Name: Organoids כמודל למחלות זיהומיות: התרבות של האדם וOrganoids הקיבה Murine וMicroinjection של הליקובקטר פילורי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: למד לגדל אורגנואידים קיבתיים אנושיים ומכרסמים ולבצע מיקרו-הזרקה של Helicobacter pylori. שיטה זו מאפשרת חקר מחלות זיהומיות במודל תלת-ממדי תוך שימור מבנה רקמתי אמיתי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

עבודה זו נתמכה על ידי מלגת מארי קירי של האיחוד האירופי (EU/300686-InfO) ל-S.B. ופרס מחקר מהקרן האירופית המאוחדת לגסטרואנטרולוגיה ל-H.C. ברצוננו להודות להארי בגטל, ג'רואן קורבינג ומרכז ההדמיה של הוברכט על הסיוע הטכני, למריטקסל הוך על העזרה בתרבית אורגנואידים ראשונית וליאנה זברוס על הדיון.

<ol><li>Aiuto, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Models+to+Investigate+Human+Cytomegalovirus+Infection+in+Neural+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Models to Investigate Human Cytomegalovirus Infection in Neural Cells.</a> PLoS ONE. 7 (11), e49700(2012).</li>
<li>Penkert, R. R., Kalejta, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Embryonic+Stem+Cell+Lines+Model+Experimental+Human+Cytomegalovirus+Latency%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Human Embryonic Stem Cell Lines Model Experimental Human Cytomegalovirus Latency.</a> mBio. 4 (3), e00298-13-e00298-13(2013).</li>
<li>Roelandt, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pluripotent+stem+cell-derived+hepatocytes+support+complete+replication+of+hepatitis+C+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Human pluripotent stem cell-derived hepatocytes support complete replication of hepatitis C virus.</a> J Hepatol. 57 (2), 246-251 (2012).</li>
<li>Schwartz, R. E., Trehan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+hepatitis+C+virus+infection+using+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Modeling hepatitis C virus infection using human induced pluripotent stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109 (7), 2544-2548 (2012).</li>
<li>Shlomai, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+host+interactions+with+hepatitis+B+virus+using+primary+and+induced+pluripotent+stem+cell-derived+hepatocellular+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Modeling host interactions with hepatitis B virus using primary and induced pluripotent stem cell-derived hepatocellular systems.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 111 (33), 12193-12198 (2014).</li>
<li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Productive+Hepatitis+C+Virus+Infection+of+Stem+Cell-Derived+Hepatocytes+Reveals+a+Critical+Transition+to+Viral+Permissiveness+during+Differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Productive Hepatitis C Virus Infection of Stem Cell-Derived Hepatocytes Reveals a Critical Transition to Viral Permissiveness during Differentiation.</a> PLoS Pathogens. 8 (4), e1002617(2012).</li>
<li>Yoshida, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+human+hepatocyte-like+cells+derived+from+induced+pluripotent+stem+cells+as+a+model+for+hepatocytes+in+hepatitis+C+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Use of human hepatocyte-like cells derived from induced pluripotent stem cells as a model for hepatocytes in hepatitis C virus infection.</a> Biochem Biophys Res Commun. 416 (1-2), 119-124 (2011).</li>
<li>Ng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+iPSC-Derived+Hepatocyte-like+Cells+Support+Plasmodium+Liver-Stage+Infection+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Report%22%5BJournal%5D)">Human iPSC-Derived Hepatocyte-like Cells Support Plasmodium Liver-Stage Infection In Vitro.</a> Stem Cell Report. 4 (2), (2015).</li>
