הערכה של ריאות גרורה במודלי גידול עכבר החלב על ידי בזמן אמת כמותי PCR

המטרה הכוללת של הליך זה היא לזהות את הכמות של MRNA ספציפי מתאי גידול בריאה, כשיטה לניתוח גרורות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שמדובר במדד כמותי של גרורות. כדי לבצע דיסקציה של גידול ריאה, לאחר המתת חסד של עכבר באמצעות מינון קטלני של איזופלואור על פי פרוטוקול הטקסט, הנח את העכבר על לוח קצף על גבו כשהגפיים מפושקות, והשתמש בסיכות חיתוך כדי להדק אותו ללוח.

לאחר השימוש באתנול לריסוס העכבר, השתמש במלקחיים כדי לתפוס את החלק התחתון של החיה במרכז, ובעזרת מספריים, חתוך כלפי מעלה לכיוון הצוואר דרך העור, היזהר לא לנקב את חלל הצפק של העכבר. כעת, תפסו את הצפק בקצה התחתון של החיה, והתחילו לחתוך כלפי מעלה לכיוון בסיס הצוואר. יש לחתוך בזהירות לאורך הצד השמאלי והימני של כלוב הצלעות, תוך הקפדה לא לחתוך כלי דם שעלולים לדמם לתוך חלל בית החזה.

הסר את עצמות הצלעות על ידי חיתוך שמאלה וימינה, דרך הסרעפת והחלקים העליונים של כלוב הצלעות. לאחר מכן, בעזרת מלקחיים, תפסו את קנה הנשימה של העכבר ומשכו קדימה, והשתמשו במספריים לדיסקציה כדי לחתוך את קנה הנשימה לפני הוצאת הריאות מהעכבר. השתמש ב-PBS כדי לשטוף בעדינות את רקמת הריאה.

לאחר מכן, לאחר הערכה גסה של רקמת הריאה על פי פרוטוקול הטקסט, אם יש לנתח את הריאות באופן מיידי, המשך לבידוד RNA. כדי לבודד RNA מרקמה, התחל בהומוגניזציה של הרקמה באחת מהשיטות המפורטות בפרוטוקול הטקסט. הכן מאגר ליזה מערכת בידוד RNA, והוסף 20 מיקרוליטר של קפטואתנול גידול לכל מיליליטר של מאגר ליזה.

השעו מחדש כל 30 גרם רקמה ב-300 מיקרוליטר של מאגר ליזה, ועם סוניקטור המוגדר במשרעת של 30%, סוניקטור את הרקמה למשך 10 שניות. הוסף 10 מיקרוליטר של פרוטינאז K ל-590 מיקרוליטר של מאגר TE, והוסף 600 מיקרוליטר של המאגר ל-300 מיקרוליטר של רקמה סוניקטיבית. דוגרים בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.

לאחר מכן, צנטריפוגה את הדגימות בגודל גדול או שווה ל-13,000 פעמים G למשך 10 דקות כדי להסיר את הפסולת. לאחר מכן העבירו את הסופרנטנט לצינורות חדשים. הוסף 450 מיקרוליטר אתנול לכל 900 מיקרוליטר של סופרנטנט כדי לזרז את ה-RNA.

לאחר מכן העבירו 700 מיקרוליטר מתערובת אתנול הליזאט לעמוד RNA. סובב שוב בגדול או שווה ל-13, 000 פעמים G למשך דקה אחת כדי לקשור את ה-RNA לעמודה. לאחר מכן השליכו את הפסולת הנוזלית, והוסיפו את הסופרנטנט הנותר לעמודה, וסובבו שוב.

לאחר מכן, הוסף 350 מיקרוליטר של מאגר כביסה אחד לחלק העליון של העמודה, וצנטריפוגה את הדגימות למשך 30 שניות. השלך את הפסולת הנוזלית והחלף את העמודה בצינור. הכן DNase על ידי ערבוב חמש יחידות של DNase אנזים אחד עם חמישה מיקרוליטרים של מאגר DNase 10X, ו-40 מיקרוליטר של מים ללא DNase RNase עבור כל דגימה.

מוסיפים 50 מיקרוליטר תערובת DNase לכל עמודה, ודוגרים בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. לאחר מכן הוסף 350 מיקרוליטר של מאגר כביסה אחד לעמודות וצנטריפוגה את הדגימות למשך 30 שניות. לאחר השלכת תמיסת הפסולת, הוסיפו 600 מיקרוליטר של מאגר כביסה שניים, וסובבו למשך 30 שניות נוספות.

