשיך לבידוד RNA. כדי לבודד RNA מרקמה, התחילו בהומוגניזציה של הרקמה באמצעות אחת השיטות המפורטות בפרוטוקול הכתוב. הכינו באפר ליזיס (lysis buffer) מקיט לבידוד RNA, והוסיפו 20 µL של tumor captoethanol לכל 1 mL של באפר ליזיס.

יש להשעות כל 30 גרם של רקמה ב-300 מיקרוליטר של בופר ליזיס, ולבצע סוניקציה לרקמה למשך 10 שניות באמצעות סוניקטור המכוון ל-30% amplitude. יש להוסיף 10 מיקרוליטר של protinase K ל-590 מיקרוליטר של בופר TE, ולהוסיף 600 מיקרוליטר מהבופר ל-300 מיקרוליטר של רקמה שעברה סוניקציה. יש להדגיר בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.

בשלב הבא, סבבו את הדגימות בצנטריפוגה במהירות של 13,000 ×g ומעלה למשך 10 דקות כדי להסיר את השאריות. לאחר מכן, העבירו את הנוזל העליון למבחנות חדשות. הוסיפו 450 µL של אתנול לכל 900 µL של נוזל עליון כדי להשקיע את ה-RNA.

לאחר מכן, העבירו 700 µL מתערובת הליזאט והאתנול לעמודת RNA. סובבו שוב במהירות של 13,000 ×g ומעלה למשך דקה אחת כדי לקשור את ה-RNA לעמודה. לאחר מכן, השליכו את השאריות הנוזליות, הוסיפו את supernatant שנותר לעמודה, וסובבו שוב.

בשלב הבא, יש להוסיף 350 µL של wash buffer one לחלק העליון של העמודה, ולסובב את הדגימות בצנטריפוגה למשך 30 שניות. יש לשפוך את השאריות הנוזליות ולהחזיר את העמודה לשפופרת. יש להכין DNase על ידי ערבוב של five units של אנזים DNase one עם 5 µL של 10X DNase buffer, ו-40 µL של DNase RNase free water עבור כל דגימה.

הוסיפו 50 µL של תערובת DNase לכל עמודה, והדגירו בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. לאחר מכן, הוסיפו 350 µL של wash buffer one לעמודות וסובבו את הדגימות בצנטריפוגה למשך 30 שניות. לאחר ריקון תמיסת הפסולת, הוסיפו 600 µL של wash buffer two, וסובבו למשך 30 שניות נוספות.

יש להסיר את הנוזל לפני הוספת 250 µL של wash buffer two, ולאחר מכן לסובב בצנטריפוגה למשך שתי דקות. העבירו את העמודה לשפופרת איסוף חדשה, והוסיפו לעמודה 50 עד 100 µL של מים נקיים מ-RNase ו-DNase. לאחר דקת דגירה, סובבו בצנטריפוגה למשך דקה אחת.

העבירו שוב את התסנין שנאסף דרך העמודה כדי להגדיל את תנובת ה-RNA. לשימוש מיידי, שמרו את הדגימות על קרח. לשימוש מאוחר יותר, בצעו הקפאה מהירה (snap freeze) בקרח יבש או בחנקן נוזלי, ואחסנו בטמפרטורה של minus 80 degrees Celsius עד למועד השימוש.

בעזרת ספקטרופוטומטר, קבעו את כמות ה-RNA. לאחר מכן, במבחנות או פלטות PCR סטריליות נקיות מ-RNase ו-DNase, השתמשו ב-0.5 עד 2 מיקרוגרם של RNA כולל כדי להכין את תערובת התגובה עבור התסנתזה הראשונה, כפי שמוצג בטבלה זו. ערבבו, סובבו בעדינות בצנטריפוגה, ותכנתו מכונת PCR סטנדרטית באמצעות התוכנית המוצגת כאן.

בסיום התגובה, השתמש במים סטריליים נקיים מנוקלאז כדי לדלל את התגובה המוכנה לנפח הרצוי. לביצוע real time PCR, השתמש ב-cDNA של ביקורת חיובית, כגון HER2 אנושי, להקמת עקום סטנדרט עבור כל סט פריימרים, על ידי הכנת אחת עד ארבע דלולות סדרתיות של ה-cDNA ליצירת חמישה סטנדרטים. לאחר מכן, חשב את מספר הדגימות הכולל, שצריך לכלול את עקום הסטנדרט ואת הדגימות הניסוייות.

לאחר מכן, בתוך מבחנות סטריליות נקיות מ-RNase ו-DNase, הכין תערובת מאסטר (master mix) עבור כל גן עניין ניסויי, וכן עבור בקרת פנימית, כגון gapdh. הכן פלטת בדיקה המכילה 1 µL של C DNase עבור כל דגימה סטנדרטית או ניסוית. הקצה לפחות דגימת C DNA אחת לבאר, עבור כל צמד פריימר ופרוב.

הוסיפו 19 µL של תערובת מאסטר (mastermix) לכל באר, עבור כל צמד פריימר ופרוב. ניסוי ביולומינצנציה זה מדגים כי ריאות עכבר שטופלו ב-ACT1, המכוון לחלבון gap junction שנקרא Connexin 43, נראות שליליות לפעילות לוסיפראז, מה שמעיד על היעדר תאי גידול ברקמה. עם זאת, ניתוח של חתכי H&E של רקמת הריאה מראה מיקרו-מטסטזות שלא הוארו על ידי לוסיפראז, מה שמרמז כי דימות לוסיפראז אינו רגיש מספיק כדי לזהות מספרים נמוכים של תאי גידול.

מוצגות כאן התוצאות מניסוי qRT-PCR, תוך שימוש בגשושית (probe) ספציפית ל-HER2, לצורך זיהוי תאי גידול אנושיים מסוג HER2 plus JIMT1 ברקמת ריאה של תאים שהושתלו במקור ברפידת השומן של הזיכרון (memory fat pad) בעכבר. למרות שלא נצפו גרורות נראות לעין באף אחת מהריאות, בשניים מתוך 11 הדגימות, qRT-PCR זיהה גרורות. באיור זה, הוכנה אנליזת עקומת סטנדרט כדי לקבוע את רמות ה-HER2 היחסיות, שנורמלו ל-gapdh של ריאת עכבר בסדרה של מספר תאים.

התוצאות מעידות על כך שבדיקת ה-qRT-PCR, תוך שימוש בגשש HER2, הייתה רגישה מספיק כדי לזהות רמות HER2 כבר ב-10 תאים בלבד. לבסוף, ניתוח רגרסיה זה מציג את מספר התאים היחסי בכל דגימה של ריאה, כולל הביקורות החיוביות והשליליות. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו בתוך שש עד שמונה שעות, במידה והיא מבוצעת כראוי.

בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לנקוט באמצעי זהירות כדי לשמור על שלמות ה-RNA במהלך בידוד ה-RNA ותגובת ה-reverse transcriptase. לאחר צפייה בסרטון זה, תגמירו להבנה טובה של אופן זיהוי גרורות ברקמת ריאה שלמה, באמצעות quantitative real time PCR.