<li>Klotz, C., Aebischer, T., Seeber, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell-derived+cell+cultures+and+organoids+for+protozoan+parasite+propagation+and+studying+host-parasite+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Stem cell-derived cell cultures and organoids for protozoan parasite propagation and studying host-parasite interaction.</a> Int J Med Microbiol. 302 (4-5), 203-209 (2012).</li>
<li>Engevik, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+NHE3+alters+gut+microbiota+composition+and+influences+Bacteroides+thetaiotaomicron+growth%5BTitle%5D)+AND+%22AJP%3A+GI%22%5BJournal%5D)">Loss of NHE3 alters gut microbiota composition and influences Bacteroides thetaiotaomicron growth.</a> AJP: GI. 305 (10), G697-G711 (2013).</li>
<li>Wilson, S. S., Tocchi, A., Holly, M. K., Parks, W. C., Smith, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small+intestinal+organoid+model+of+non-invasive+enteric+pathogen-epithelial+cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">A small intestinal organoid model of non-invasive enteric pathogen-epithelial cell interactions.</a> Mucosal Immunol. 8 (2), 352-361 (2015).</li>
<li>McCracken, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+human+development+and+disease+in+pluripotent+stem-cell-derived+gastric+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Modelling human development and disease in pluripotent stem-cell-derived gastric organoids.</a> Nature. 516 (7531), 400-404 (2014).</li>
<li>Bartfeld, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Expansion+of+Human+Gastric+Epithelial+Stem+Cells+and+Their+Responses+to+Bacterial+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">In Vitro Expansion of Human Gastric Epithelial Stem Cells and Their Responses to Bacterial Infection.</a> Gastroenterology. 148 (1), (2014).</li>
<li>Schlaermann, P., Toelle, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+human+gastric+primary+cell+culture+system+for+modelling+Helicobacter+pylori+infection+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro.</a> Gut. , (2014).</li>
<li>Bertaux-Skeirik, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD44+Plays+a+Functional+Role+in+Helicobacter+pylori-induced+Epithelial+Cell+Proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">CD44 Plays a Functional Role in Helicobacter pylori-induced Epithelial Cell Proliferation.</a> PLOS Pathogens. 11 (2), e1004663(2015).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt+villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+Expansion+of+Epithelial+Organoids+From+Human+Colon%2C+Adenoma%2C+Adenocarcinoma%2C+and+Barrett%27s+Epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term Expansion of Epithelial Organoids From Human Colon, Adenoma, Adenocarcinoma, and Barrett's Epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li>
<li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lgr5%2Bve+Stem+Cells+Drive+Self-Renewal+in+the+Stomach+and+Build+Long-Lived+Gastric+Units+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Lgr5+ve Stem Cells Drive Self-Renewal in the Stomach and Build Long-Lived Gastric Units In Vitro.</a> Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+expansion+of+single+Lgr5%2B+liver+stem+cells+induced+by+Wnt-driven+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration.</a> Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Term+Culture+of+Genome-Stable+Bipotent+Stem+Cells+from+Adult+Human+Liver%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Long-Term Culture of Genome-Stable Bipotent Stem Cells from Adult Human Liver.</a> Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).</li>
<li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+Models+of+Human+and+Mouse+Ductal+Pancreatic+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Organoid Models of Human and Mouse Ductal Pancreatic Cancer.</a> Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).</li>
<li>Karthaus, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+multipotent+luminal+progenitor+cells+in+human+prostate+organoid+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures.</a> Cell. 159 (1), 163-175 (2014).</li>
