Name: הארכת חרוזים לפיתוח איברי העובר עוף לזהות מסלולי העברת אותות המשפיעים על ביטוי גנים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: למדו כיצד להשתיק חרוזים לתוך ניצני גפיים של עוברי עוף כדי לחקור את השפעת גורמי הגדילה והמעכבים על ביטוי גנים. שיטה זו מאפשרת בדיקה ישירה של מסלולי העברת אותות בביולוגיה התפתחותית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומנה בחלקה על ידי פרס הקריירה המוקדמת של אוניברסיטת נוטינגהאם ל-DS. RM ממומן על ידי הוועדה העליונה לפיתוח החינוך של עיראק.

הצהרת אתיקה: כל הניסויים האלה לעקוב אחרי הטיפול בבעלי החיים וקווים מנחים אתיים של אוניברסיטת נוטינגהם. 1. הכנת חרוזים הפרין להארכה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חרוזים הפרין ביסודיות בPBS לפני השימוש. הערה: ניתן לאחסן חרוזים על 4 מעלות צלזיוס כתרחיף בPBS. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר חרוזים להשתלה על ידי הוצאתם מהמנייה עם טפטפת 20 μl לירידת 1 מיליליטר של PBS. לאחר מכן להשתמש micropipette מוגדר 2 μl להעביר חרוזים לירידה של 20 μl של PBS בצלחת פטרי 3 סנטימטר. בחר חרוזים מבוססים על גודל ו, באמצעות סטריאו מיקרוסקופ לנתח, להעביר חרוזים נבחרו עם קצה פיפטה P2; הסובבים 100 מיקרומטר הקוטר הוא אידיאליים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את PBS מהחרוזים. להסיר את רוב הנוזל עם טפטפת μl 20 ואת הנוזל שיורית על ידי פעולת נימים עם מלקחיים שענים בסדר. שים לב: חשוב להסיר כמה שיותר כך צמיחת פקטוr אינו מדולל כאשר הוא הוסיף לחרוזים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה גורם הגדילה ישירות על חרוזים. לFGF18 להוסיף 0.5 μl של FGF18 רקומביננטי מחדש ברמה של 0.5 מ&quot;ג / מיליליטר בBSA 0.1% ב PBS. מניחים כמה טיפות של מים בקצוות של המנה, כדי למנוע את הנוזל מתאדה מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה חרוזים עבור שעה 1 ב RT. הסר את טיפות מים מהצלחת עם פיפטה פסטר ומניח על קרח מוכן להשתלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם נדרש העברה (לחרוזים שקופים) 4-5 חרוזים 2% פנול אדומים לפני השתלה כדי לעזור לחזות אותם. יש לשטוף בPBS לפני העברה לעובר. </li></ol> 2. הכנת חרוזים 1-X2 AG להארכה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני שימוש derivatize חרוזים עם 0.2 חומצה פורמית N. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לעשות שימוש זה מרית להעביר חרוזים לצינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר. הוסף 1ml של 0.2 חומצה פורמית N ולשטוף על פלטפורמה רועדת עבור שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ואז להסיר את החומצה פורמית עם טפטפת P1000 ולהחליף עם 1מיליליטר של מים. לשטוף עבור שעה 1 ולחזור על שש פעמים כדי להסיר נותר חומצה פורמית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר נוזל שנותר עם טפטפת P1000 ולאחסן את החרוזים על 4 מעלות צלזיוס. הערה: אין צורך להסיר את כל שאריות המים בשלב זה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר גלולה קטנה של חרוזים של כ 5-10 μl נפח מהמניות בעזרת מרית קטנה לצלחת פטרי 3 סנטימטר ולהוסיף 1 מיליליטר של DMSO (או לפי ממס התרופה מומסת ב). הערה: זה אמור לספק כמה מאה חרוזים שממנו ניתן לבחור את הגודל הנכון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן להשתמש פיפטה P2 מוגדרת 2 μl להעביר חרוזים של כ -100 מיקרומטר קוטר לירידה של 20 μl של ממס בצלחת פטרי עוד 3 סנטימטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר ממס עם טפטפת μl 20 וכל ממס שייר עם טפטפת 2 μl. החלף עם 20 μl של התרופה שיש להחיל. הערה: לעקביות לפזר את התרופה בריכוז של 100 מיקרומטר בDMSO (או שאי פעם ממס משמש),aliquot לתוך 20 μl ולאחסן ב -80 ° C כמו כמה מעכבי מולקולה קטנים אינם יציבים ועדיף להימנע מהקפאה-הפשרה חוזרת ונשנית. אם יש צורך אז לדלל את התרופה לריכוז הרצוי לפני השרייה חרוזים. ריכוזים יעילים ייתכן שיהיו הצורך לקבוע באופן אמפירי לכל תרופה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עבור שעה 1. להגן מפני אור רב של מולקולות אלה