הקרינה ופליטת אור הדמיה של Ca subcellular ^{2 +} בבני נוירונים בהיפוקמפוס

המטרה הכוללת של הליך זה היא לחקור שיפוץ סידן במוח המזדקן באמצעות הדמיה פלואורסצנטית וביו-לומינסנציה של סידן ציטוזולי ומיטוכונדריאלי בתרביות ארוכות טווח של נוירונים בהיפוקמפוס, הנחשב כמודל להזדקנות עצבית. שיטה זו יכולה לעזור להבין שאלות מפתח בתחום ההזדקנות, כגון כיצד שיפוץ של סידן תוך-תאי תורם לאקסיטוטוקסיות ולנזק לנוירונים, שניהם קשורים לעומס יתר של סידן. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לעקוב מקרוב אחר שיפוץ סידן בנוירונים בודדים באמצעות תרביות ב-DYS שונות במבחנה מאותה שכפול דגימה של טכניקה זו דרך או טיפול בשבץ מוחי או במחלת תא me מכיוון שהיא משתנה מטרה חדשה הקשורה לעומס יתר של סידן במחלות הקשורות לסוכן זה.

לאחר צפייה בסרטון זה, ישוע מבין היטב כיצד לבצע הדמיית פלואורסצנטיות וזיכרונות של סידן ציטוזולי ומיטוכונדריאלי בתרביות לטווח קצר וארוך של נוירונים בהיפוקמפוס של חולדות. כדי להתחיל בהליך זה, חלקו את החלקות הכיסוי על רצועת פרפורם בצלחת פטרי. לאחר מכן יש למרוח 200 מיקרוליטר של פולי D ליצין במיליגרם אחד למיליליטר על כל החלקת כיסוי ולטפל למשך הלילה.

למחרת שטפו את הכיסוי במים סטריליים מזוקקים כפולים כל 15 דקות למשך 90 דקות בתנאים סטריליים. הנח את החלקות הכיסוי במולטי ושמור אותן באינקובטור לח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 עד לשימוש. כדי לבודד את תאי העצב בהיפוקמפוס, פתחו את הגולגולת של גורי החולדות שזה עתה נולדו בעזרת מספריים סטריליים, חלצו את המוח בעזרת מרית ושטפו אותו במהירות במדיום F 12 של חזיר.

לאחר מכן בצע חתך אלכסוני עם האזמל בכל חצי כדור והעביר אותו לצלחת פטרי המכילה בשר חזיר F 12 בינוני מתחת למיקרוסקופ. השליכו את קרומי המוח. זהה בזהירות את ההיפוקמפוס במיקום קעור אופייני מעל קליפת המוח.

לאחר מכן הפרידו את ההיפוקמפוס מקליפת המוח על ידי משיכתו בזהירות והסרתו באמצעות מספריים לעיניים. לאחר מכן, העבירו את חתיכות ההיפוקמפוס לבקבוקון המכיל 1.8 מיליליטר של תמיסת פפאן מסוננת מראש. דגרו אותם בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם ניעור עדין מדי פעם למשך 15 דקות.

לאחר מכן הוסיפו 90 מיקרוליטר של תמיסה אחת של DNA. מוסיפים 50 מיקרוגרם למיליליטר ודוגרים אותם למשך 15 דקות נוספות. לאחר מכן, העבירו את הרקמה לצינור צנטריפוגה של 10 מיליליטר ושטפו את השברים במדיום תרבית נוירו-בסיסי טרי.

השג תרחיף תאים על ידי העברת שברי הרקמה דרך פיפטה מפלסטיק של חמישה מיליליטר. לאחר מכן, צנטריפוגה את מתלה התאים ב -160 גרם למשך חמש דקות. לאחר מכן, הסר את הסופינאט באמצעות פיפטת מרעה סטרילית מפלסטיק ותלה את הגלולה בזהירות במיליליטר אחד של מדיום תרבית נוירו-בסיסי עם פיפטה אוטומטית של מיליליטר אחד.