<li>Bartfeld, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+and+single-cell+imaging+of+NF-kappaB+oscillations+using+monoclonal+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+cell%22%5BJournal%5D)">High-throughput and single-cell imaging of NF-kappaB oscillations using monoclonal cell lines.</a> BMC cell. 11, 21(2010).</li>
<li>Blanchard, T. G., Nedrud, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+Maintenance+of+Helicobacter+Species%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Laboratory Maintenance of Helicobacter Species.</a> Curr Protoc Microbiol. , (2006).</li>
<li>Van Es, J. H., de Geest, N., van de Born, M., Clevers, H., Hassan, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+stem+cells+lacking+the+Math1+tumour+suppressor+are+refractory+to+Notch+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Intestinal stem cells lacking the Math1 tumour suppressor are refractory to Notch inhibitors.</a> Nat Commun. 1 (2), 1-5 (2010).</li>
<li>Andersson-Rolf, A., Fink, J., Mustata, R. C., Koo, B. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Video+Protocol+of+Retroviral+Infection+in+Primary+Intestinal+Organoid+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture.</a> J Vis Exp. (90), (2014).</li>
<li>Stange, D. E., Koo, B. -K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiated+Troy%2B+Chief+Cells+Act+as+Reserve+Stem+Cells+to+Generate+All+Lineages+of+the+Stomach+Epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Differentiated Troy+ Chief Cells Act as Reserve Stem Cells to Generate All Lineages of the Stomach Epithelium.</a> Cell. 155 (2), 357-368 (2013).</li>
<li>Van de Wetering, M., Sancho, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+beta-catenin%2FTCF-4+complex+imposes+a+crypt+progenitor+phenotype+on+colorectal+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The beta-catenin/TCF-4 complex imposes a crypt progenitor phenotype on colorectal cancer cells.</a> Cell. 111 (2), 241-250 (2002).</li>
<li>Schumacher, M. A., Aihara, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+murine-derived+fundic+organoids+in+studies+of+gastric+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Physiol%22%5BJournal%5D)">The use of murine-derived fundic organoids in studies of gastric physiology.</a> Journal Physiol. 593 (8), 1809-1827 (2015).</li>
<li>Schwank, G., Andersson-Rolf, A., Koo, B. -K., Sasaki, N., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+BAC+Transgenic+Epithelial+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Generation of BAC Transgenic Epithelial Organoids.</a> PLoS ONE. 8 (10), e76871(2013).</li>
<li>Koo, B. -K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+gene+expression+in+primary+Lgr5+organoid+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures.</a> Nat Meth. 9 (1), 81-83 (2012).</li>
<li>Schwank, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+repair+of+CFTR+by+CRISPR%2FCas9+in+intestinal+stem+cell+organoids+of+cystic+fibrosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients.</a> Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).</li>
<li>Li, V. S. W., Ng, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+Signaling+through+Inhibition+of+%CE%B2-Catenin+Degradation+in+an+Intact+Axin1+Complex%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Wnt Signaling through Inhibition of β-Catenin Degradation in an Intact Axin1 Complex.</a> Cell. 149 (6), 1245-1256 (2012).</li>
<li>Van de Wetering, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+derivation+of+a+%27Living+Organoid+Biobank%27+of+colorectal+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Prospective derivation of a 'Living Organoid Biobank' of colorectal cancer patients.</a> Cell. 161 (4), 933-945 (2015).</li>
</ol>