הם רגישים לאור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני השתלת העברה 4-5 חרוזים עם טפטפת P2 מוגדר 2 μl לμl 20 של 2% פנול אדומים מומס במים. לבצע שלב זה באמצעות מיקרוסקופ לנתח סטריאו לדמיין את החרוזים. הסר חרוז אחד עם מלקחיים שענים קנס או לולאת חוט ולשטוף בPBS לפני העברה לעובר. אל תשאירו חרוזים ב 2% פנול אדומים ליותר מ -15 דקות לפני השימוש כמו זה יכול לגרום לאובדן של פעילות. </li></ol> 3. הכנת מחטי טונגסטן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך חוט טונגסטן קנס ל3-4 סנטימטר אורך. הכנס חתיכת חוט אחד לסוףפיפטה פסטר זכוכית ולהמס במבער בונזן לתקן בעמדה. הכן עד 10 מחטים על מנת להבטיח כי יש חלקי חילוף אם הם ניזוקו במהלך שימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את קצה החוט לתוך להבת מבער ולהחזיק אותו שם עד טונגסטן זוהר לבן והקצה חד (כ 2-3 דקות). הערה: במהלך שימוש המחט ניתן לנקות ו- חידד מחדש במבער בהתאם לצורך. הערה: גם מחטים אלה יכולים לשמש כדי להפוך את הלולאות להעברת חרוזים. לגעת בעדינות את המחט לספסל וזה יהיה לכופף כדי ליצור לולאה. </li></ol> 4. עוברים הכנה לתל חרוז <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה ביצים עם סופו של הדבר הבוטה עד שהם מגיעים לשלב הרצוי (3-5 ימים עבור רוב מניפולציות ניצן האיבר). שימוש בברז מלקחיים בוטה על הקצה הקהה לשבור את הקליפה ולאחר מכן להשתמש במלקחיים כדי להסיר את הקליפה ולחשוף את העובר. ודא קרום קליפת הביצה הוא גם הוסר. הערה: ניתן להוסיף 1-2 מיליליטר של PBS עם פיפטה פסטר לסייע בזה אם הקרום נדבק לחלמון. בעדינות פיפטה PBS על פני השטח של החלמון, לתפוס את הקרום עם המלקחיים, נזהר שלא לפגוע בחלמון, ומשוכים בעדינות מהביצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר עד 5 מיליליטר של חלבון מן הביצה עם מזרק 10 מיליליטר ומחט 19 G. קח רק את מה שנחוץ כדי להבטיח את העובר לא ליצור קשר עם הקלטת משמשת לאטום את הביצה כהסרה של נפחים גדולים יותר יכול להפחית את שיעורי הישרדות עובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להמחיש את העובר להוסיף 5-6 טיפות של דיו הודו אמנים עד 15 מיליליטר של PBS המכיל 100 פניצילין U ו 0.1 מ&quot;ג סטרפטומיצין / מיליליטר. להזריק 0.5-1 מ&quot;ל ישירות תחת העובר עם מזרק 1 מיליליטר ומחט 25 G. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 2-3 מיליליטר של PBS עם 1% בסרום עוברי עגל ופניצילין 100 U ו 0.1 מ&quot;ג סטרפטומיצין / מיליליטר לתוך הביצה על מנת להבטיח את העובר אינו מייבשים. בעזרת מלקחיים שענים חידדו להסיר את קרום vitelline ולפתוח את amnion מעל ניצני איבר הפיתוח. להבטיח את העובר לא להתייבש ו, במידת הצורך, להוסיף עוד PBS / FCS. הערה: ניצני האיבר ניתן לראות צמחים לזווג בכנף של העובר באופן ברור. בשלבים אלה העובר יהפוך הלוואי כגון הנכון הוא בדרך כלל עליון. כתוצאה מכך היא בדרך כלל קלה יותר להרכיב חרוזים לגפיים תקין ולהשתמש באלה עזבו כפקדים נגדי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בחוט טונגסטן חידד לעשות חתך לניצן האיבר שבו חרוז יהיה מושתל. הימנע חיתוך לאורך כל הדרך ניצן האיבר שבו אפשרי אם כי בשלבים צעירים זה קשה. הערה: בעוברים גדולים יותר (שלב HH 22 ומעלה) ניתן לבחור אזורים ספציפיים של ניצן האיבר להשתלה, אך בשלבים צעירים זה קשה יותר כאיבר הניצן עצמו הוא קטן. כמו כן, חשוב לזכור כי ניצן האיבר יגדל עבר חרוז המורכבים כל כך, במיוחד בשלבים צעירים, חרוז יישאר בגפה הפרוקסימלית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרים חרוז משני גורם הגדילה או תרופה או באמצעות wa קנס נוסףמלקחיים tchmakers או לולאה עשויה ממחט טונגסטן. אם חרוז כבר ספוג באו DMSO או פנול אדום, לשטוף בPBS לפני היישום לעובר. העבר את חרוז לעובר עם המלקחיים / לולאת חוט. לאחר מכן השתמשתי בחוט טונגסטן חידד להכניס את חרוז לתוך החתך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 1-2 מיליליטר של PBS / FCS לביצה להבטיח כי העובר נשמר התייבשות, אך להימנע יישום ישירות על העובר עצמו כמו זה יכול לגרום נזק לעוברים ולגרום חרוז שחלץ. לאטום את הביצה עם קלטת ולחזור לחממה. </li></ol>

