Explants מוח מונחי לייזר עצבי איתור ב

המטרה הכוללת של שיטה זו היא לתייג נוירונים ואת ההקרנות האקסונליות שלהם על מנת לעקוב אחר הקשרים שלהם לגרעיני מוח מעניינים או מקור. שיטה זו מסייעת לענות על שאלות מפתח במדעי המוח כגון דפוסי קישוריות בין אזורים שונים או תת-אוכלוסיות עצביות במוח, כמו גם המשמעות התפקודית שלהם עבור מעגל עצבי נתון. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא דיוק המטרה המוגבר במהלך הזרקות מעקב.

זה מושג על ידי שימוש בציוד אופטי בסיסי כדי להמחיש גרעיני מוח עם תווית פלואורסצנטית. יתרון נוסף של שיטה זו הוא שהיא מאפשרת גנוטיפ לא פולשני של עכברים המבטאים חלבונים פלואורסצנטיים בשליטת מקדמים עצביים. בעת גנוטיפ גורים בדוק את הביטוי של הסמנים הפלואורסצנטיים המתאימים באמצעות מצביע לייזר עם אורך גל העירור המתאים.

במקביל, הרכיבו משקפי סינון החוסמים את אורך גל העירור, אך עוברים את אורך גל הפליטה. כוון את הלייזר לחלק האחורי של הראש או לחוט השדרה של הגור המדובר. היזהר לא להאיר את הלייזר בעיני ה-P ולשמור על חשיפת הלייזר קצרה.

סמני הפלואורסצנט הנרגשים צריכים להיות גלויים דרך העור. כאשר העכבר מבוגר יותר, ניתן לזהות נוירונים בודדים של רקמות שנקטפו. לאחר הרדמת העכבר ובדיקת היעדר רפלקס, הסר את העור מעל הגולגולת, חתוך את העור לאורך החלק האחורי של הראש עד לחלק האמצעי של הגולגולת.

בעכברים מבוגרים עוד יותר מחודש, ניתן לראות את הקרינה דרך עיני החיה. לאחר מכן, באמצעות PBS קר כקרח טרנס קארדי מחדיר את הסמן החיובי לחיה באמצעות מחט בגודל 30, לאחר חמש עד 10 דקות, רוב הדם יוסר. לאחר מכן הסר את המוח ונתח את אזור העניין.

כאן, הגוף הטרפזי, שהוא שתי נורות בולטות באזור הגחון של המוח, מכיל את אזור העניין. גרעיני הגחון של גופי הטרפז או VNTB מתחילים בהעברת אזור המוח המושתל המעניין לצלחת של תמיסת חיתוך מחומצנת. שם. אבטח את האקספלן עם מחטי מזרק בגודל 30 כך שאזור ההזרקה יהיה נגיש מלמעלה.

לצורך ההזרקה השתמש בפיפטות הזרקה נמשכות מזכוכית סיליקט Bo המיוצרות בשלושה או ארבעה מחזורי משיכה. טען את הפיפטה בפתרון הבא. תת-יחידה B של רעלן כולרה מצומד ל-Alexa FLUORA 4 5 55, המיועדת בעיקר להובלה לאחור.

עם מצביע הלייזר ופיפטות ההזרקה, כולם מותקנים ומוכנים לשימוש, המשיכו לכוון את הקרן לאזור המוח המסומן או לתאים שיש להזריק. התבונן בשדה דרך משקפי המסנן של מעבר הפס כדי לראות לאילו נוירונים לכוון עם פיפטת ההזרקה. השתמש במניפולטור המיקרו כדי למקם את הפיפטה באזור העניין.

לאחר מכן באמצעות מזרק לחץ המוגדר להעברת פולסים של 50 אלפיות השנייה ב-15 PS, אני מזריק את חומר העוקב בשניים עד 10 פולסים. אפשר 10 עד 15 שניות לעבור בין פולסים כדי שהצבע המוזרק יוכל להתפשט. בעת הזרקת טטראתיל רומין מגרה חשמלית את האזור עם האלקטרודה המגרה המספקת פולסים TTL.

ודא שהאלקטרודה מקורקעת בתמיסת האמבטיה. ספק שמונה פולסים TTL בשמונה וולט כל אחד באורך של 50 אלפיות השנייה במרווחים של 50 אלפיות השנייה. עורר את האזור עם 10 עד 20 חזרות דופק במשך מספר דקות.

גרעיני המוח משתנים בגודלם, בצפיפות העצבית ובסוגי התאים. משמעות הדבר היא שייתכן שיהיה צורך להתאים את משך הזמן ומספר הלחץ ו/או הפולסים החשמליים כדי להשיג תוצאות תיוג אופטימליות עבור אזור נתון במוח. בעזרת הלייזר והמשקפיים בדוק את אות העוקב הפלואורסצנטי.

יש לקלוט את הצבע על ידי התאים ולפזר סביב האזור המוזרק. לאחר הדגירה של גבעולי המוח בנוזל מוחי מלאכותי מחומצן בטמפרטורת החדר למשך שעה עד ארבע שעות. שמרו על החמצון במהלך הדגירה, ואז קבעו את הרקמה ב-4% אלדהיד פרפורם.

ב-PBS בן לילה בארבע מעלות צלזיוס למחרת, ניתן לחתוך את הרקמה ולהרכיב זריקה בין-דרגתית לגרעין הגחון של גוף הטרפז או VNTB. שימוש בטטראתיל רודין דקסטרין מראה כי הקרנות מה-VNTB משתרעות לגרעין המדיאלי של גוף הטרפז, או MNTB. לאחר מכן הוזרק ל-MNTB צ'ול טואין, תת-יחידה B, אשר רטרו תייגה מאוד את ה-VNTB.

בפירוט רב יותר, נראה כי הסומטה של תאי ה-VNTB האנטרי של הגליק. ה-MNTB הוזרק עם התווית הרטרוגרדית דקסטרין טרי. בניגוד לדפוס הנקב של תיוג CTB, תיוג דקסטרין טריט היה צפוף ודומה ל-GOGI.

אחרי הצפייה בסרטון הזה, אתם אמורים להבין היטב כיצד לתייג תאי עצב ואת התהליכים שלהם ברמת דיוק מוגברת. הטכניקה המודגמת עוזרת לך לזהות אזורי מוח ותת-אוכלוסיות עצביות המשתתפות במעגל עצבי נתון לאחר שליטה, ניתן לבצע את הליך ההזרקה תוך כ-30 דקות אם מבוצע כראוי. ניתן לשלב הליך זה בקלות עם שיטות אחרות כמו אימונוכימיה או ניקוי מוח כדי לענות על שאלות נוספות הנוגעות למורפולוגיה, כיווניות או פונקציונליות של הקרנות עצביות ומבנים עצביים אחרים.