הארכת חרוזים לפיתוח איברי העובר עוף לזהות מסלולי העברת אותות המשפיעים על ביטוי גנים
17 בינואר 2016
על ידי השתלת חרוזים ספוגים בגורמי גדילה או מעכבים ספציפיים של מסלולי איתות לעוברים מתפתחים, ניתן לבדוק ישירות את השפעותיהם in vivo. בפרוטוקול זה מושתלים חרוזים בניצן הגפה כדי לקבוע את ההשפעות של מולקולות אלו על ביטוי גנים והעברת אותות.
המטרה הכוללת של הליך זה היא להראות כיצד לקבוע את ההשפעות של גורמי גדילה ומעכבים, בביטוי הגנים של גפיים מתפתחות של עוברי תרנגולות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בביולוגיה התפתחותית, כגון כיצד מולקולות איתות משפיעות על צמיחה והתמיינות של תאים in vivo. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת שיטה לבדיקת גורמים אלה ישירות בעובר.
למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי התפתחות הגפיים, ניתן ליישם אותה גם על מערכות אחרות, כגון רקמה עצבית, סומיטים או קיבה. מי שתדגים את ההליך תהיה רביה מוחמד, סטודנטית לתואר שני מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, העבירו מיליליטר אחד של החרוזים מתמיסת המלאי המקורית לצינור טרי.
הניחו לחרוזים להתייצב, ואז הסירו את הנוזל והחליפו אותו במיליליטר אחד של PBS. חזור על שלב זה חמש פעמים ואחסן את החרוזים השטופים בארבע מעלות צלזיוס, כתרחיץ ב- PBS. בחר את החרוזים להשתלה, על ידי הסרתם מתמיסת המלאי השטופה באמצעות פיפטה של 20 מיקרוליטר והנח אותם למיליליטר אחד של PBS.
בעזרת סטריאוסקופ בחרו חרוזים בקוטר של כ -100 מיקרון. העבירו את החרוזים שנבחרו בשני מיקרו-ליטר נוזל לצלחת פטרי חדשה המכילה טיפה של 20 מיליליטר PBS לאחר מכן, הסר את ה- PBS מהחרוזים. ראשית, עם פיפטה של 20 מיקרו-ליטר, ולאחר מכן, הסר את שאריות הנוזל על ידי פעולה נימית באמצעות מלקחיים של שען עדין.
חשוב להסיר כמה שיותר נוזלים כדי שמקדם הגדילה לא ידולל כאשר הוא מתווסף לחרוזים. פיפטה את גורם הגדילה ישירות על החרוזים. עבור FGF18, הוסף 0.5 מיקרו-ליטר של FGF18 רקומביננטי, משוחזר הוסף 0.5 מיליגרם למיליליטר ב-PBS עם 0.1 אחוז BSA.
לאחר מכן, הניחו כמה טיפות מים סביב שולי הכלי כדי למנוע מהנוזל להתאדות. כשהוא מוכן, דגרו את החרוזים למשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה מוציאים את טיפות המים מהצלחת בעזרת פיפטת פסטר ומניחים את המנה על קרח.
גזור את החרוזים, על ידי שימוש תחילה במרית כדי להעביר את החרוזים לצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. לאחר מכן, הוסיפו מיליליטר אחד של 0.2 חומצה פורמית רגילה ודגרו את החרוזים בחומצה על פלטפורמת טלטול למשך שעה. לאחר מכן, הניחו לחרוזים להתייצב, הסירו את החומצה הפורמית והחליפו אותה במיליליטר מים.
שטפו את החרוזים במשך שעה על משטח הניעור וחזרו על הכביסה שש פעמים כדי להסיר שאריות של חומצה פורמית. לאחר הכביסה האחרונה, הסר את הנוזל שנותר ואחסן את החרוזים בארבע מעלות צלזיוס. השתמש במרית כדי להסיר פלטת חרוזים קטנה בנפח של כחמישה עד עשרה מיקרו ליטר מהציר, והניח את החרוזים בצלחת פטרי של 30 מיליליטר.
לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד של DMSO. לאחר מכן, השתמש בפיפטה P2 המוגדרת לשני מיקרו-ליטר, כדי להעביר חרוזים בקוטר של כ-100 מיקרון, לטיפה של 20 מיקרו-ליטר של ממס בצלחת פטרי נוספת של 30 מיליליטר. הסר את עיקר הממס בעזרת פיפטה של 20 מיקרו ליטר וכל ממס שיורי עם פיפטה של שני מיקרו ליטר.
לאחר מכן, מכסים את החרוזים ב-20 מיקרו-ליטר של התרופה ליישום, מומסים ב-DMSO. דגרו את החרוזים בתמיסת התרופה למשך שעה. הגן על החרוזים מפני אור, מכיוון שמולקולות תרופות רבות רגישות לאור.