הנס קלברס הוא ממציא של מספר פטנטים על תרבית אורגנואידים. אחרת למחברים אין מה לחשוף.

פרוטוקול זה מתאר את השימוש באורגנואידים ראשוניים מתרחבים ללא הרף ובלתי מותמרים מתאי גזע בוגרים לביולוגיה זיהומית. השלבים הקריטיים הם 1) בידוד בלוטות קיימות, 2) הרחבת אורגנואידים ו-3) מיקרו-הזרקה. להלן כמה הצעות לשינויים, פתרון בעיות ושיקולים טכניים. 
בהשוואה לשיטות בידוד אחרות, המשתמשות בניעור נמרץ או פיפטינג כדי לשחרר בלוטות ויכולות להיות מוצלחות באותה מידה, לטכניקה המוצגת כאן יש יתרון, שניתן לצפות ישירות בשחרור הבלוטות מהרקמה במיקרוסקופ (שלב 1.2.14). אם הבלוטות אינן משתחררות, הדגירה ב-EDTA י...

המחקר של פתוגנים מסתמך על מערכות מודל הולמות לחקות את זיהום in vivo. לכמה סוכנים מזהמים, מערכות מודל הולמות חסרות בעוד שחלק מהמערכות המשמשות הן רחוקות מלהיות אופטימלי. דוגמא אחת היא החיידק הליקובקטר פילורי בקיבה (הליקובקטר פילורי), אשר קשור בקשר סיבתי להתפתחות סרטן קיבה. עם זאת, בהיעדר מערכת תרבית תאים מתאימה יותר, מחקרים רבים שהמטרה לנתח את המנגנונים המולקולריים שבבסיס שורות תאי סרטן שימוש התפתחות הסרטן, המייצגים את נקודת הקצה של המפל הסרטני. תאים ראשוניים, שאינם-שינה יהיו מודל טוב יותר ללימודים אלה. עם זאת, תאים ראשוניים זמינים רק ממספר קטן של תורמים ולא יכולים להיות מתורבת על פני תקופות זמן ארוכות יותר. בשנים האחרונות, מחקר בתאי גזע יש התקדמות משמעותית כדי לספק מקורות חדשים לתרביות תאים ראשוניות לחקר הביולוגיה זיהום. תרבויות משלושה מקורות תאי גזע שימשו: תאי גזע עובריים (ESC), תאי מושרה pluripotent גזע (iPSC) או בתאי גזע בוגרים. הם היו בשימוש מודל זיהומים בוירוסים, כגון וירוס ציטומגלווירוס 1,2 או הפטיטיס C 3 - 7, טפילים, כגון falciparum Plasmodium 8 או Toxoplasma gondii 9, וחיידקים, כגון Bacterioides thetaiotaomicron 10 או 11 enterica סלמונלה. לאחרונה, כמה גישות פורסמו מודל זיהום עם ה &#39; פילורי עם organoids שמקורם בתאי iPS ESC או 12, בתאי גזע בוגרים עכבר 21,22 או אדם בתאי גזע בוגרים 13-15. הפיתוח של תרבויות organoid מתאי גזע בוגרים שמקורם מחקר, שבו תאי גזע בודדים המבודדים מאפיתל במעי עכברי היו זרע לתוך מטריצת 3 ממדים ומשובץ במדיום שחיקה את הסביבה של תאי גזע במעי המכילים EGF כmitogen, R-spondin כדי לשפר איתות Wnt ובחור! לעכב חלבון מורפוגני העצם (BMP) איתות 16. יש לציין תרבויות אלה אינן דורשות שיתוף תרבות עם תאי mesenchymal. בתנאים אלה, תאי הגזע להתרבות וליצור מבנים קטנים עם תחומים מחסה תאים של מאורות מעיים, ותחומים המכילים את התאים של סיסי מעיים. Organoids כך עצמי לארגן לחקות את המצב בvivo. היום, ניתן לגדל תאי גזע בוגרים מרבים עכברי ורקמות אנושיות במבחנה ועצמית לארגן לorganoids דומה לעמיתם in vivo, כגון מעי דק ומעי גס 17, בטן 13,18, כבד 19,20, לבלב 21 ו ערמונית 22. כאן אנו מספקים וידאו פרוטוקול לעכבר תרבות או organoids קיבה אנושי מcel גזע בוגריםls וmicroinject עם ה &#39; פילורי. פרוטוקול זה מבוסס על דיווחים קודמים 13,18. שיטה זו יכולה להיות מותאמת לculturing ומדביק תרבויות organoid אחרות כגון organoids מעיים.