<ol><li>Davey, M. G., Tickle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chicken+as+a+model+for+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenetic+Genome+Research%22%5BJournal%5D)">The chicken as a model for embryonic development.</a> Cytogenetic Genome Research. 117, 231-239 (2007).</li>
<li>Le Douarin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Nogent+Institute--50+years+of+embryology%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The Nogent Institute--50 years of embryology.</a> International Journal of Developmental Biology. 49, 85-103 (2005).</li>
<li>Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+avian+embryo+as+a+model+to+study+the+development+of+the+neural+crest%3A+a+long+and+still+ongoing+story%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">The avian embryo as a model to study the development of the neural crest: a long and still ongoing story.</a> Mechanisms of Development. 121, 1089-1102 (2004).</li>
<li>Bell, E., Brickell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication-competent+retroviral+vectors+for+expressing+genes+in+avian+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Replication-competent retroviral vectors for expressing genes in avian cells in vitro and in vivo.</a> Molecular Biotechnology. 7, 289-298 (1997).</li>
<li>Abu-Elmagd, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt%2FLef1+signaling+acts+via+Pitx2+to+regulate+somite+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Wnt/Lef1 signaling acts via Pitx2 to regulate somite myogenesis.</a> Developmental Biology. 337, 211-219 (2010).</li>
<li>Munsterberg, A. E., Lassar, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+signals+from+the+neural+tube%2C+floor+plate+and+notochord+induce+myogenic+bHLH+gene+expression+in+the+somite%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Combinatorial signals from the neural tube, floor plate and notochord induce myogenic bHLH gene expression in the somite.</a> Development. 121, 651-660 (1995).</li>
<li>McGrew, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+production+of+germline+transgenic+chickens+using+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Efficient production of germline transgenic chickens using lentiviral vectors.</a> EMBO Reports. 5, 728-733 (2004).</li>
<li>Valasek, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+investigations+into+the+development+of+the+pectoral+girdle%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular investigations into the development of the pectoral girdle.</a> Developmental Biology. 357, 108-116 (2011).</li>
<li>Tickle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contribution+of+chicken+embryology+to+the+understanding+of+vertebrate+limb+development%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">The contribution of chicken embryology to the understanding of vertebrate limb development.</a> Mechanisms of Development. 121, 1019-1029 (2004).</li>
<li>Riddle, R. D., Johnson, R. L., Laufer, E., Tabin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonic+hedgehog+mediates+the+polarizing+activity+of+the+ZPA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sonic hedgehog mediates the polarizing activity of the ZPA.</a> Cell. 75, 1401-1416 (1993).</li>
<li>Tickle, C., Alberts, B., Wolpert, L., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+application+of+retinoic+acid+to+the+limb+bond+mimics+the+action+of+the+polarizing+region%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Local application of retinoic acid to the limb bond mimics the action of the polarizing region.</a> Nature. 296, 564-566 (1982).</li>
<li>Rosello-Diez, A., Torres, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulative+patterning+in+limb+bud+transplants+is+induced+by+distalizing+activity+of+apical+ectodermal+ridge+signals+on+host+limb+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Regulative patterning in limb bud transplants is induced by distalizing activity of apical ectodermal ridge signals on host limb cells.</a> Developmental Dynamics. 240, 1203-1211 (2011).</li>
<li>Anakwe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signalling+regulates+myogenic+differentiation+in+the+developing+avian+wing%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Wnt signalling regulates myogenic differentiation in the developing avian wing.</a> Development. 130, 3503-3514 (2003).</li>
<li>Amthor, H., Christ, B., Weil, M., Patel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+timing+differentiation+during+limb+muscle+development%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">The importance of timing differentiation during limb muscle development.</a> Current Biology. 8, 642-652 (1998).</li>
<li>Brand-Saberi, B., Muller, T. S., Wilting, J., Christ, B., Birchmeier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scatter+factor%2Fhepatocyte+growth+factor+%28SF%2FHGF%29+induces+emigration+of+myogenic+cells+at+interlimb+level+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Scatter factor/hepatocyte growth factor (SF/HGF) induces emigration of myogenic cells at interlimb level in vivo.</a> Developmental Biology. 179, 303-308 (1996).</li>
<li>Mok, G. F., Cardenas, R., Anderton, H., Campbell, K. H. S., Sweetman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+FGF18+and+retinoic+acid+regulate+differentiation+of+chick+embryo+limb+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Interactions between FGF18 and retinoic acid regulate differentiation of chick embryo limb myoblasts.</a> Developmental Biology. 396, 214-223 (2014).</li>
<li>Abou-Elhamd, A., Cooper, O., Münsterberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Klhl31+is+associated+with+skeletal+myogenesis+and+its+expression+is+regulated+by+myogenic+signals+and+Myf-5%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">Klhl31 is associated with skeletal myogenesis and its expression is regulated by myogenic signals and Myf-5.</a> Mechanisms of Development. , 126-852 (2009).</li>
<li>Schmidt, M., Tanaka, M., Munsterberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+%28beta%29-catenin+in+the+developing+chick+myotome+is+regulated+by+myogenic+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Expression of (beta)-catenin in the developing chick myotome is regulated by myogenic signals.</a> Development. 127, 4105-4113 (2000).</li>
<li>Stavridis, M. P., Lunn, J. S., Collins, B. J., Storey, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+discrete+period+of+FGF-induced+Erk1%2F2+signalling+is+required+for+vertebrate+neural+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A discrete period of FGF-induced Erk1/2 signalling is required for vertebrate neural specification.</a> Development. 134, 2889-2894 (2007).</li>
<li>Martinez-Morales, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF+and+retinoic+acid+activity+gradients+control+the+timing+of+neural+crest+cell+emigration+in+the+trunk%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">FGF and retinoic acid activity gradients control the timing of neural crest cell emigration in the trunk.</a> Journal of Cell Biology. 194, 489-503 (2011).</li>
<li>Olivera-Martinez, I., Storey, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signals+provide+a+timing+mechanism+for+the+FGF-retinoid+differentiation+switch+during+vertebrate+body+axis+extension%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Wnt signals provide a timing mechanism for the FGF-retinoid differentiation switch during vertebrate body axis extension.</a> Development. 134, 2125-2135 (2007).</li>
<li>Logan, M., Simon, H. G., Tabin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+T-box+and+homeobox+transcription+factors+suggests+roles+in+controlling+chick+limb-type+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of T-box and homeobox transcription factors suggests roles in controlling chick limb-type identity.</a> Development. 125, 2825-2835 (1998).</li>
<li>Borycki, A. G., Mendham, L., Emerson, C. P. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+somite+patterning+by+Sonic+hedgehog+and+its+downstream+signal+response+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Control of somite patterning by Sonic hedgehog and its downstream signal response genes.</a> Development. 125, 777-790 (1998).</li>
<li>Sweetman, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF-4+signaling+is+involved+in+mir-206+expression+in+developing+somites+of+chicken+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">FGF-4 signaling is involved in mir-206 expression in developing somites of chicken embryos.</a> Developmental Dynamics. 235, 2185-2191 (2006).</li>
<li>Chapman, S. C., Collignon, J., Schoenwolf, G. C., Lumsden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+method+for+chick+whole-embryo+culture+using+a+filter+paper+carrier%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Improved method for chick whole-embryo culture using a filter paper carrier.</a> Developmental Dynamics. 220, 284-289 (2001).</li>
<li>Sweetman, D., Wagstaff, L., Cooper, O., Weijer, C., Münsterberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+migration+of+paraxial+and+lateral+plate+mesoderm+cells+emerging+from+the+late+primitive+streak+is+controlled+by+different+Wnt+signals%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The migration of paraxial and lateral plate mesoderm cells emerging from the late primitive streak is controlled by different Wnt signals.</a> BMC Developmental Biology. 8, 63(2008).</li>
<li>Scott, B. B., Lois, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+tissue-specific+transgenic+birds+with+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Generation of tissue-specific transgenic birds with lentiviral vectors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. 102, 16443-16447 (2005).</li>
<li>Seidl, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+quail+as+a+model+for+research+in+the+avian+nervous+system%3A+a+comparative+study+of+the+auditory+brainstem%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Transgenic quail as a model for research in the avian nervous system: a comparative study of the auditory brainstem.</a> Journal of Comparative Neurology. 521, 5-23 (2013).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