לאחר מכן, מדוד את צפיפות התאים באמצעות תא ספירת נויבאואר. הוסף 10 מיקרוליטר של תרחיף תאים וספור את מספר התאים מתחת למיקרוסקופ. לאחר מכן בצע חישובים מתאימים כדי להשיג 40 עד 80 מיקרוליטר של תרחיף תאים, המכיל כ -30,000 תאים.

בצלחת ארבע הבארות המכילה 500 מיקרוליטר של מדיום נוירו-בסיסי, שיחקו כ-30,000 תאים לכל באר המכילה החלקות כיסוי זכוכית. שמור אותם באינקובטור במשך יומיים עד חמישה ימים במבחנה עבור נוירונים צעירים או יותר מ-15 ימים במבחנה עבור נוירונים מבוגרים. בהליך זה, דגרו על התאים עם פחות מ-2:00 לפנות בוקר למשך 60 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.

לאחר מכן העבירו את החלקות הכיסוי לתא השפע. לאחר מכן, הנח את תא השפע עם החלקת הכיסוי במחזיק על המיקרוסקופ ההפוך. בחר את השדה המיקרוסקופי והחדיר את התאים ברציפות עם HBS חם מראש.

לאחר מכן, epi מאיר את התאים ב-340 ו-380 ננומטר. לחלופין, הקלט את האור הנפלט ב-520 ננומטר כל חמש עד 10 שניות עם מצלמת פלורסנט, המסוננת על ידי מראה פירה 2 דיאק. כדי לנתח את התמונות הפלואורסצנטיות המוקלטות, פתח תחילה את קובץ הניסוי באמצעות תוכנת Aqua Cosmos, לחץ על יחס ובחר את טווח היחס הרצוי.

חשב את יחס הפיקסל לפי פיקסל בתמונות המתקבלות על מנת לקבל רצף של תמונות יחס. לאחר מכן הפחיתו את הרקע על ידי התאמת כפתור חיסול הרקע. לאחר מכן לחץ על התחל חישוב.

לאחר מכן, לחץ על כפתור רצף כל הזמנים ומחק את החזר ה-ROI העתיק לניתוח כמותי של תאים בודדים. קבע החזר ROI חדש או החזר ROI המתאים לנוירונים הבודדים. כדי לשרטט גרף של ההקלטות הבודדות, ייצא את ערכי הקרינה היחסיים המתאימים לכל החזר ROI לתוכנית מעבדת Origin על ידי לחיצה על גרף.

לאחר מכן לחץ על חשב ושמור את קובץ ה-TXT. לאחר מכן, בצע את החישוב המתאים להערכת גודל העלייה ביחס הקרינה בתגובה לכל גירוי להעברת נוירונים מתורבתים עם הפלסמיד המוטנטי של MIT. ראשית, הכינו 50 מיקרוליטר של תמיסה A המכילה מגיב טרנספקציה בבקבוקון.

לאחר מכן, הכינו 50 מיקרוליטר של תמיסה B המכילה פלסמיד MIT ute בבקבוקון. הוסף תמיסה B לתמיסה A ודגירה למשך 20 דקות. לאחר מכן העבירו את פתקי הכיסוי המכילים נוירונים בהיפוקמפוס לצלחות מרובות חדשות המכילות 200 מיקרוליטר של TF נוירו-בסיסי טרי. לאחר מכן הוסיפו 100 מיקרוליטר של תמיסה A ו-B טיפה אחר טיפה על כל החלקת כיסוי ודגרו למשך 30 דקות.

לאחר 30 דקות, הסר את המדיום. שוטפים את התאים עם tf נוירו-בסיסי טרי. לאחר ההחזרה, הכיסוי מחליק למדיום התרבית הנוירו-בסיסי המקורי ומתרבית את התאים למשך 24 שעות לאחר הטרנספקציה כדי לאפשר ביטוי ומיקוד יעילים של הבדיקה.