<table><tbody><tr><td><חזק>בינוני</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Invitrogen</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>מתקדם DMEM/F12</td><td>Invitrogen</td><td>12634-028</td><td></td></tr><tr><td>מטריג'ל, GFR, BD ללא פנול</td><td></td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Invitrogen</td><td>35050-079</td><td>ריכוז מלאי 200 מ"מ, ריכוז סופי 2 מ"מ</td></tr><tr><td>B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td>ריכוז מלאי 50 x, ריכוז סופי 1x</td></tr><tr><td>N-Acetylcysteine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165-5G</td><td>ריכוז מלאי 500 מ"מ, ריכוז סופי 1 מ"מ</td></tr><tr><td>רקומביננטי עכברי EGF</td><td>Invitrogen</td><td>PMG8043</td><td>ריכוז מלאי 500 ומיקרו; גרם/מ"ל, ריכוז סופי 50 ננוגרם/מ"ל</td></tr><tr><td>רקומביננט אנושי FGF10</td><td>Peprotech</td><td>100-26</td><td>ריכוז מלאי 100 ומיקרו; גרם/מ"ל, ריכוז סופי 200 ננוגרם/מ"ל</td></tr><tr><td>TGF&beta; i A-83-01</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td>ריכוז מלאי 500 ומיקרו; M, ריכוז סופי 2 ומיקרו; M&nbsp;</td></tr><tr><td>ניקוטינמיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>N0636</td><td>ריכוז מלאי 1 M, ריכוז סופי 10 mM&nbsp;</td></tr><tr><td>[Leu15]-Gastrin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9145</td><td>ריכוז מלאי 100 ומיקרו; M, ריכוז סופי 1 ננומטר</td></tr><tr><td>RHOKi Y-27632</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>Y0503</td><td>ריכוז מלאי 10 מ"מ, ריכוז סופי 10 ומיקרו; M</td></tr><tr><td>Wnt3A</td> קו תאים יציב בינוני <td></td><td></td><td>מותנה שנוצר במעבדת Clevers. ריכוז סופי 50%. ניתן להשיג תאים מהנס קלברס.</td></tr><tr><td>R-spondin1 מדיום</td><td></td><td></td><td>מותנה קו תאים יציב שנוצר במעבדת Kuo. ריכוז סופי 10%. ניתן להשיג קו תאים מקלווין קואו, סטנפורד.</td></tr><tr>מדיום <td></td><td></td><td>מותנה Noggin</td><td>קו תאים יציב שנוצר במעבדת Clevers. ריכוז סופי 10%. ניתן להשיג תאים מהנס קלברס.</td></tr><tr><td>R-spondin3</td><td>מו"פ D</td><td>3500-RS/CF</td><td>מקור חלופי ל-R-spondin. זה נבדק על אורגנואידים במעי אנושי (1 ומיקרו; גרם/מ"ל), אך עדיין לא על אורגנואידים בקיבה.</td></tr><tr><td>Noggin</td><td>Peprotech</td><td>120-10</td><td>מקור חלופי לנוגין. זה נבדק על אורגנואידים במעי אנושי (100 ננוגרם/מ"ל), אך עדיין לא על אורגנואידים בקיבה.</td></tr><tr><td>TrypLE express</td><td>Life Technologies</td><td>12605036</td><td>פתרון דיסוציאציה אנזימטית&nbsp;</td></tr><tr><td>CoolCell&reg; מיכלי הקפאת תאים ללא אלכוהול</td><td>biocision</td><td>BCS-405</td><td></td></tr><tr><td>התאוששות תרבית תאים הקפאה בינונית</td><td>Invitrogen</td><td>12648-010</td><td></td></tr><tr><td><חזק>אנטיביוטיקה</חזקה></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>פרימוצין</td><td>Invivogen</td><td>ant-pm-1</td><td>הרכב אנטיביוטיקה נגד חיידקים ופטריות. זה מועיל לאחר התחלת תרבות. לתרבית לטווח ארוך אתה יכול לעבור לאנטיביוטיקה אחרת או ללא אנטיביוטיקה.</td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>ריכוז מלאי 10,000/10,000 יח'/מ"ל, ריכוז סופי 100/100 יח'/מ"ל. ניתן להשתמש לחילופין לפרימוצין בתרבית ארוכת טווח.</td></tr><tr><td>פינצטה <חזקה>אחר</חזקה></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>פינצטה</td><td>Neolabs</td><td>2-1033</td><td>עם קצות עדינים מועילה להסרת שכבת השריר מהרקמה.</td></tr><tr><td>4 Well Multidish</td><td>Thermo Scientific</td><td>144444</td><td>אתה יכול להשתמש ב-Multidish אחרים. אלה היו מועילים במיוחד למיקרו-הזרקות מכיוון שיש להם שפה חיצונית נמוכה ומאפשרים יותר ניידות למניפולטור.</td></tr><tr><td>מיקרומניפולטור</td><td>Narishige</td><td>M-152</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו-מזרק</td><td>Narishige</td><td>IM-5B</td><td></td></tr><tr><td>סטריאומיקרוסקופ</td><td>Leica</td><td>MZ75</td><td></td></tr><tr><td>Workbench</td><td>אוויר</td><td></td> נקי <td>בהתאמה אישית כדי להתאים לסטריאומיקרוסקופ במצב ML2</td></tr><tr><td>נימים</td><td>מכשיר הרווארד</td><td>GC100T-10</td><td>קוטר חיצוני 1 מ"מ, קוטר פנימי 0.78 מ"מ.</td></tr><tr><td>Micropipette Puller</td><td>Sutter Instruments</td><td>Flaming Brown Micropipette Puller</td><td></td></tr><tr><td>anti Cag A נוגדן</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-25766</td><td></td></tr></tbody></table>

organoids כמודל למחלות זיהומיות: התרבות של האדם וorganoids הקיבה murine וmicroinjection של הליקובקטר פילורי