השימוש בשתלי חרוז מיושמים ישירות לפיתוח רקמות באובו הוא כלי רב עוצמה כדי לנתח את התפקיד של איתות גורם גדילה במהלך הפיתוח נותן שליטה ללא תחרות על השלב ההתפתחותי שבו הם מיושמים ומשך חשיפה. הבחירה של החרוזים לכל סוג של מולקולה חשובה. מולקולות קטנות הידרופובי, כגון המעכבים המתוארים כאן וחומצה רטינואית, בדרך כלל נקשרות גם לחרוזי 1-X2 AG derivatized למרות שיש צורך לבדוק את האפקטיביות של כל מעכב בחרוזים אלה באופן אמפירי...

עוברי עופות סיפקו כלי רב עוצמה ללימוד פיתוח במשך שנים רבות 1. אחד מהמאפיינים השימושיים ביותר שלהם הוא שהם קלים יחסית לתמרן. פיתוח חיצוני מאפשר לפתוח את הביצה כדי לגשת לעובר ולבצע micromanipulations השונים, כולל דוגמאות, כגון מערכת הכימרה שליו-חומוס הקלאסית ללימוד תא גורל 2,3, ההזרקה של רטרווירוסים לביטוי יתר ברקמות ספציפיות במהלך פיתוח 4,5 ותרבות explant לזהות מקורות איתות התפתחותית 6. לאחרונה מפלצות שנוצרו בין מארחים ללא תווית עם שתלים מקו עוף מהונדס להביע GFP הראה כי שילוב של השתלה קלסית ושינוי גנטי יכול לספק תובנות חשובות פיתוח 7,8. הקלות שבה ניתן להשפיע עובר העופות הפכה אותו מודל מצוין לחקר איברפיתוח 9. היישום של גורמי גדילה ספציפיים לאיברי פיתוח in vivo כבר סייע בזיהוי גורמים המשנים דפוסי איבר 10,11 וממשיך לספק תובנות תהליך זה 12. גישה זו שימשה גם כדי ללמוד את הגורמים המווסתים את התפתחות שרירים וחשפה תפקידים למספר רבים של אותות כגון 13 Wnts, 14 ו -15 BMPs HGF. לאחרונה טכניקה זו נעשתה שימוש כדי לחקור את אותות שליטה ביטוי גני myogenic בניצן האיבר והראתה כי אינטראקציות בין FGF18 וחומצה רטינואית יכולות לשלוט על העיתוי של ביטוי Myod 16. באמצעות שילוב של גורמי גדילה ומולקולות קטנות שניתן לטעון על חרוזים ולאחר מכן השתילו ישירות לתוך רקמות ספציפיות בשלבי התפתחות מוגדרים נותנת ההזדמנות להתערב כמעט בכל זמן ובאזור במהלך פיתוח. זה נעשה שימוש כדי Investigate תהליכים רבים, כולל דפוסי somite 17,18, מפרט עצבי 19, הגירה עצבית פסגת 20 והארכת ציר 21. כאן אנו מתארים שיטה להשתלת חרוזים ספוגים באו גורמי גדילה או מעכבים לפיתוח גפיים עוף. זה נעשה שימוש כדי לקבוע את ההשפעות של אותות אלה על ידי ניתוח myogenesis ביטוי שריר גן ספציפי עם הכלאה באתר. אנו מתארים שתלים או באמצעות חרוזים הפרין ספוגים, המשמשים לגורמי גדילה, או חרוזים 1-X2 AG למולקולות קטנות הידרופובי כגון חומצה רטינואית או מעכבי מולקולה קטנים של מסלולי איתות ספציפיים. עם זאת חרוזים אחרים זמינים גם אשר היו בשימוש כדי לספק את שני 22 FGFs ושש 23.