לאחר מכן, הוסף ארבעה מיקרוליטר של חומר איטום TEREZIN N ל -200 מיקרוליטר של HBS כדי לתת ריכוז סופי של ארבע מיקרומולר. מערבבים בעדינות ומודגרים במשך שעתיים בטמפרטורת החדר בחושך. לאחר שעתיים, העבירו את הכיסוי לתא הזלוף ועיינו ברציפות בתמיסת HBS חמה מראש.

כדי להקליט את תמונות הביו-לומינסנציה של ריכוז הסידן המיטוכונדריאלי, בחר את השדה המיקרוסקופי המכיל את התאים המבטאים APO corin כפי שמוצג על ידי פליטת הקרינה. לאחר מכן, כבה את אור המיקרוסקופ. הסר את התיבה המכילה את הדיכרואית הממוקמת בנתיב האור.

לאחר מכן כבה את אור העירור וסגור את הקופסה הכהה לחושך מוחלט. לחלחל את התאים במדיום HBS, עם או בלי תמיסות בדיקה שחוממו מראש ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן צלם את תמונות הפליטה הפוטונית כל 10 שניות עם מצלמת ספירת פוטונים המטופלת במעבד תמונה.

לאחר מכן, הוסף חפירה כדי לשחרר את כל הפוטונים הנותרים כדי לנתח תמונות ביולומינסנט המשקפות סידן מיטוכונדריאלי. פתח את תמונת הקרינה של GFP. בחר החזר השקעה בודד על ידי ציור סביב התאים שעברו טרנספטציה.

לאחר מכן העתק והדבק את אותם החזר ROI על כל תמונה ברצף. צילומי מסך. לאחר מכן, ייצא את ערכי הפליטה הפוטונית עבור כל החזר ROI לתוכנה הספציפית לחישוב.

על מנת לחשב את הערכים עבור כל החזר ROI, בחר ערך כולל והשתמש בהחזר ההשקעה הנוכחי לכל התמונות. לאחר מכן, לחץ על חשב, שמור את קובץ הטקסט וייצא את הנתונים. לאחר מכן, בצע את החישובים המתאימים להערכת גודל העלייה בסידן המיטוכונדריאלי בתגובה לכל גירוי המוצג.

להלן תמונות הצבע הבהירות והפסאודו-צבעוניות המייצגות של תרביות לטווח קצר וארוך של נוירונים בהיפוקמפוס לפני ואחרי גירוי עם 100 מיקרומולר וצבעים חמים יותר של MDA משקפים ריכוז סידן ציטוזולי מוגבר. עקבות אלה מראים את ההקלטות המייצגות של תאים בודדים של ריכוז סידן ציטוזולי בתגובה ל-100 מיקרו-מולרי ו-MDA בתרביות לטווח קצר וארוך של נוירונים בהיפוקמפוס. שימו לב שעליית ריכוז הסידן הציטוזולי גדולה בהרבה בטווח הארוך מאשר בתאי עצב מתורבתים לטווח קצר.

בניסוי זה, נוירונים בהיפוקמפוס מתורבתים הועברו עם קורין ממוקד מיטוכונדריה בעל זיקה נמוכה שהתמזגו ל-GFP שהודגרו עם ארבעה איטום מיקרו-מולרי טרזין, ועברו הדמיה ביו-לומינסנציה של ריכוז הסידן המיטוכונדריאלי. כאן, ההקלטות המראות שחרור של פליטות צילום המשקפות סידן מיטוכונדריאלי בנוירונים מתורבתים בהיפוקמפוס לטווח קצר וארוך. מיקרוטולר MDA 100 הגדיל את ריכוז הסידן המיטוכונדריאלי בתאי עצב מזדקנים, אך לא בתאי עצב היפוקמפוס צעירים בתרבית בעקבות הליך זה.

ניתן לשלב שיטות אחרות כמו הערכה שמאלית הוגנת עם הדמיה פלואורסצנטית וביו-לומינסנציה באותם תאים על מנת לענות על שאלות נוספות כמו רגישות לתאי נוירונים, עופרת הקשורה לניוון עצבי מזדקן ואיסכמיה.