Organoids as Model for Infectious Diseases: Culture of Human and Murine Stomach Organoids and Microinjection of Helicobacter Pylori

לאחרונה ביולוגים של זיהומים השתמשו בתרביות שמקורן בתאי גזע כדי לענות על הצורך במודלים חדשים וטובים יותר לחקר אינטראקציות מארח-פתוגן. נעשה שימוש בשלושה מקורות תאיים: תאי גזע עובריים (ESC), תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSC) או תאי גזע בוגרים. כאן מתוארת תרבית של אורגנואידים בקיבה של עכברים ובני אדם שמקורם בתאי גזע בוגרים ומשמשת לזיהום בפתוגן הקיבה הליקובקטר פילורי. בלוטות הקיבה האנושיות מבודדות מחומר כריתה, נזרעות במטריצת מרתף ומוטמעות במדיום המכיל גורמי גדילה אפידרמיס (EGF), R-spondin, Noggin, Wnt, גורם גדילה פיברובלסטים (FGF) 10, גסטרין ומעכב בטא של גורם גדילה טרנספורמטיבי (TGF). בתנאים אלה, בלוטות הקיבה גדלות לאורגנואידים תלת מימדיים המכילים 4 שושלות של הקיבה. האורגנואידים מתרחבים ללא הגבלת זמן וניתן להקפיא ולהפשיר אותם בדומה לקווי תאים. עבור מחקרי זיהום, חיידקים מוזרקים ללומן של האורגנואידים. אורגנואידים נגועים מעובדים להדמיה. ניתן להתאים את השיטות המתוארות לאורגנואידים אחרים ולזיהומים עם חיידקים, וירוסים או טפילים אחרים. זה מאפשר לחקור שינויים הנגרמים על ידי זיהום בתאים ראשוניים.

פרוטוקול זה מאפשר בידוד של בלוטות קיבה (איור 2). בלוטות הם זורעים לתוך מטריצת מרתף, שמבצר כטיפה בתוך היטב, מתן מסגרת 3 ממדים עשיר בlaminin וקולגן כדי לאפשר את הבלוטות לגדול לתוך organoids (איור 3). Organoids בדרך כלל מתחיל ציסטות קטנות ובתוך 12-16 ימים, הם להתרחב לתחומים בקוטר של 50-300 מיקרומטר (איור 4). organoids כמה יישאר פיברוזיס, כמה יתפתח buddings הקטן. האחרון בדרך כלל הוא סימן לתרבות הולך וגדל בריא. בפרוטוקול זה גם אחד של צ...

תרביות שמקורן בתאי גזע טומנות בחובן פוטנציאל אדיר למידול מחלות זיהומיות. כאן מתוארת תרבית של אורגנואידים בקיבה של עכברים ובני אדם שמקורם בתאי גזע בוגרים. האורגנואידים מוזרקים במיקרו עם פתוגן הקיבה הליקובקטר פילורי.

Organoids כמודל למחלות זיהומיות: התרבות של האדם וOrganoids הקיבה Murine וMicroinjection של הליקובקטר פילורי

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. ...

