Electrotaxis מחקרים של תאי סרטן ריאות באמצעות רב-ערוצי דו-חשמלי-שדה שבב microfluidic
29 בדצמבר 2015
מכשירים מיקרופלואידיים רבים פותחו לשימוש בחקר אלקטרוטקסיס. עם זאת, אף אחד מהשבבים הללו אינו מאפשר מחקר יעיל של השפעות השדה הכימי והחשמלי בו-זמנית (EF) על התאים. פיתחנו מכשיר מבוסס פולימתיל-מתאקרילט המציע EF דו-קיום מבוקר טוב יותר וגירוי כימי לשימוש במחקר אלקטרוטקסיס.
המטרה הכללית של ניסוי מיקרופלואידי זה היא להעריך את השפעותיהם של מעכבי קינאז על נדידת תאי גידול תחת שדה חשמלי ישיר. לפיכך, שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח במחקרי אלקטקסיס תאיים, כגון מהם המסלולים המכריעים בנדידה של תאי סרטן המכוונת על ידי שדה חשמלי. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שמדובר במחקר אלקטקסיס בעל הדירות גבוהה המקצר זמן וניתן ליישום בקלות.
ההשלכות של טכניקה זו חוללות לכיוון האבחנה של פוטנציאל גרורתי של סרטן. מכיוון שניידות של תאי סרטן מגנטיים יכולה להיות מוגברת על ידי שדה חשמלי, שיטה זו יכולה לספק מידע על התגובה החשמלית התוך-תאית של תאי גידול.
ניתן ליישם זאת גם בתהליכי התחדשות עור, כגון ריפוי פצעים. התחילו בשימוש בתוכנה לשרטוט ותכנון כדי לצייר תבנית של שכבת אקריל בודדת. שמרו את התבנית, ולאחר מכן הפעילו את השורט הלייזר.
חברו את מכשיר החריטה למחשב הבקרה ולחצו על קובץ התבנית המתוכנן כדי לפתוח את תבנית שכבת האקרילי. לאחר מכן, הניחו יריעת אקרילי ריקה על במת ה-x, Y, Z של מכשיר החריטה בלייזר והשתמשו במקל היישור האוטומטי המתאים של מכשיר החריטה בלייזר, כדי לכוון את מוקד קרן הלייזר אל פני השטח של היריעה.
שלח את התבנית המתוכננת למכשיר החריטה בלייזר לעיבוד ישיר של לוח האקריליק. לאחר מכן, השתמש בפינצטה כדי להסיר את נייר ההגנה מלוחות האקריליק ונקה את השטחים בעזרת נשיב של גז חנקן. כעת ערים את הלוחות והדבק אותם יחד תחת לחץ של שני קילוגרם לסנטימטר רבוע במכשיר הדבקה תרמי למשך 45 דקות בטמפרטורה של 110 מעלות צלזיוס, כדי ליצור את מכלול תעלת הגירוי החשמלי הזורם.
לאחר הכנת סרט דביק דו-צדדי באופן דומה, הדביקו את זכוכית הכיסוי הנקייה למכלול תעלת הגירוי החשמלי בזרימה. לאחר מכן, השתמשו בדבק מהיר כדי להדביק 13 מתאמי אקריל לפתחים הבודדים בשכבה הראשונה של מכלול השבב הרב-ערוצי לשדה חשמלי כפול (MDF) כדי להקים את רשת גשרי המלח של שבב ה-MDF. התחילו בחיבור צינורות פלסטיק לרצפה למכלול שבב ה-MDF באמצעות מתאמי הכניסה והיציאה של המדיום.
בשלב הבא, חברו את חיבורי ה-luer של צינורות הפלסטיק הבינוניים של הכניסה והיציאה לברזים תלת-כיווניים. חברו מזרק של 3 ml המכיל 2.5 ml של PBS שווה-משקל עם פחמן דו-חמצני לברז תלת-הכיווני של צינור הפלסטיק של הכניסה, ומזרק ריק של 3 ml לברז תלת-הכיווני של צינור הפלסטיק של היציאה. השתמשו באומים לבנים להדקה ידנית כדי לאטום את הפתחים של המתאמים הכחולים והירוקים על לוח האקריליק של שכבה 1. לאחר מכן, מלאו את תעלולי גשר המלח ותאי התרבית ב-PBS שווה-משקל עם פחמן דו-חמצני, תוך הקפדה על מניעת בועות.