כדי לעזור לדמיין את החרוזים, העבירו ארבעה עד חמישה חרוזים בשני מיקרו-ליטר נוזל, ל-20 מיקרו-ליטר של שני אחוז פנול אדום מומס במים. הסר חרוז בודד בעזרת מלקחיים עדינים של יצרן השעונים ושטוף את החרוז ב-PBS. אל תשאיר חרוזים בתמיסה האדומה של הפנול יותר מ-15 דקות לפני שטיפתם, מכיוון שהדבר עלול לגרום לאובדן פעילות.
חותכים חוט טונגסטן עדין לאורכים של שלושה עד ארבעה סנטימטרים לאחר מכן, הכנס חתיכה אחת של החוט, לקצה פיפטה פסטר מזכוכית והמיס במבער בונסן כדי לקבע אותו במקומו. הכן עד 10 מחטים כדי להבטיח שיש חלפים אם הם פגומים. לאחר מכן, הנח את קצה החוט לתוך להבת לפיד והחזק אותו שם עד שהטונגסטן זוהר בלבן והקצה חד.
זה לוקח בערך שתיים-שלוש דקות. הוסף חמש עד שש טיפות של דיו אמן הודו ל-15 מיליליטר PBS המכילים 100 יחידות פניצילין ו-0.1 מיליגרם סטרפטומיצין למיליליטר. כדי להכין את עוברי התרנגולות, דגרו ביצים עם הקצה הבוטה עד שהן מגיעות לשלב הרצוי לרוב המניפולציה של ניצני הגפיים, שהוא בדרך כלל שלושה עד חמישה ימים.
כאשר מגיעים לנקודת הזמן הרצויה, השתמש במלקחיים קהים כדי להקיש על הקצה הקהה של הביצה ולשבור את הקליפה. לאחר מכן, השתמש במלקחיים כדי להסיר את הקליפה ולחשוף את העובר. ודא שגם קרום תא הביצה מוסר.
כדי לדמיין את העובר, יש להזריק PBS בתוספת כמה טיפות של דיו אמן הודי, מתחת לעובר עם מזרק מיליליטר אחד ומחט בקוטר 21. לאחר מכן ניתן להסיר את קרום הוויטלין המכסה את העובר, בעזרת מלקחיים עדינים. לאחר מכן, הוסף שניים עד שלושה מיליליטר של PBS בתוספת עם סרום עגל עוברי של אחוז אחד, 100 יחידות למיליליטר פניצילין ו-0.1 מיליגרם למיליליטר של סטרפטומיצין, לתוך הביצה כדי להבטיח שהעובר לא יתייבש.
בעזרת מלקחיים מושחזים של שען, פתח מי שפיר מעל ניצני הגפיים המתפתחים. בשלבים אלה, העובר בדרך כלל יסתובב, כך שהצד הימני יהיה העליון ביותר. ודא שהעובר לא יתייבש על ידי הוספת עוד מתמיסת PBS משלימה בעת הצורך.
ניתן לפתוח את מי השפיר המקיפים את העובר באמצעות מחט טונגסטן עדינה כדי לחשוף את הגפה המתפתחת. לאחר מכן, השתמש בחוט הטונגסטן המושחז כדי לבצע חתך לתוך ניצן הגפה שבו יושתל החרוז. הימנע מחיתוך כל הדרך דרך ניצן הגפה, במידת האפשר.
אם כי בשלבים צעירים יותר, זה קשה. קח חרוז, מצופה בגורם הגדילה או בתרופה באמצעות מלקחיים עדינים במיוחד של יצרן שעונים. אם החרוז ספוג ב-DMSO או באדום פנול, ודא שהוא נשטף עם PBS לפני מריחתו על העובר.
העבירו את החרוז לעובר באמצעות המלקחיים, ולאחר מכן, השתמשו בחוט הטונגסטן המושחז כדי להכניס את החרוז למקום החתך. הוסף מיליליטר אחד עד שניים נוספים של תמיסת PBS בתוספת לביצית כדי להבטיח שהעובר יישמר לחות. הימנע ממריחת התמיסה ישירות על העובר עצמו, מכיוון שהדבר עלול לפגוע בעובר ולגרום לעקירת החרוז.
לאחר מכן, השתמש במזרק של עשרה מיליליטר, המצויד במחט בגודל 19 כדי להסיר רק את כמות האלבומין הדרושה כדי להבטיח שהעובר לא ייצור מגע עם הסרט המשמש לאיטום הביצה. ודא שהמחט לא תפגע בחלמון, על ידי החלקתה במורד החלק הפנימי של הקליפה. לבסוף, אוטמים את הביצה בעזרת סרט ומחזירים אותה לחממה.