<table><tbody><tr><td>חרוזי אקריליק הפרין</td><td>Sigma</td><td>H5263</td><td>חרוזי האקריליק-הפרין המשמשים הופסקו. עם זאת ניתן להשיג מוצר חלופי, חרוזי אגרוז הפרין, חתול מס' H6508. אלה שקופים כל כך קשה לעבוד איתם אך ניתן לצבוע אותם באדום פנול באותו אופן כמו חרוזי AG 1-X2,</td></tr> <tr><td>חרוזי AG 1-X2</td><td>Bio-Rad</td><td>140-1231</td><td></td></tr><tr><td>Affi Gel חרוזים כחולים</td><td>Bio-Rad</td><td>153-7301; 153-7302</td><td>חרוזים אלה שימשו עם מגוון גורמי גדילה כולל Shh ו-FGFs וניתן להשתמש בהם להחלפת חרוזי הפרין</td></tr><tr><td>FGF18</td><td>Peprotech</td><td>100-28</td><td>השעו ב-PBS עם 0/1% BSA, הכינו מינון חד פעמי של 0.5-1ul ואחסנו ב-80&C. אצוות וספקים יכולים להשתנות ולכן יש לבדוק ריכוזים שונים כדי לקבוע מינון יעיל.</td></tr><tr><td>U0126</td><td>איתות סלולרי</td><td>9903</td><td>בצע מלאי של עד 20 מ"מ ב-DMSO ואחסן במחירים חד פעמיים ב-80 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>BMS-493</td><td>Tocris Biosciences</td><td>3509</td><td>השעו ב-DMSO ואחסנו בכמויות חד-פעמיות בטמפרטורה של -80&80 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>דיו הודי שחור</td><td>Windsor and Newton</td><td>5012572003384 (30 מ"ל)</td><td>בעוד שקיימות חלופות למוצר זה יש לנקוט בזהירות מכיוון שחלק מהדיו רעיל לעוברים</td></tr><tr><td>חוט טונגסטן, קוטר 0.1 מ"מ. 99.95%</td> <td>Alfa Aesar</td><td>10404</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין / סטרפטומיצין</td><td>Sigma</td><td>P0781</td><td>מדולל פי 100 ב-PBS/דיו ו-PBS/FCS</td></tr></tbody></table>

הארכת חרוזים לפיתוח איברי העובר עוף לזהות מסלולי העברת אותות המשפיעים על ביטוי גנים

Grafting of Beads into Developing Chicken Embryo Limbs to Identify Signal Transduction Pathways Affecting Gene Expression

שימוש בעוברי עוף אפשר לבדוק ישירות את ההשפעות של שני גורמי גדילה או מעכבים ספציפיים של מסלולי איתות על ביטוי גנים והפעלה של מסלולי העברת אותות. טכניקה זו מאפשרת המשלוח של מולקולות איתות בשלבי התפתחות מוגדרות במדויק לזמנים מסוימים. לאחר ניתן לקצור זו עוברים וביטוי גנים בדקו, למשל, על ידי הכלאה באתר, או הפעלה של מסלולי העברת אותות נצפו עם immunostaining. בחרוזים זה וידאו הפרין הספוג בFGF18 או חרוזים 1-X2 AG הספוג בU0126, מעכב MEK, הם מורכבים לניצן האיבר באוב. זה מראה כי FGF18 גורם ביטוי של Myod וזירחון ERK וביטוי Myod שני אנדוגני וFGF18 המושרה הוא מעוכב על ידי U0126. חרוזים הספוגים באנטגוניסט חומצה רטינואית יכולים להגביר אינדוקציה Myod מוקדמת על ידי FGF18. גישה זו יכולה להיות לנואד עם מגוון רחב של גורמים שונים צמיחה ומעכבים ומותאם בקלות לרקמות אחרות בעובר המתפתח.

בשלב HH 21 Myod לא בא לידי ביטוי בפיתוח myoblasts איבר למרות הכתמה ניתן לראות בmyotome של somites הפיתוח (איור 1 א). איור 1 מציג הכלאה באתר לMyod 6 שעות הבאות שתל חרוז FGF18. Myod מושרה בmyoblasts הקרוב לחרוז בעוד אין ביטוי באיבר הנגדי. שיתוף השתלת חרוז הספוג בU0126, מעכב ספציפי של MEK, האינדוקציה FGF18 לוקים של Myod (איור 1 ג). כמו כן השתלת חרוז U0126 בשלב HH 21 ומחפש ביטוי Myod לאחר 24 שעות מפחיתה את הביטוי אנדוגני של M...

על ידי השתלת חרוזים ספוגים בגורמי גדילה או מעכבים ספציפיים של מסלולי איתות לעוברים מתפתחים, ניתן לבדוק ישירות את השפעותיהם in vivo. בפרוטוקול זה מושתלים חרוזים בניצן הגפה כדי לקבוע את ההשפעות של מולקולות אלו על ביטוי גנים והעברת אותות.

