MRI פונקציונלי optogenetic
19 באפריל 2016
פרוטוקול זה מתאר את השלבים וניתוח הנתונים הנדרשים לביצוע מוצלח של הדמיית תהודה מגנטית תפקודית אופטוגנטית (ofMRI). ofMRI היא טכניקה חדשה המשלבת קריאת fMRI בשדה גבוה עם גירוי אופטוגנטי, ומאפשרת מיפוי ספציפי לסוג התא של מעגלים עצביים פונקציונליים והדינמיקה שלהם על פני כל המוח החי.
המטרה הכוללת של הליך הדמיה זה היא לשלב F-MRI עם גירוי אופטוגנטי למיפוי ספציפי לסוג התא של מעגלים עצביים תפקודיים והדינמיקה שלהם על פני כל המוח החי. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום מדעי המוח כגון קביעת תפקידם של אלמנטים ספציפיים במעגל המוח בהנעת פעילות מוחית גלובלית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת גירוי ספציפי לסוג התא וקריאה ברזולוציה מרחבית גבוהה יחסית של פעילות מוחית גלובלית.
מי שידגים את ההליך הזה יהיו ג'יה ליו וג'ונגנאן פאנג, סטודנטים לתארים מתקדמים במעבדה שלי. לאחר הרדמת החיה כמתואר בפרוטוקול הטקסט, יש לגלח את הראש עם סכין גילוח חשמלי ולבצע קרצוף כירורגי משולש על העור באמצעות בטדין ושטיפת אתנול 70%. לאחר מכן, שתק את גולגולת החיה במנגנון סטריאוטקסי.
השתמשו באזמל כדי לבצע חתך של 15 עד 20 מ"מ בקו האמצע של הקרקפת. החזר את הקרקפת באמצעות המוסטטים כירורגיים המחוברים לפריוסטאום. זהה את מיקומי Lambda ו-Bregma על הגולגולת, ולאחר מכן מקם את המקדח מעל אזור העניין, או ROI.
קדחו קרניוטומיה קטנה מעל ה-ROI בעזרת מקדחה דנטלית, והקפידו לא לנקב את המוח. הכניסו לאט מחט המחוברת למזרק המיקרוליטר דרך הגולגולת לתוך ה-ROI במוח. לאחר מכן השתמש בבקר משאבת מיקרו-מזרק כדי להזריק שני מיקרוליטר של תמיסת הווקטור לתוך ה-ROI.
לאחר השלמת ההזרקה, המתן 10 דקות, ולאחר מכן הסר לאט את המזרק בקצב של 0.5 מילימטרים לדקה. לאחר ההזרקה יש לייבש את פני הגולגולת. אשר קואורדינטות עבור החזר ה-ROI והכנס את שתל הטבעת לעומק היעד בקצב של 0.5 מילימטר לדקה.
לבסוף, הרכיב את שתל החוט על הגולגולת באמצעות מלט דנטלי. לאחר שהמלט הדנטלי התמצק, אטמו את החתך בתפרים סביב מכסה המלט הדנטלי. התחל בחיבור כבל תיקון הסיבים האופטיים למקור אור לייזר, ומדוד את הפלט בקצה הקנה של כבל התיקון עם מד כוח.
התאימו את רמת ההספק המתאימה כדי לייצר את הפלט הרצוי בקצה הכבל הסיבי האופטי, המושתל בתוך המוח. מנע דליפת אור מהשתל על ידי כיסוי עיני החיה. לאחר מכן, הניחו את הסליל מעל ראש החיה.
השתמש בשרוול טבעת כדי להחזיק את כבל הסיבים האופטיים לשתל הטבעת. הכנס את העריסה עם החיה לתוך קדח הסורק. עקוב אחר קצב הנשימה וה-CO2 של הגאות וטמפרטורת הגוף לאורך כל הניסוי על ידי התאמת מכונת ההנשמה המלאכותית כדי לשמור על ערכים פיזיולוגיים בגבולות הנכונים.
חבר כבלי BNC מיציאת ההפעלה של סורק ה-MRI למחולל הפונקציות. בחר רצף מיקום ולחץ על סריקה בחלון הפעולה. לחץ על המשך כדי לדמות את מיקום הראש של החיה.
אם המוח לא נמצא באיזוסנטר, התאימו את מיקום ראש החיה וחזרו על סריקת המיקום עד שהמוח נמצא באיזוסנטר. רכוש תמונה אנטומית ברזולוציה גבוהה כדי לבדוק את השלמות הכללית של המוח, ולאשר את מיקום שתל הסיב האופטי. לאחר מכן, בחר רצף משוקלל T2.
התאם את מספר הפרוסות ולאחר מכן לחץ על סרוק כדי לקבל את התמונות האנטומיות העטרתיות המשוקללות ברזולוציה גבוהה T2. לבסוף, בחר שיפוע מרובה פרוסות שנזכר ברצף הד, ולאחר מכן לחץ על המשך כדי לרכוש את התמונה הפונקציונלית. פרוטוקול זה משתמש ב-F-MRI אופטוגנטי כדי לעורר את קליפת המוח המוטורית במודל של בעלי חיים.