על מנת לאשר ש-FGF18 מסוגל לפעול באמצעות MEK לזרחן ERK, העוברים נקצרו שעה לאחר השתלת החרוזים ונצבעו במערכת החיסון לנוכחות של ERK זרחני, שניתן לראות סביב החרוז המושתל בתמונה מימין. בשלב HH 21, MyoD אינו מתבטא בהתפתחות מיובלסטים בגפיים. למרות שניתן לראות כתמים במיוטום של הסומיטים המתפתחים.
שש שעות לאחר השתלת חרוז FGF18, ניתן לראות את MyoD מושרה במיובלסט קרוב לחרוז. אמנם אין ביטוי בגפה הנגדית. ניתן לעכב ביטוי זה על ידי השתלה משותפת של חרוז, המצופה במעכב MEK כגון U0126.
באופן דומה, השתלת חרוז U0126 בשלב HH 21 מפחיתה את הביטוי האנדוגני של MyoD לאחר 24 שעות, בהשוואה לגפה הנגדית הלא מטופלת. בניצני גפיים, בשלב HH 19, FGF18 אינו גורם ל-MyoD. עם זאת, השתלה משותפת של חרוזים ספוגים ב-FGF18 ואנטגוניסט חומצה רטינואית יכולה להתגבר על כך, ומתגלה MyoD חוץ רחמי.
לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שלוש עד ארבע דקות, אם היא מבוצעת כראוי. פיתוח טכניקה זו, איפשר לחוקרים בתחום הביולוגיה ההתפתחותית לחקור גורמי גדילה המאותתים בהתפתחות עוברים. בזמן ניסיון טכניקה זו, חשוב לזכור לא לתת לעובר להתייבש.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתיל חרוזים בעוברים מתפתחים כדי לקבוע כיצד איתות גורמי גדילה משפיע על ההתפתחות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מדגים כיצד להעריך את השפעותיהם של גורמי גדילה ומעכבים על ביטוי גנים בגפיים של עוברי תרנגולת בשלבי התפתחות. באמצעות השתלת חרוזי פולימר המכילים חומרים אלה לתוך ניצן הגפה, חוקרים יכולים לצפות באופן ישיר בהשפעתם על מסלולי איתות in vivo.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- ביולוגיה התפתחותית
- העברת אותות
- התפתחות עוברית
רקע
- הבנה של האופן שבו מולקולות איתות משפיעות על צמיחה והבידול של תאים היא קריטית בביולוגיה התפתחותית.
- שיטה זו מאפשרת בדיקה ישירה של גורמי גדילה בהקשר עוברי.
- ניתן ליישם את התובנות שנרכשו במערכות ביולוגיות שונות מעבר להתפתחות הגפיים.
- ניתן להשתמש בטכניקה זו גם במחקר של רקמה עצבית ותהליכים התפתחותיים אחרים.
מטרת המחקר
- לחקור את תפקידם של גורמי גדילה ומעכבים בביטוי גנים במהלך התפתחות הגפה.
- לספק שיטה לבדיקת ההשפעות של מולקולות איתות in vivo.
- להגביר את ההבנה של מנגנוני התמיינות תאית וגדילה.
השיטות שנעשה בהן שימוש
- השתלה של חרוזי ספיגה הספוגים בגורמי גדילה או במעכבים לתוך עוברי התפתחות.
- תצפית על ההשפעות על ביטוי גנים והעברת אותות.
- שימוש בעוברי עוף כמערכת מודל למחקרי התפתחות.
- הדגמת הפרוצדורה על ידי סטודנט לתואר שני מהמעבדה.
תוצאות עיקריות
- הטכניקה חושפת בהצלחה את השפעתם של מולקולות ספציפיות על התפתחות הגפיים.
- בדיקה ישירה בעוברי פיתוח מספקת תובחנות בעלות ערך לגבי תהליכי התפתחות.
- התוצאות עשויות להוות בסיס למחקרים נוספים במערכות ביולוגיות קשורות.
- ניתן להתאים את השיטה שהודגמה למגוון מחקרים בביולוגיה התפתחותית.
מסקנות
- פרוטוקול זה מציע גישה חסונה לבחינת ההשפעות של מולקולות איתות in vivo.
- הממצאים תורמים להבנה מעמיקה יותר של ביולוגיה התפתחותית.
- יישומים פוטנציאליים חולשים לתחומים אחרים של מחקר על התפתחות עוברית.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
טכניקת השתלת החרוגים זו מאפשרת בחינה ישירה של מסלולי איתות בהקשר עוברי רלוונטי פיזיולוגית, ותומכת בתיקוף המטרה על ידי קישור הפרעות מולקולריות לתוצאות של ביטוי גנים. היא מספקת קריאה מהירה, in vivo, להערכת השפעות של תרכובות על מסלולי התפתחות, ובכך מסייעת בהפחתת סיכונים מכניסטית מוקדמת של מועמדים טיפוליים. הגישה ניתנת להתאמה לסוגי רקמות שונים, ומספקת פלטפורמה ניתנת להרחבה לסריקה פנוטיפית בביולוגיה של גילוי.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן כיצד גורמי גדילה ומעכבים משפיעים על ביטוי גנים והעברה של אותות בגפיים בהתפתחות.