העבירו את השבב למדגרה לתרביות תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% carbon dioxide למשך הלילה, כדי לאפשר לאוויר המומס בסרט ההדבקה הדו-צדדי ליצור בועות בתוך התאים למחרת בבוקר. השתמשו בשתי המזרקים כדי ליצור זרימה מהירה של PBS לה removal של הבועות, על ידי שאיבה של ה-PBS קדימה ואחורה לפי הצורך. לאחר שכל הבועות הוסרו, השתמשו בברז התלת-דרכי המחובר לצינור יציאת המדיום כדי לרוקן את ה-PBS מהתעלות.
לאחר מכן, החליפו את המזרק המחובר לכניסה במזרק של 3 מיליליטר המכיל 2.5 מיליליטר של מצע DMEM שווה ערך לדו תחמוצת הפחמן, ומלאו מחדש את התאים במצע כאשר התאים מלאים. הסירו את האומים המוצקים מהמתאמים הירוקים והזריקו agarose בריכוז 3% שחומם לפחות ל-70 °C אל תוך תעלת גשר המלח. דרך הפתחים במתאמים, ה-agarose החם יכין את גשר המלח להזרקה, תוך הבטחת חסימה של שורת המצע בין תאי התרבית.
הפסק את הזרקת ה-agros כאשר התרכובת ממלאת שלושה רבעים מאורך תעלת גשר המלח ואטום מחדש את הנקבים באמצעות האומים המוצקים. כעת החלף את האומים המוצקים במתאמים הכחולים באומים שקופים בצורת צינור הנסגרים ביד (finger tight), והטען aros לתוך האומים הצינוריים. לאחר מכן, השבץ אלקטרודות של כסף וכסף כלורי אל תוך האומים הצינוריים לפני שה-aro התמצק.
להקמת ניסוי אלקטרו-טקטי, הזרק 0.3 milliliters של תאים אל תוך שבב ה-MDF דרך צינור היציאה, והחזר את השבב לדגירה במקריר התרביות. לאחר שעתיים עד ארבע שעות, התקן את מערכת המיקרופלואידיקה של ה-MDF על גבי מחמם זכוכית שקוף של indium tin oxide וחבר תרמוקופל מסוג K בין שבב ה-MDF לזכוכית ה-indium tin oxide. כדי למדוד את טמפרטורת השבב, השתמש בבקר proportional integral derivative כדי להגדיר את טמפרטורת הדגירה של מערכת המיקרופלואידיקה של ה-MDF ל-37 degree Celsius, והצב את מכלול שבב ה-MDF בעל בקרת הטמפרטורה על גבי במה מוטורית XYZ המופעלת במחשב של מיקרוסקופ הפוך.
לאחר מכן, באמצעות משאבת מזרקים בעלת ארבעה ערוצים, הזרים מצע גידול מלא אל תאי התרבית דרך פתחי הכניסה בקצב זרימה של 20 microliters לשעה. אסוף את פסולת התרבית מפתחי היציאה אל תוך מבחנות microcenter fuge. דגור את התאים בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך 16 עד 18 שעות נוספות.
למחרת, החליפו את המצע בכל תא במצע טרי, המועשר בריכוז המתאים של מעכב קינאז לטיפול של 60 דקות. לאחר מכן, חברו ספק כוח DC לשבב ה-MDF באמצעות אלקטרודות כסף-כלוריד כסף ובטור. חברו אממטר למעגל החשמלי כדי לנטר את הזרם החשמלי בשבב ה-MDF.
לבסוף, הפעילו את ספק הכוח וכווןנו את המתח לערך שבין 15 ל-19 וולט. הגדירו את זרם האמפרמטר ל-86.94 µA. בניסוי מייצג זה במערכת מיקרופלואידית מסוג MDF, תאי סרטן ריאה טופלו בריכוזים שונים של מעכב קינאז.