המטרה הכללית של הליך זה היא להפיק אורגנואידים ולהשתמש בהם כמודל תלת-ממדי לביולוגיה של זיהומים. לפני מספר שנים, המעבדה שלי גילתה את LDR five כסמן לתאי גזע במספר איברים בוגרים שונים בעכברים. מאז למדנו להוציא תאי גזע בודדים מאיברים אלו ולגדל אותם בצורת אורגנואידים, גרסאות זעירות של אותם איברים, ובאמצעות טכנולוגיית אורגנואידים, הראנו כעת שניתן לחקור סרטן בפירוט רב, אך גם בעיות של מחלות זיהומיות.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני מידול ביולוגיה של זיהום באמצעות קווי תאים של סרטן הוא שכאן התאים המשמשים הם תאים אפיתליאליים ראשוניים שאינם טרנספורמיים, וכי המבנה התלת-ממדי נשמר, החל מכמירות של כ-1 סמ"ר של רקמת קיבה טרייה. בצחנת פטרי יבשה בקוטר 10 ס"מ, השתמש בפינצטה כדי להסיר בזהירות את שכבת הריר והשריר. שטוף את הרקמה בבופר קישור (chelating buffer) קר בתנועות עדינות קדימה ואחורה.העבירו את הרקמה השטופה לצלחית יבשה חדשה בקוטר 10 סנטימטרים. חתכו את הרקמה ל-25 עד 50 חתיכות קטנות, בגודל של כמעט שני עד חמישה מילימטרים רבועים, והעבירו אותן באמצעות פינצטה למבחנה של 50 מיליליטר. לאחר הרטבת פיפט של 10 מיליליטר בבופר כלטני (chelating buffer), הוסיפו 10 מיליליטר מהבופר למבחנה של 50 המיליליטר ושטפו את החתיכות על ידי פיפטור נמרץ למעלה ולמטה 10 פעמים.המתינו עד שהחלקיקים ישקעו והסירו את הנוזל העליון. חזרו על

organoids-as-model-for-infectious-diseases-culture-human-murine

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

סרטון זה מדגים שיטה להקמת מודל זיהום אורגנואיד קיבה על ידי הזרקה מיקרו של פתוגן קיבה הליקובקטר פילורי לתוך לומן האורגנואידים. מודל זה מסייע בחקר שינויים הנגרמים על ידי זיהום בתאי קיבה.

הקמת מודל זיהום באמצעות מיקרו-הזרקה של אורגנואידים בקיבה עם חיידקים פתוגניים

תאים הגדלים בסביבה תלת-ממדי (3-D) מייצגים שיפור ניכר לעומת טיפוח התא בסביבות 2-D (למשל, צלוחיות או מנות). כאן אנו מתארים את הפיתוח של מודל organotypic 3-D רב-תאיים של רירית המעי אדם מתורבת במיקרוגרבטיציה הניתנים על ידי החלפה-קיר-כלי (RWV) bioreactors.

פיתוח תאיים תלת ממד Organotypic דגם של אדם המעיים הריריים Grown במיקרוגרבטיציה

עכברים מייצגים מודל לא בפז ויוו ללמוד זיהום מחלות הנגרמות על ידי מיקרואורגניזמים במערכת העיכול. כאן, אנו מתארים את השיטות המשמשות ללימוד מושבת חיידקים ושינויים histopathological העכבר מודלים של הליקובקטר פילורי-הקשורים למחלה.

העכבר מודלים של זיהום הליקובקטר , פתולוגיות קיבה

כאן נתאר פרוטוקול על יצירה וערבה culturing האדם ואת העכבר-נגזר תלת-ממדי (3D) קיבה organoids, ואת שיטת להעברת organoids תלת-ממד טפט 2-ממדי. השימוש טפט אפיתל הקיבה כמו assay הרומן פצע שריטה ללימודי התחדשות גם מתואר.

העכבר ואת האדם-נגזר תרבות ראשי קיבה אפיתל חד שכבתי לצורך המחקר של התחדשות

תא גזע הנגרמת על ידי האדם (היפנוסק)-המעי הנגזר אורגנואידים להציע הזדמנויות מרגש למודל בידור מחלות מבחנה. אנו להדגים את הבידול של hiPSCs לתוך מעיים אורגנואידים (iHOs), גירוי של iHOs אלה עם ציטוקינים, ואת המיקרוהזרקה של סלמונלה typhimurium לתוך לומן ihos, המאפשר לימוד של הפלישה אפיתל על ידי זה פתוגן.