- ערך תפעולי: מאפשר הובלה מדויקת, מבחינה זמנית ומרחבית, של מולקולות ביו-אקטיביות לעוברים.
- ערך מדעי: מדגים כי ביטוי של MyoD המושרה על ידי FGF18 ופוספורילציה של ERK הם תוצרי מסלול מדידים.
- ערך מדעי: מראה כי עיכוב של פוספורילציה של ERK באמצעות U0126 חוסם הן את ביטוי ה-MyoD האנדוגני והן את הביטוי המושרה.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: תומך בהכנה של מערכות הובלה מבוססות חרוצים עבור מגוון רחב של גורמי גדילה ומעכבי מסלולים.
- ערך תפעולי: מאפשר בחירה סטנדרטית של גודל חרוצים (~100 microns) ונהלי טעינה להצגה הדירה של תרכובות.
- ערך מדעי: מקל על ניסויי השתחיה משולבת לבדיקת השפעות קומבינטוריות, כגון FGF18 עם אנטגוניסטים לחומצה רטינואית.
- ערך תפעולי: כולל פרוטוקולים לוויזואליזציה ושטיפה של חרוצים לשמירה על פעילות התרכובת במהלך ההשתחיה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מאפשר תצפית על הפעלת מסלולים (למשל, pERK) וביטוי גנים במורד המסלול (למשל, MyoD) כסמנים ביולוגיים למודולציה של אותות.
- ערך מדעי: מדגים רזולוציה זמנית של השפעות — השראה של MyoD ב-6 שעות לאחר השתלת FGF18 ודיכוי באמצעות עיכוב MEK.
- ערך מדעי: מראה הפחתה של MyoD אנדוגני לאחר 24 שעות עם U0126 לבדו, מה שתומך בהערכת מעורבות המטרה (target engagement).
- ערך מדעי: ממחיש כיצד ניתן לנתח קשרי גומלה בין מסלולים (למשל, אותות של FGF וחומצה רטינואית) כדי לחשוף בקרה מותנית של גנים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה מתאימה לתהליכי עבודה של שלבי גילוי מוקדמים, שבהם נדרשות תוצאות פנוטיפיות ומכניסטיות כדי לתעדף מטרות או תרכובות המשפיעות על רש רשראות של אותות התפתחותיות.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות על ידי מתחה מניפולציה ישירה של מסלולי FGF ו-MEK in vivo.
- סריקה: מייצר קריאות אימונוהיסטוכימיות ושעתוקיות כמותיות (למשל, pERK, MyoD) להשוואת השפעת תרכובות.
- אנליטיקה: מספק מפות הפעלה בעלות רזולוציה מרחבית ופרופילי ביטוי זמניים כדי להסיק על תגובות התלויות במינון ובתוזמנית.
- מחקר טרנסלציונלי: מקשר בין אירועי איתות עובריים למסלולים שמורים הרלוונטיים להתפתחות אנושית ולמדלי מחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: ניתן להתאמה לרקמות עצביות, סומיטים וגסטרולציה, מה שמאפשר יישום חוצה-פרויקטים בפרמקולוגיה של התפתחות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: הפחתת סיכונים מכניסטית באמצעות קישור ישיר בין עיכוב של מסלול לבין שינויים פנוטיפיים בביטוי גנים.
- ערך תפעולי: שלבים סטנדרטיים להכנת חרוזיים, השתלה ודגירה תומכים בחזרתיות בין ניסויים.
- ערך אסטרטגי: מסייע בקבלת החלטות של go/no-go על ידי חשיפת השפעות on-target וספציפיות של מסלולים בשלב מוקדם של הגילוי.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף של תרכובות על בסיס היכולת לווסת צמתי סיגנלינג התפתחותיים בעל דינמיקה זמנית מוגדרת.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטכניקות אמבריולוגיות, מיקרו-כירורגיה ושיטות זיהוי פלואורסצנטיות או כרומוגניות.
- תלוי בכלי ניתוח סטריליים, מחטי טונגסטן ותשתיות דגירה לפרוצדורות בביצים.
- מחייב שטיפה סטנדרטית של חרוזים וטעינת תרכובות למניעת דילול או אובדן פעילות.
- חייב להתחשב בהידרציה של העובר ובבקרה סביבתית למניעת ארטיפקטים התפתחותיים.
- מוגבל על ידי חלונות חיוניות העוברים ויעילות שימור החרוזים, אשר עשויים להשפיע על תפוקת הבדיקה.