השליכו את הנוזל לפני הוספת 250 מיקרוליטר של מאגר כביסה שניים, ואז סובבו במשך שתי דקות. העבירו את העמוד לצינור איסוף חדש, והוסיפו לעמודה 50 עד 100 מיקרוליטר מים ללא RNase DNase. לאחר דגירה של דקה, סובב במשך דקה.

הפעל מחדש את הפליטה שנאספה דרך העמודה כדי להגדיל את תפוקת ה-RNA. לשימוש מיידי, שמור את הדגימות על קרח. לשימוש מאוחר יותר, יש להקפיא על קרח יבש או חנקן נוזלי, ולאחסן בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס עד הצורך.

בעזרת ספקטרופוטומטר, כמת את ה-RNA. לאחר מכן, בצינורות או צלחות PCR סטריליים ללא RNase DNase, השתמש ב-0.5 עד 2 מיקרוגרם של RNA כולל כדי להכין את תערובת התגובה לטרנסינתזה ראשונה, כפי שמוצג בטבלה זו. מערבבים, וצנטריפוגה בעדינות, ומתכנתים מכונת PCR סטנדרטית באמצעות התוכנית המוצגת כאן.

לאחר השלמת התגובה, השתמש במים סטריליים ונטולי נוקלאז כדי לדלל את התגובה המוגמרת לנפח הרצוי. כדי לבצע PCR בזמן אמת, השתמש ב-DNA C בקרה חיובית, כגון HER2 אנושי, כדי להגדיר עקומה סטנדרטית עבור כל ערכת פריימר על ידי הכנת דילול סדרתי אחד עד ארבעה של ה-DNA C ליצירת חמישה תקנים. לאחר מכן, חשב את מספר הדגימה הכוללת, שאמור לכלול את העקומה הסטנדרטית ודגימות ניסוי.

לאחר מכן, בצינורות סטריליים ללא RNase DNase, הכינו תערובת מאסטר לכל גן ניסיוני מעניין, כמו גם בקרה פנימית, כגון gapdh. הכן לוחית בדיקה המכילה מיקרוליטר אחד של C DNase עבור כל דגימה סטנדרטית או ניסיונית. הקצו לפחות דגימת DNA C אחת לכל באר, עבור כל בדיקת פריימר.

הוסף 19 מיקרוליטר של מאסטרמיקס לבאר, עבור כל בדיקת פריימר. ניסוי ביולומינסנציה זה מדגים כי ריאות עכבר שטופלו ב-ACT1, המכוון לחלבון צומת הפער Connexin 43, נראות שליליות לפעילות לוציפראז, מה שמרמז על היעדר תאי גידול ברקמה. עם זאת, ניתוח של קטעי H&E של רקמת הריאה מראה מיקרו-גרורות שלא הוארו על ידי לוציפראז, מה שמצביע על כך שהדמיית לוציפראז אינה רגישה מספיק כדי לזהות מספר נמוך של תאי גידול.

מוצגות כאן התוצאות מניסוי qRT-PCR, תוך שימוש בבדיקה ספציפית ל-HER2, כדי לזהות תאי גידול HER2 ו-JIMT1 אנושיים ברקמת הריאה מתאים שהושתלו במקור בכרית השומן של זיכרון העכבר. למרות שלא נצפו גרורות גלויות באף אחת מהריאות, בשתיים מתוך 11 הדגימות, qRT-PCR זיהה גרורות. באיור זה, הוכן ניתוח עקומה סטנדרטי כדי לקבוע את רמות ה-HER2 היחסיות המנורמלות לפער ריאות של עכבר בסדרת מספרי תאים.

התוצאות מצביעות על כך שה-qRT-PCR, באמצעות בדיקת HER2, היה רגיש מספיק כדי לזהות רמות HER2 ב-10 תאים בלבד. לבסוף, ניתוח רגרסיה זה מציג את מספר התאים היחסי בכל דגימת ריאה, כולל הבקרות החיוביות והשליליות. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שש עד שמונה שעות, אם מבוצעת כראוי.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לנקוט באמצעי זהירות כדי לשמור על שלמות ה-RNA במהלך בידוד RNA ותגובת טרנסקריפטאז הפוכה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לזהות גרורות ברקמת ריאה שלמה, על ידי PCR כמותי בזמן אמת.