Y 2 7 6 3 2 לא הראה שינויים במהירות נדידת התאים עם או ללא גרייה חשמלית. עם זאת, טיפול ב-Y 2 7 6 3 2 בנוכחות שדה חשמלי הפחית באופן משמעותי את התנועה המפותלת של נדידת תאי הסרטן. ואכן, בריכוז של 50 µM, מעכב ה-rock ביטל לחלוטין את התנועה המפותלת של התאים מבלי להשפיע על מהירות נדידתם.
יתרה מכך, נמצא מתאם תלוי-מינון בין הריכוזים הכימיים שהוחלו לבין מדד הכיווניות, מה שמאשר את האמינות והיעילות של מערכת המיקרופלואידיקה MDF כשיטה לה study של צירים. לאחר רכישת מיומנות, ניתן להשלים טכניקה זו בתוך שבע עד שמונה שעות, במידה והיא מבוצעת כהלכה לאחר פיתוחה. טכניקה זו מאפשרת לחוקרים בתחום האלקטרו-טקסס להתרחב עם פגיעה בעור.
יש לזכור כי עבודה עם מקשרה לייזר (laser scraper) עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות בעת ביצוע הליך זה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג התקן מיקרופלואידי חדש שנועד לחקור את ההשפעות של שדות חשמליים וגירויים כימיים על נדידת תאי גידול. ההתקן משפר את ההבנה של אלקטרוטקסיס (electrotaxis) במחקר הסרטן.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- מיקרופלואידיקה
רקע
- אלקטרוטקסיס (Electrotaxis) היא תנועה של תאים בתגובה לשדות חשמליים.
- מכשירים מיקרופלואידיים קיימים אינם מאפשרים לחקור ביעילות גירויים חשמליים וכימיים בו-זמנית.
- הבנת נדידת תאי גידול היא קריטית למחקר הסרטן.
- מעכבי קינאז עשויים להשפיע על תנועת תאים תחת שדות חשמליים.
מטרת המחקר
- להערכת ההשפעות של מעכבי קינאז על נדידת תאי גידול.
- לבדיקת המסלולים המעורבים בנדידה של תאי סרטן המונחית על ידי שדה חשמלי.
- לפיתוח שיטה ניתנת לשחזור לחקר אלקטרוטקסיס.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- פיתוח של התקן מיקרופלואידי המבוסס על פולימתילמתקרילט.
- החלה של שדות חשמליים ישירים על תאי גידול.
- הערכה של נדידת תאים בתגובה לגירויים חשמליים וכימיים.
- שימוש במעכבי קינאז כדי להעריך את השפעתם על הנדידה.
תוצאות עיקריות
- המכשיר החדש מאפשר גירוי חשמלי וכימי בו-זמני ומבוקר.
- מעכבי קינאז משפיעים באופן משמעותי על נדידת תאי גידול תחת שדות חשמליים.
- שיטה זו מספקת תובנות לגבי מנגנוני an electrotaxis.
- הממצאים עשויים לסייע באבחון פוטנציאל גרורתי בסרטן.
מסקנות
- ההתקן המיקרופלואידי שפותח הוא כלי בעל ערך למחקר של אלקטרוטקסיס.
- הבנת ההשפעות של שדות חשמליים על נדידה של תאי סרטן עשויה להנחות אסטרטגיות טיפוליות.
- מחקר זה מדגיש את חשיבותם של שדות חשמליים בביולוגיה של הסרטן.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית להנהלה
הערכה סימולטנית של רמזים כימיים וחשמליים על נדירה של תאי סרטן ריאה נותנת מענה לפער קריטי בגילוי מוקדם ובצמצום סיכונים מכניסטי עבור פורטפוליו של אונקולוגיה. השבב המיקרופלואידי רב-ערוצי עם שדה חשמלי כפול מאפשר בדיקה מהירה וניתנת לשחזור של תלות במסלולים ופנוטיפים של נדירה תחת תנאים רלוונטיים פיזיולוגית. פלטפורמה זו תומכת בביטחון חיזוי באישור מטרות ומספקת מידע לקבלת החלטות מותאמות סיכון עבור תוכניות למחלות גרורתיות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בדיקה ישירה של השפעות מעכבי קינאז על נתיבי נדידה אלקטרוטקטיים.