Using chicken embryos it is possible to test directly the effects of either growth factors or specific inhibitors of signaling pathways on gene expression ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להראות כיצד לקבוע את ההשפעות של גורמי גדילה ומעכבים על ביטוי הגנים בגפיים של עובר תרנגולת מתפתח. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בביולוגיה של ההתפתחות, כגון האופן שבו מולקולות איתות משפיעות על גדילה ודיפרנציאציה של תאים in vivo. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת שיטה לבדיקת גורמים אלו באופן ישיר בעובר.למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי התפתחות הגפיים, ניתן ליישמה גם על מערכות אחרים, כגון רקמה עצבית, סומריטים או גסטרולציה. את הפרוצדורה תדגים רבאה מוחמד, סטודנטית לתואר שני מהמעבדה שלי. לתחילת העבודה, העבירו מיליליטר אחד של החרוזים מהתמיסה המקורית למבחנה חדשה.המתינו עד שהחרוזים ישקעו, לאחר מכן הסירו את הנוזל והחליפו אותו ב-1 milliliter של PBS. חזרו על שלב זה חמש פעמים ואחסנו את החרוזים השטופים בטמפרטורה של 4 °C, כסלרי (slurry) ב-PBS. בחרו את החרוזים להשתלה על ידי הוצאתם מתמיסת המלאי השטופה באמצעות פיפט של 20 µl, והעבירו אותם ל-1 milliliter של PBS.באמצעות סטראוסקופ, בחרו חרוזיים שקוטרם כ-100 מיקרון. העבירו את החרוזיים שנבחרו בתוך שני מיקרו-ליטר של נוזל אל צלחת פטרי חדשה המכילה טיפה של 20 מיליליטר PBS. לאחר מכן, הסירו את ה-PBS מהחרוזיים: תחילה באמצעות פיפט של 20 מיקרו-ליטר, ולאחר מכן הסירו את שאריות הנוזל באמצעות פעולת נימיות בעזרת פינצטה עדינה של שעון.חשוב להסיר כמה שיותר נוזל כדי שגורם הגדילה לא ייהדל כאשר הוא מתווסף לחרוזיים. העבירו בעזרת פיפטה את גורם הגדילה ישירות על החרוזיים. עבור FGF18, הוסיפו 0.5 µL של FGF18 רקומביננטי, שהושחזר לריכוז של 0.5 mg/mL ב-PBS עם 0.1% BSA.לאחר מכן, טפטפו מספר טיפות מים מסביב לשולי הצלחת כדי למנוע את התאיידות הנוזל. כאשר הדבר מוכן, דגרו את החרוזים למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה, הסירו את טיפות המים מהצלחת באמצעות פיפטת פסטור והניחו את הצלחת על קרח.בצעו דריבטיזציה של החרו지를, תחילה על ידי העברת החרוזים לשפופרת מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר באמצעות שפכטל. לאחר מכן, הוסיפו מיליליטר אחד של חומצה פורמית בריכוז 0.2 נורמלי והדגרימו את החרוזים בחומצה על פלטפורמת ניעור למשך שעה אחת. לאחר מכן, המתינו לשקיעת החרוזים, הסירו את החומצה הפורמית והחליפו אותה במיליליטר אחד של מים.יש לשטוף את החרוצים למשך שעה אחת על פלטפורמת ניעור ולחזור על השטיפה שש פעמים כדי להסיר שאריות של חומצה פורמית. לאחר השטיפה האחרונה, יש להסיר את הנוזל הנותר ולאחסן את החרוצים בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. השתמש במרית כדי להוציא מהמלאי כמות קטנה של חרוצים, בנפח של כ-5 עד 10 µL, והעבר אותם לצלוחית פטרי בנפח של 30 מיליליטר.לאחר מכן, הוסיפו מיליליטר אחד של DMSO. בשלב הבא, השתמשו בפיפט P2 המכוון לשני מיקרו-ליטרים, כדי להעביר חרוזיים בעובי של כ-100 מיקרון לטיפה של 20 מיקרו-ליטר ממס בתבנית פטרי נוספת בנפח של 30 מיליליטר. הסירו את מרבית הממס באמצעות פיפט של 20 מיקרו-ליטר ואת שאריות הממס באמצעות פיפט של שני מיקרו-ליטרים.לאחר מכן, כסו את החרוזים ב-20 µL של התרופה ליישום, המומסת ב-DMSO. דגרו את החרוזים בתמיסת התרופה למשך שעה אחת. הגנו על החרוזים מאור, שכן מולקולות תרופה רבות רגישות לאור.כדי לסייע בהדמיה של החרוזיים, העבירו ארבעה עד חמישה חרוזיים בשני מיקרוליטרים של נוזל, לתוך 20 מיקרוליטרים של פנול אדום בריכוז שני אחוזים המומס במים. הוציאו חרוז בודד באמצעות פינצטה עדינה של שעונים ושטפו את החרוז ב-PBS. אין להשאיר את החרוזיים בתמיסת הפנול האדום למשך יותר מ-15 דקות לפני שטיפתם, שכן הדבר עלול לגרום לאובדן הפעילות.