באמצעות תא גזע המושרה האדם Pluriפוטנטי-המעי הנגזר אורגנואידים ללמוד ולשנות את התא אפיתל הגנה מפני סלמונלה ופתוגנים אחרים

אנו מתארים פרוטוקולים כדי להכין זיהומים ולטהר את הנבגים עבור לימוד זיהום של המעי האנושי ואורגאואידים על ידי הקריפטוספורידיום parvum. אנו מדגימים את ההליכים למיקרו הזרקה של טפילים לתוך מעיים אורגנואיד וכתמים של אורגנואידים. לבסוף, אנו מתארים את הבידוד. של ציסטות שנוצרו...

לימוד זיהום הצפנה ברקמה תלת-ממדית-מערכות תרבות מיקרואיד של האדם הנגזר על ידי מיקרו-הזרקה

כאן אנו מציגים שני פרוטוקולים המאפשרים מידול של אינטראקציות ספציפיות למעיים. מונו-שכבתי מעיים שמקורם באורגנוידים ותרבויות ממשק נוזלי אוויר (ALI) מאפשרות ליצור אפיתליה מובחנת היטב הנגישה הן מצדי הזוהר והן מצד בזולטר, בעוד שאורגנואידים מעיים הפוכים בקוטביות חושפים את הצד האפי שלהם והם נוחים לתפוקה גבוהה.

שיטות תרבות לחקר אינטראקציות ספציפיות לאפיקליות באמצעות מודלים אורגנויד מעיים

פרוטוקול זה מתאר כיצד להדביק organoids מעיים אנושיים מהצד apical או basolateral שלהם כדי לאפיין אינטראקציות מארח / פתוגן ברמת תא יחיד באמצעות טכנולוגיית רצף RNA של תא יחיד (scRNAseq).

התאמת Organoids במערכת העיכול עבור זיהום פתוגן ורצף תא יחיד תחת בטיחות ביולוגית רמה 3 (BSL-3) תנאים

אורגנואידים שמקורם בקיבה מוצאים שימוש הולך וגובר במחקר, אך פרוטוקולים רשמיים ליצירת אורגנואידי קיבה אנושיים מתעכלים חד-תאיים עם צפיפות זריעה מתוקננת חסרים. פרוטוקול זה מציג שיטה מפורטת ליצירת אורגנואידים בקיבה באופן אמין מרקמת ביופסיה המתקבלת במהלך אנדוסקופיה עליונה.

הקמה ואפיון של אורגנואידי קיבה שמקורם במטופל מביופסיות של גוף קיבה שפיר ואפיתל אנטראלי

פרוטוקול זה מתאר את יצירת מודל אורגני מבוסס ערמונית בעכברים שגדל בדו-ממד. הוא כולל דיסוציאציה אורגנואידית, זריעת תאים, התמיינות, הערכת שלמות אפיתל וזיהום חוץ-גופי עם אשריכיה קולי אורופתוגנית. המודל מספק נגישות אפיקלית ומתאים לחקר אינטראקציות בין מארח לפתוגן, תוך התגברות על מגבלות של מערכות אורגניות תלת-ממדיות מסורתיות.

יצירת מודל מבוסס אורגנואידים בערמונית בעכבר לחקר אינטראקציות בין מארח לפתוגן

המחקר מציג שיטה לחקר זיהום חיידקי במבחנה באמצעות אורגנואידים במעי שמקורם בתאי גזע ברקמה. הפרוטוקול מתאר כיצד לגדל ולהבחין בין אורגנידים בשני ממדים, להדביק אותם ב-Escherichia coli פולשנית דבקה, ולהעריך קריאות מפתח, כולל פריצת מחסום אפיתליאלי, הדמיית זיהומים ותגובת RNA אפיתליאלית.

תרבית אורגנית דו-ממדית על תמצית פולשת או ממברנת בסיס לחקר אינטראקציות בין מארח לחיידקים

למד לגדל אורגנואידים קיבתיים אנושיים ומכרסמים ולבצע מיקרו-הזרקה של Helicobacter pylori. שיטה זו מאפשרת חקר מחלות זיהומיות במודל תלת-ממדי תוך שימור מבנה רקמתי אמיתי.

Organoids כמודל למחלות זיהומיות: התרבות של האדם וOrganoids הקיבה Murine וMicroinjection של הליקובקטר פילורי

גלה סרטונים נוספים