MRI פונקציונלי optogenetic
19 באפריל 2016
פרוטוקול זה מתאר את השלבים וניתוח הנתונים הנדרשים לביצוע מוצלח של הדמיית תהודה מגנטית תפקודית אופטוגנטית (ofMRI). ofMRI היא טכניקה חדשה המשלבת קריאת fMRI בשדה גבוה עם גירוי אופטוגנטי, ומאפשרת מיפוי ספציפי לסוג התא של מעגלים עצביים פונקציונליים והדינמיקה שלהם על פני כל המוח החי.
המטרה הכללית של הליך הדמיה זה היא לשלב f-MRI עם גרייה אופטוגנטית לצורך מיפוי ספציפי לסוג תא של מעגלים עצביים תפקודיים והדינמיקה שלהם בכל רחבי המוח החי. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום מדעי המוח, כגון קביעת תפקידם של רכיבים ספציפיים במעגל המוחי בהנעת פעילות מוחית גלובלית. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת גרייה ספציפית לסוג תא וקריאה ברזולוציה מרחבית גבוהה יחסית של פעילות מוחית גלובלית.
ג'יה ליו וג'ונגנאן פנג, סטודנטים לתואר שני במעבדתי, ידגימו הליך זה. לאחר הרדמת בעל החיים כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב, גדלו את הראש באמצעות תספורת חשמלית ובצעו חיטוי כירורגי משולש של העור באמצעות Betadine ושטיפה של 70% ethanol. לאחר מכן, קבעו את גולגולת בעל החיים במכשיר סטריאוטקסי.
השתמשו בסקלפל כדי לבצע חתך מרכזי בקרקפת באורך של 15 עד 20 מילימטרים. הגבירו את הקרקפת באמצעות המוסטטים כירורגיים המחוברים לפריאוסטיום. זהו את מיקומי ה-Lambda וה-Bregma על הגולגולת, ולאחר מכן מקמו את מקדח הקידוח מעל אזור העניין, או ה-ROI.
קדחו קרניוטומיה קטנה מעל ה-ROI באמצעות מקדח שיניים, תוך הקפדה שלא לנקב את המוח. הכניסו באיטיות מחט המחוברת למזרק מיקרוליטר דרך הקרניוטומיה אל תוך ה-ROI במוח. לאחר מכן, השתמשו בבקר משאבה של מיקרו-מזרק כדי להזריק 2 µL של תמיסת הווקטור לתוך ה-ROI.
לאחר השלמת ההזרקה, המתן 10 דקות, ולאחר מכן הסר לאט את המזרק בקצב של 0.5 millimeters per minute. לאחר ההזרקה, ייבש את פני הגולגולת. אשר את הקואורדינטות עבור ה-ROI והחדר את שתל ה-ferrule לעומק היעד בקצב של 0.5 millimeters per minute.
לבסוף, קבעו את שתל הפרולה (ferrule) לגולגולת באמצעות דבק דנטלי. לאחר שהדבק הדנטלי התמצק, סגרו את החתך באמצעות תפרים מסביב למכסה הדבק הדנטלי. התחילו בחיבור כבל הפיבר-אופטיק למקור אור לייזר, ומדדו את הפלט בקצה גליל כבל הפיבר-אופטיק באמצעות מד הספק.
כוון את רמת ההספק המתאימה כדי להפיק את הפלט הרצוי בקצה כבל הסיב האופטי, המושתל בתוך המוח. למנוע דליפת אור מהשתל על ידי כיסוי עיני בעל החיים. לאחר מכן, הנח את הסליל מעל ראשו של בעל החיים.
השתמשו בשרוול פֵרוּל (ferrule sleeve) כדי לקבע את כבל הסיב האופטי למשתמאל הפרוֹל. הכניסו את המעמד עם החיה לתוך חור הסריקה של הסורק. עקבו אחר קצב הנשימה, ה-CO2 השוטף וטמפרטורת הגוף לאורך כל הניסוי, תוך כיוון המנשם המלאכותי כדי לשמור על הערכים הפיזיולוגיים בטווחים תקינים.
חברו כבלי BNC מפורט ההפעלה (triggering port) של סורק ה-MRI למחולל הפונקציות. בחרו רצף מיקום ולחצו על 'scan' בחלון ההפעלה. לחצו על 'continue' כדי לדמות את מיקום ראש החיה.