חתכו חוט טונגסטן דק לאורכים של שלושה עד ארבעה סנטימטרים. לאחר מכן, הכניסו קטע אחד מהחוט לקצה של פיפטת פסטור מזכוכית והמיסו אותו בעזרת מבער בנזן כדי לקבע אותו במקומו. הכינו עד 10 מחטים כדי להבטיח קיום רזרבות במקרה של נזק. לאחר מכן, הניחו את קצה החוט בלהבת מבער (blow-torch) והחזיקו אותו שם עד שהטונגסטן זוהר בלבן והקצה הופך לחד.תהליך זה אורך כמעט שתי עד שלוש דקות. הוסיפו חמש עד שש טיפות של דיו אינדיה לאמנות ל-15 milliliters של PBS המכיל 100 units של Penicillin ו-0.1 milligrams של Streptomycin למיליליטר. להכנת עוברי העוף, הדגרירו את הביצים כאשר הקצה התמיט פונה כלפי מעלה עד שיגיעו לשלב הרצוי עבור רוב מניפולציות ניצני הגפיים, אשר הוא בדרך כלל שלושה עד חמישה ימים.כאשר הגעתם לנקודת הזמן הרצויה, השתמשו בפינצטה קהה כדי להקיש על הקצה הקהה של הביצה ולשבור את הקליפה. לאחר מכן, השתמשו בפינצטה כדי להסיר את הקליפה ולחשוף את העובר. ודאו שגם קרום תא הביצה הוסר.כדי להדמיה אתו של העובר, הזרק PBS בתוספת מספר טיפות של דיו אינדיה לאמנות, מתחת לעובר, באמצעות מזרק של one milliliter ומחט במידה 21 gauge. לאחר מכן, ניתן להסיר את הקרומי הויטליני המכסה את העובר באמצעות פינצטה עדינה. לאחר מכן, הוסף שתי עד שלוש milliliters של PBS מועשר עם one percent סרום עגל עוברי (fetal calf serum), 100 units per milliliter של Penicillin ו-0.1 milligrams per milliliter של Streptomycin, אל תוך הביצה כדי להבטיח שהעובר לא יתייבש.באמצעות פינצטה מחודדת של שעוניים, פתחו את השליה (amnion) מעל ניצני הגפיים המתפתחים. בשלבים אלה, העובר יתהפך בדרך כלל, כך שהצד הימני יהיה העליון ביותר. ודאו שהעובר אינו מתייבש על ידי הוספת תמיסת PBS מועשרת בעת הצורך.ניתן לפתוח את השילייה המקיפה את העובר באמצעות מחט טונגסטן דקה כדי לחשוף את הגפה המתפתחת. לאחר מכן, השתמש בחוט טונגסטן מחודד כדי לבצע חתך בניצן הגפה שבו יושתל החרוז. הימנע מחיתוך מלא של ניצן הגפה, במידת האפשר.למרות שבשלבים מוקדמים יותר הדבר מקשה, יש להרים חרוז, המצופה בגורם גדילה או בתרופה, באמצעות פינצטה עדינה מאוד של שעונים. אם החרוז השרה ב-DMSO או ב-phenol red, יש לוודא כי הוא נשטף ב-PBS לפני החדרתו לעובר.העבירו את החרוז לעובר באמצעות הפינצטה, ולאחר מכן השתמשו בחוט טונגסטן המשחז כדי להחדיר את החרוז למיקום החתך. הוסיפו מלמיליטר אחד עד שניים נוספים של תמיסת PBS מועשרת לביצה כדי להבטיח שהעובר יישאר רווי. הימנעו מהשקת התמיסה ישירות על העובר עצמו, שכן הדבר עלול לפגוע בעובר ולגרום להחלקתו של החרוז.בשלב הבא, השתמשו במזרק של עשרה מיליליטרים, המצויד במחט במידה 19, כדי להוציא כמות של אלבומין המספיקה רק כדי להבטיח שהעובר לא יבוא במגע עם הסרט המשמש לאטימה של הביצה. ודאו שהמחט אינה פוגעת בחלמון, על ידי החלקתה לאורך הדופן הפנימית של הקליפה. לבסוף, אטמו את הביצה בעזרת סרט והחזירו אותה למדגרה.על מנת לאשש כי FGF18 מסוגל לפעול דרך MEK כדי לזרחן את ERK, העוברים נאספו שעה לאחר השתלת החרוז ונצבעו אימונוהיסטוכימית לנוכחות של ERK מזורחן, שניתן לראות מסביב לחרוז המשתל בתמונה מימין. בשלב HH 21, MyoD אינו מובע במיובלסטים של הגפיים המתפתחות. עם זאת, ניתן לראות צביעה במיוטום של הסומיטים המתפתחים.שש שעות לאחר השתלת חרוז FGF18, ניתן לראות השראה של MyoD במיובלסטים הסמוכים לחרוז. זאת בעוד שבגפה הנגדית לא נצפתה ביטוי. ביטוי זה ניתן לעכב על ידי השתלה משולבת של חרוז מצופה במעכב MEK כגון U0126.באופן דומה, השתתלת של חרוז U0126 בשלב HH 21 מפחיתה את הביטוי האנדוגני של MyoD לאחר 24 שעות, בהשוואה לגפה הנגדית שלא טופלה. בניצני גפיים, בשלב HH 19, FGF18 אינו משרה MyoD. עם זאת, השתתלת משותפת של חרוזים שהספגו FGF18 ואנטגוניסט לחומצה רטינואית יכולה להתגבר על כך, ו-MyoD אקטופי מזוהה.לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו בשלוש עד ארבע דקות, אם היא מבוצעת כראוי. הפיתוח של טכניקה זו אפשר לחוקרים בתחום הביולוגיה ההתפתחותית לחקור את השליחויות של גורמי גדילה בהתפתחות העובר. בעת ביצוע טכניקה זו, חשוב לזכור לא להניח לעובר להתייבש.לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להשתיל חרוזיים לעוברים בשלבי התפתחות, כדי לקבוע כיצד סיגנל של גורמי גדילה משפיע על ההתפתחות.