- תומך בהפחתת סיכונים מנגנונית על ידי בידוד התרומות של גירויים חשמליים וכימיים.
- מקל על תיקוף פונקציונלי של מטרות באמצעות מדדי נדידה כמותיים.
- מאיץ מיון מונחה-השערות של נתיבים מועמדים במודלים מטאסטטיים.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מספק מערכת רב-ערוצית (multiplexed) וסטנדרטית לבדיקות אלקטרוטקסיס הניתנות לשחזור.
- מספק נתונים כמותיים על מהירות נדידה ומדד כיווניות לצורך הערכת תרכובות.
- מצמצם את זמן הניסוי ואת نسبة השגיאות, ובכך תומך בתהליכי סריקה הניתנים להרחבה.
- מאפשר הערכה מקבילית של מספר תנאים בריצה אחת.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מקשר בין פנוטיפים של נדידה in vitro לבין פוטנציאל מטאסטטי הרלוונטי למחלה.
- תומך ברציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני של סוכנים נוגדי נדידה.
- מאפשר ניתוח תלוי-מינון של עיכוב מסלולים תחת שדות רלוונטיים פיזיולוגית.
- מספק תובנה תרגומית למודלים של ריפוי פצעים והתחדשות רקמות.
שילוב תהליכי עבודה (Pipeline & Workflow)
פלטפורמה מיקרופלואידית זו משתלבת ברצף שבין שלב הגילוי לשלב הפרה-קליני, בכך שהיא מאפשרת הערכה מהירה ומרובת-מדדים (multiplexed) של נדידת תאים תחת גירויים כימיים וחשמליים משולבים.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בבדיקת השערות לגבי גורמים קובעים במסלולים של אלקטרוטקסיס והתנהגות מטאסטטית.
- סריקה: מספקת נתוני נדידה כמותיים הניתנים לשחזור לצורך תיעדוף תרכובות.
- אנליזה: מספקת מדדי אינדקס כיווניות ומהירות נדידה להשוואה מהימנה בין תנאים.
- מחקר תרגומי: מגשרת בין ממצאים in vitro למודלים של נדידה וריפוי פצעים הרלוונטיים למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פלטפורמה לסימולציה מהירה וניתנת לשימוש חוזר עבור סוגי תאים שונים ומחקרי מסלולים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי באישור המטרה ובצמצום הסיכונים של המסלול.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של בדיקות אלקטרוטקסיס (electrotaxis) לצורך הדירות וסקילביליות.
- ערך אסטרטגי: מספק בסיס להחלטות של המשך או עצירה (go/no-go) ומפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים בתיקי פיתוח בתחום האונקולוגיה.
- השפעה על תיק הפיתוח: מאפשר תיעודוף מותאם סיכונים של מועמדים לטיפולים אנטי-מיגרטוריים ורפואה רגנרטיבית.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בטיפול בהתקנים מיקרופלואידיים ובניתוח נדידת תאים.
- נדרשת גישה למכשיר חריטה בלייזר (laser scriber), למכשיר הדבקה תרמית (thermal bonder) ולתשתית מיקרוסקופיה הפוכה.
- נדרש סטנדרטיזציה חוצת-צוותים של הגדרת הבדיקה והקריאות הכמותיות.
- ניתן להתאים לסוגי תאים שונים ולמודולטורים כימיים באמצעות אופטימיזציה של הפרוטוקול.
- טיפול זהיר בציוד מסוכן ובקרה מדויקת של התנאים הניסויים הם חיוניים.
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:05
Title
1:06
Multichannel Dual-electric Field (MDF) Chip Design and Fabrication
2:37
MDF Chip Salt Bridge Network Setup
5:06
Electrotactic Experiment Setup
6:49
Results: Investigation of Lung Cancer Cell Electrotaxis using the MDF Microfluidic System
7:49
Conclusion