אם המוח אינו נמצא במרכז המערכת (isocenter), כווננו את מיקום ראש החיה וחזרו על סריקת המיקום עד שהמוח יהיה במרכז המערכת. רכשו תמונה אנטומית ברזולוציה גבוהה כדי לבדוק את השלמות הכללית של המוח ולאשר את מיקומו של השתל סיב האופטי. לאחר מכן, בחרו רצף תמונות המשוקלל ל-T2.
כווננו את מספר הפרוסות, ולאחר מכן לחצו על 'scan' כדי לרכוש תמונות אנטומיות קורונליות ברזולוציה גבוהה המשוקללות ל-T2. לבסוף, בחרו רצף gradient recalled echo רב-פרוסות, ולאחר מכן לחצו על 'continue' כדי לרכוש את התמונה הפונקציונלית. פרוטוקול זה משתמש ב-f-MRI אופטוגנטי כדי לעורר את קליפת המוח המוטורית במודל בעלי חיים.
מפת הפעילות הזו מציגה ווקסלים פעילים בקליפת המוח המוטורית ובתלמוס, המעידים על קשרים סינפטיים ארוכי טווח בין אזורים אלה. כאן, האות המודגש מוצג עבור ווקסלים פעילים בקליפת המוח המוטורית ובתלמוס במהלך גירוי אופטוגנטי של קליפת המוח המוטורית. פונקציית התגובה ההמודינמית התלמוסית מראה תגובה מושהית ביחס לתגובה בקליפת המוח המוטורית לאחר הגירוי.
לאחר צפייה בסרטון זה, תגמרו עם הבנה טובה של אופן ביצוע ניתוחי השתלה ודימות תהודה מגנטית תפקודי אופטוגנטי. לאחר השליטה בטכניקה, ניתן להשלים הליך דימות זה תוך שעתיים. במהלך ביצוע פרוצדורה זו, חשוב מאוד לנטר את החיה ולשמור על מדדיה הפיזיולוגיים בטווח הנורמה.
בעקבות פרוצדורה זו, ניתן להשתמש בשיטות משלימות, כגון אלקטרופיזיולוגיה לבחינת הדינמיקה הזמנית של הפעילות העצבית, או אימונוהיסטוכימיה לאישור הביטוי והספציפיות של האופסין. פיתוח טכניקה זו סלל את הדרך עבור מדעני מוח לחקור קישוריות תפקודית במוח חי ושלם. אין לשכוח כי עבודה עם סורק MRI עלולה להיות מסוכנת ביותר.
במהלך ביצוע הליך זה, יש להקפיד תמיד על אמצעי זהירות, כגון שמירה על מרחק מספיק בין הציוד המגנטי לסורק.
סקירה כללית
פרוטוקול זה מפרט את ההליך ואת ניתוח הנתונים לביצוע דימות תהודה מגנטית תפקודי אופטוגנטי (ofMRI), טכניקה המשלבת fMRI בשדה גבוה עם גרייה אופטוגנטית. שיטה זו מאפשרת לחוקרים למפות מעגלים עצביים תפקודיים ואת הדינמיקה שלהם במוחות חיים עם ספציפיות לסוג התא.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- טכניקות דימות
- אופטוגנטיקה
רקע
- ofMRI משלב fMRI וגירוי אופטוגנטי.
- טכניקה זו מאפשרת מיפוי מדויק של מעגלים עצביים.
- היא נותנת מענה לשאלות מפתח בנוגע לתפקודי מעגלי המוח.
- רזולוציה מרחבית גבוהה היא יתרון משמעותי של שיטה זו.
מטרת המחקר
- להדגים את השימוש ב-ofMRI לחקר מעגלים עצביים.
- לספק פרוטוקול מפורט עבור חוקרים.
- להדגיש את החשיבות של ניטור פרמטרים פיזיולוגיים במהלך ההליך.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת בעלי החיים והרדמה.
- קרניאוטומי והזרקת תמיסת וקטור לתוך המוח.
- השתלת כבל סיב אופטי וחיבורו למקור אור לייזר.
- שימוש בסורק MRI לדימות ורכישת נתונים.
תוצאות עיקריות
- מפות הפעלה מראות קשרים בין קליפת המוח המוטורית לבין התלמוס.
- הודגמה תגובה המודינמית מושהית בתלמוס.
- יישום מוצלח של סטימולציה אופטוגנטית במהלך הדמיה.
- ניתן להשלים את הפרוצדורה תוך כשעתיים.
מסקנות
- ofMRI הוא כלי בעל ערך לחקר קישוריות תפקודית במוח.