מפת הפעלה זו מציגה ווקסלים מופעלים בקליפת המוח המוטורית ובתלמוס, מה שמצביע על קשרים סינפטיים ארוכי טווח בין אזורים אלה. כאן, האות המודגש מוצג עבור ווקסלים פעילים בקליפת המוח המוטורית ובתלמוס במהלך גירוי אופטוגנטי של קליפת המוח המוטורית. פונקציית התגובה ההמודינמית של התלמוס מראה תגובה מאוחרת ביחס לתגובה בקליפת המוח המוטורית לאחר גירוי.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה כיצד לבצע ניתוחי השתלה והדמיית תהודה מגנטית תפקודית אופטוגנטית. לאחר שליטה, ניתן להשלים הליך הדמיה זה תוך שעתיים. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב מאוד לעקוב אחר החיה ולשמור על הפיזיולוגיה שלה בגבולות הנורמליים.
בעקבות הליך זה, ניתן להשתמש בשיטות משלימות, כגון אלקטרופיזיולוגיה כדי לחקור את הדינמיקה הטמפורלית של נוירואקטיביות, או אימונוהיסטוכימיה כדי לאמת את הביטוי והספציפיות של האופסין. פיתוח הטכניקה הזו סלל את הדרך למדעני מוח לחקור קישוריות תפקודית במוח חי ושלם. אל תשכח שעבודה עם סורק MRI יכולה להיות מסוכנת ביותר.
יש לנקוט תמיד באמצעי זהירות כגון הרחקת ציוד מגנטי מספיק מהסורק בעת ביצוע הליך זה.
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר את הנוהל וניתוח הנתונים לביצוע הדמיית תהודה מגנטית תפקודית אופטוגנטית (ofMRI), טכניקה המשלבת fMRI בשדה גבוה עם גירוי אופטוגנטי. שיטה זו מאפשרת לחוקרים למפות מעגלים עצביים פונקציונליים ודינמיקה שלהם במוחות חיים עם ספציפיות לסוג תא.
רכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- מדעי המוח
- טכניקות הדמיה
- אופטוגנטיקה
רקע
- ofMRI משלבת fMRI וגירוי אופטוגנטי.
- טכניקה זו מאפשרת מיפוי מדויק של מעגלים עצביים.
- היא מתייחסת לשאלות מרכזיות לגבי פונקציות מעגלי המוח.
- רזולוציה מרחבית גבוהה היא יתרון משמעותי של שיטה זו.
מטרת המחקר
- להדגים את השימוש ב-ofMRI לחקר מעגלים עצביים.
- לספק פרוטוקול מפורט לחוקרים.
- להדגיש את החשיבות של ניטור פרמטרים פיזיולוגיים במהלך הנוהל.
שיטות בשימוש
- הכנת בעלי חיים והקהה.
- קרניטומיה והזרקת תמיסת וקטור למוח.
- השתלת כבל סיב אופטי וחיבור למקור אור לייזר.
- שימוש במכשיר MRI לצורך הדמיה ואיסוף נתונים.
תוצאות עיקריות
- מפות הפעלה מראות חיבורים בין קליפת המוח המוטורית לתלמוס.
- הוכחה לתגובה המודינמית המאוחרת בתלמוס.
- יישום מוצלח של גירוי אופטוגנטי במהלך ההדמיה.
- ניתן להשלים את הנוהל בכשעתיים.
מסקנות
- ofMRI היא כלי חשוב לחקר הקישוריות התפקודית במוח.
- שמירה על הפיזיולוגיה של בעל החיים היא חיונית במהלך הנוהל.
- שיטות משלימות יכולות לשפר את ההבנה של הדינמיקה של הפעילות העצבית.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Optogenetic functional MRI (ofMRI) enables cell-type-specific interrogation of neural circuits with whole-brain spatial resolution, supporting target validation in neuropsychiatric drug discovery. By linking precise circuit manipulation to global brain activity readouts, the method enhances mechanistic de-risking and predictive confidence in early-stage target hypotheses. This capability aids portfolio triage by clarifying functional connectivity relevant to disease models and therapeutic mechanisms.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of specific brain circuit elements in driving global activity, supporting therapeutic hypothesis testing.
- Operational Value: Provides cell-type-specific stimulation with high spatial resolution readout of brain dynamics.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates activation maps showing long-range synaptic connections, such as between motor cortex and thalamus, for circuit-based assay design.
- Operational Value: Delivers quantitative BOLD signal measurements enabling comparison of stimulation conditions and network responses.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant system modeling by mapping functional connectivity in intact living brains across healthy and diseased states.
- Operational Value: Facilitates continuity from discovery through preclinical validation via non-invasive, repeatable imaging of neuronal activity.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into discovery biology by enabling hypothesis testing of circuit function, into screening via assay-ready quantitative outputs, and into translational research through disease-relevant connectomic mapping.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing, pathway clarification, and biological de-risking of neural targets.
- Screening: Provides assay standardization, reproducibility, and quantitative BOLD readouts for compound evaluation.
- Analytics: Yields hemodynamic response function data and activation maps to compare circuit engagement across conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity via whole-brain monitoring in disease models.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable platform for circuit-based target validation across neuroscience discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in circuit-based hypotheses.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of circuit-specific brain activation mapping.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in neuropsychiatric programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on circuit-level target engagement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neuroscience, optogenetics, and MRI physics for surgical implantation and image acquisition.
- Needs high-field MRI scanner, laser light source, fiberoptic implants, and physiological monitoring systems.
- Demands cross-team standardization for surgical protocols, light delivery parameters, and imaging sequences.
- Involves adaptation considerations across species, brain regions, and opsin expression systems.
- Includes practical limitations such as surgical invasiveness, light scattering in tissue, and hemodynamic signal interpretation complexity.