grafting-beads-into-developing-chicken-embryo-limbs-to-identify

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

קיים מגוון של גורמי גדילה וחלבונים אינטראקציה לגרום לתאים לקחת על גורלות תאים שונים במהלך ההתפתחות. כאן אנו מדגימים את השימוש כהכנה אובו לכתובת האינטראקציות האפשריות בין חלבונים שונים בהתפתחות ידי הצבת חרוזים על E2.5 עוברי אפרוח.

הצבת פקטור מצופה חרוזים צמיחה על עוברי תרנגולת בשלב מוקדם

אינדוקציה עצבית היא הצעד הראשון ביצירת המוח. זהו המנגנון שבאמצעותו הצומת של Hensen (מארגן), מורה רקמות סמוכות לאמץ גורל עצביים, כלומר להצמיח מערכת העצבים. וידאו זה מדגים assay לזירוז העצבית בעובר האפרוח.

Assay עבור אינדוקציה עצבית בעובר צ&#39;יק

Chorioallantoic חומוס קרום (רמ"א) הוא ייחודי, immunodeficient באופן טבעי בסביבה תומכת תרבות ללמוד אנגיוגנזה tumorigenesis. מאמר זה וידאו מדגים את השלבים השונים...

אפרוח אובו לשעבר תרבות אובו לשעבר CAM Assay: איך זה באמת עובד

מאמר זה מתאר השתלת רקמות טכניקה שנועדה לבדוק את איתות ותכונות של דפוסים האאקטודרם משטח cephalic במהלך הפיתוח craniofacial.

הערכת נכסים איתות של Ectodermal epithelia במהלך פיתוח Craniofacial

מקור: Delalande, J., et.al. תיוג כפול של תאי פסגה עצבית וכלי דם בתוך עוברי עוף באמצעות השתלת צינור עצבישל אפרוח GFP והזרקת צבע קרבוציאנין DiI. J. Vis. Exp. (2015)סרטון זה מדגים השתלה של צינור עצבי תורם המסומן ב-GFP מעובר עוף טרנסגני מותאם שלב לעובר מקבל ברמה של סומיטים 1 עד 7, ולאחר מכן תיוג כלי דם באמצעות צבע פלואורסצנטי ליפופיל. הגישה המשולבת מאפשרת הדמיה ישירה של העובר תחת מיקרוסקופ סטריאופלואורסצנטי, ומאפשרת לחקור את אינטגרציית השתלים העצביים והתפתחות רשת כלי הדם בביצה.

הדמיה של רשתות עצביות וכלי דם בעובר תרנגולת

צפייה וגישה לעובר התרנגולת במהלך ההתפתחות יכולה להיות מאתגרת. פיתחנו שיטת ex ovo שהיא פשוטה, חסכונית וניתן להשתמש בה בקלות בכיתה או במסגרת מחקר. שיטה זו מספקת גישה לעובר בשלבים מאוחרים של התפתחות עוברית (HH 40).

מותאם באופן מיטבי Ex-אובו Culturing של Chick עוברים לשלבים מתקדמים של פיתוח

כאן אנו מדווחים על תיוג כפול של תאי ציצה עצביים וכלי דם באמצעות השתלת צינור עצביGFP אפרוחים בשילוב עם הזרקת DiI תוך וסקולרית. טכניקה ניסיונית זו מאפשרת לנו לדמיין וללמוד בו זמנית את ההתפתחות של מערכת העצבים (האנטרית) הנגזרת מ- NCC ומערכת כלי הדם, במהלך אורגנוגנזה.

תיוג כפול של תאי ציצה עצבית וכלי דם בתוך עוברי עוף באמצעות שתל צינור עצביGFP אפרוח והזרקת צבע DiI Carbocyanine

דג הזברה הוא מערכת מודל מצוינת למחקרים גנטיים והתפתחותיים. השתלת חרוזים היא טכניקה חשובה למניפולציה של רקמות שניתן להשתמש בה כדי לחקור מנגנוני התפתחות על ידי הכנסת שינויים בסביבות תאיות מקומיות. פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע השתלת מיקרו-חרוזים בעובר דג הזברה.

Microbead השרשה בעובר דג הזברה

מתוארים פרוטוקולים המשתמשים במחסומים אטומים לחסימת אירועי אינדוקציה בין רקמות ציר הגוף הראשי והצד בעובר הגוזל הנדרשים להיווצרות גפיים. חרוזים ספוגים באותות אינדוקטיביים מועמדים משמשים להתגברות על ההשפעה של מיקום מחסום וניתוח ביטוי גנים מאשר זאת.

יישום של חסמים בלתי חדירים בשילוב עם חרוזים ספוגים פקטור מועמד ללמוד איתותי אינדוקטיבי של צ&#39;יק

גפיים רקומביננטיות הן מודל ניסיוני רב עוצמה המאפשר לחקור את תהליך התמיינות התאים ויצירת דפוסים בהשפעת אותות עובריים. פרוטוקול זה מציג שיטה מפורטת ליצירת גפיים רקומביננטיות עם תאי עוף גפיים-מזודרמליים, הניתנים להתאמה לסוגי תאים אחרים המתקבלים מאורגניזמים שונים.

גפיים רקומביננטיות של עוף בודקות כדי להבין את מורפוגנזה, דפוסים וצעדים מוקדמים בהתמיינות תאים

בדיקת החרוזים הספוגים כוללת אספקה ממוקדת של ריאגנט הבדיקה בכל נקודת זמן התפתחותית כדי לחקור את ויסות התמיינות התאים והמורפוגנזה. מוצג פרוטוקול מפורט, החל על כל מודל ניסיוני של בעלי חיים, להכנת שלושה סוגים שונים של חרוזים מושרים והשתלתם באינטרדיגיט של עובר עוף.

ניתוח התמיינות תאים, מורפוגנזה ותבניות במהלך עוברי עוף באמצעות בדיקת החרוזים המושרים

למדו כיצד להשתיק חרוזים לתוך ניצני גפיים של עוברי עוף כדי לחקור את השפעת גורמי הגדילה והמעכבים על ביטוי גנים. שיטה זו מאפשרת בדיקה ישירה של מסלולי העברת אותות בביולוגיה התפתחותית.

הארכת חרוזים לפיתוח איברי העובר עוף לזהות מסלולי העברת אותות המשפיעים על ביטוי גנים

גלה סרטונים נוספים