- שמירה על הפיזיולוגיה של בעלי החיים היא קריטית במהלך הפרוצדורה.
- שיטות משלימות יכולות להעמיק את ההבנה של דינמיקת הפעילות העצבית.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
MRI תפקודי אופטוגנטי (ofMRI) מאפשר חקירה של מעגלים עצביים באופן ספציפי לסוג התא ברזולוציה מרחבית של המוח כולו, ובכך תומך בתיקוף מטרות בתהליך גילוי תרופות לנוירופסיכיאטריה. על ידי קישור של מניפולציה מדויקת במעגל לקריאות של פעילות מוחית גלובלית, השיטה משפרת את הפחתת הסיכונים המכניסטית ואת הביטחון החזוי בהיפותזות של מטרות בשלבים מוקדמים. יכולת זו מסייעת במיון תיקי פיתוח על ידי הבהרת קישוריות תפקודית הרלוונטית למודלים של מחלות ומנגנונים טיפוליים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר חקירה של רכיבים ספציפיים במעגלי מוח המניעים פעילות גלובלית, ובכך תומך בבדיקה של היפותזות טיפוליות.
- ערך תפעולי: מספק גירוי ספציפי לסוגי תאים עם קריאה בעלת רזולוציה מרחבית גבוהה של דינמיקת המוח.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר מפות הפעלה המציגות קשרי סינפסה ארוכי טווח, כגון בין קליפת המוח המוטורית לתלמוס, לצורך תכנון בדיקות מבוססות מעגלים.
- ערך תפעולי: מספק מדידות כמותיות של אות BOLD המאפשרות השוואה בין תנאי גרייה ותגובות רשת.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: תומך במידול מערכות רלוונטי למחלות על ידי מיפוי קישוריות תפקודית במוחות חיים שלמים במצבים בריאים וחולים.
- ערך תפעולי: מאפשר רציפות משלב הגילוי ועד לאישור פרה-קליני באמצעות דימות לא פולשני וחזרתי של פעילות נוירונלית.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת בביולוגיה של גילוי על ידי מתן אפשרות לבדיקת היפותזות לגבי תפקוד מעגלים, בסריקה באמצעות פלטים כמותיים המוכנים לבדיקה, ובמחקר תרגומי באמצעות מיפוי קונקטומי הרלוונטי למחלות.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בבדיקת היפותזות, הבהרת מסלולים והסרת סיכונים ביולוגיים של מטרות עצביות.
- סריקה: מספקת סטנדרטיזציה של הבדיקה, הדירות ותוצאות BOLD כמותיות להערכת תרכובות.
- אנליטיקה: מניבה נתונים של פונקציית תגובה המודינמית ומפות הפעלה להשוואת מעורבות מעגלים בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: מקשר לרצף פרה-קליני באמצעות ניטור של המוח השלם במודלים של מחלות.
- שימוש חוזר ארגוני: מהווה פלטפורמה לשימוש חוזר לצורך תיקוף מטרות מבוסס מעגלים בתוכניות גילוי בתחום מדעי העצבים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון ניבוי, תיקוף מטרה, והפחתת עמימות מכניסטית בהיפותזות המבוססות על מעגלים.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה, הדירות ויכולת הרחבה של מיפוי הפעלה מוחית ספציפית למעגלים.
- ערך אסטרטגי: קבלת החלטות משופרת לגבי המשך או הפסקת פיתוח (go/no-go), יעילות הון והפחתת סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים בתוכניות נוירופסיכיאטריות.
- השפעה על פורטפוליו: תיעוד סדרי עדיפויות והחלטות קידום מותאמות סיכון, המבוססות על מעורבות מטרה ברמת המעגל.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות במדעי המוח, אופטוגנטיקה ופיזיקה של MRI לצורך השתלה כירורגית ורכישת תמונות.
- נדרשים סורק MRI בשדה גבוה, מקור אור לייזר, שתלים של סיבים אופטיים ומערכות לניטור פיזיולוגי.
- נדרש תקינה אחידה בין צוותים עבור פרוטוקולים כירורגיים, פרמטרים של הולכת אור ורצפי הדמיה.
- כולל שיקולי התאמה בין מינים שונים, אזורי מוח ומערכות ביטוי של אופסינים.
- כולל מגבלות מעשיות כגון פולשנות כירורגית, פיזור אור ברקמה ומורכבות של פרשנות אותים המודינמיים.
