Name: מדידה מצורף והפנמה של שפעת וירוס בתאי A549 על ידי cytometry הזרימה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: למד שיטה למדידת הצמדה והפנמה של נגיפי שפעת A בתאי אפיתל ריאתיים A549 באמצעות ציטומטריית זרימה. הפרוטוקול כולל קישור בקורה, שינוי טמפרטורה ל-37 מעלות ושימוש בנוגדנים חוסמים להבחנה בין נגיפים מצורפים לפנימיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

עבודה זו נתמכה על ידי מענק מהקרן השוויצרית הלאומית למדע (31003A_135278) לSST. MOP הוא המוטב של מענק דוקטורט מקרן מחקר AXA. אנו מודים פטרישיה Nigg לעזרה עם העיצוב של איור 1.

שים לב לפני התחלה: זרימה למינרית שימוש מכסה המנוע והביו-אטום המתאים בעת עבודה עם נגיף חי. כאן אנו מתארים תנאי גידול מתאימים ל/ WSN זן נגיף שפעת התרבות / 33. פעמים ריבוי של זיהום (משרד הפנים) ודגירה עשויות להשתנות בהתאם לזן נגיף בשימוש. 1. הכנת / WSN וירוס Biotinylated / 33 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרע מדין-דארבי kindey כלבים (MDCK) תאים לתוך בקבוק סנטימטר T175 2 באמצעות הנשר בינוני השתנה Dulbecco (DMEM) בתוספת 10% FBS ופניצילין, סטרפטומיצין 1% (עט / סטרפטוקוקוס). תאי תרבות על 37 מעלות צלזיוס עד confluency כ -70% הוא הגיע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני הזיהום, להסיר בינוני ולשטוף תאים עם פוספט שנאגרו מלוח (PBS, pH7.0-7.3) על ידי הוספת נפח מספיק גדול כדי לכסות את monolayer התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר PBS ולהדביק תאים עם / WSN / 33 עם משרד הפנים של 10 -4. לדלל וירוס בPBS בתוספת 0.02 מ&quot;ג Mg 2 +, 0.01 מ&quot;ג Ca 2 + &lt;/ Sup&gt;, 0.3% אלבומין בסרום שור (BSA), ו -1% פן / סטרפטוקוקוס (זיהום-PBS). השתמש בבידוד של 4 מיליליטר לבקבוק סנטימטר T175 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים 1 שעה על 37 מעלות צלזיוס. הסר הבידוד על ידי מיליליטר DMEM 10 שאיפה ופיפטה בתוספת 0.3% BSA, 20 מ&quot;מ HEPES, ו -1% פן / סטרפטוקוקוס לתוך הבקבוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים ב 37 מעלות צלזיוס למשך כ 3 ימים עד השפעת cytopathic (CPE) הוא גלוי, ולאחר מכן supernatant קציר. יכול להיות מוכר כCPE עיגול של תאים ואחרי ניתוק ומוות של תאים 14. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין supernatant ב 450 XG במשך 5 דקות כדי להסיר פסולת תא. העברת supernatant לתוך צינור בז חדש וחזור על שלב זה עוד פעם אחת. מחק את כדורים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההעברה supernatants לתוך צינורות ultracentrifuge וsupernatants יסוד עם 5 מיליליטר של סוכרוז 30% בדילול במאגר NTE (10 מ&quot;מ טריס [pH 7.4], 100 מ&quot;מ NaCl, 1 mM EDTA). לאזן צינורות לפני ultracentrifugation ולמלא את עם PBS להגיע סוף נפח של 30 מיליליטר. superna ספיןtants ב112398 XG (המקביל ל 25,000 סל&quot;ד הרוטור SW28) למשך 90 דקות בultracentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות supernatant ידי pipetting ולספוג גלולה וירוס הלילה ב 4 מעלות צלזיוס ב250 μl PBS. Resuspend גלולה ידי pipetting למעלה ולמטה. למדוד את תכולת חלבון של וירוס מטוהר על ידי assay ברדפורד 15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בערכת biotinylation ליצור biotinylated / WSN / 33. בצע את ההוראות של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקיצור, להוסיף את הכמות המתאימה של ביוטין לנגיף המטוהר ודגירה של 2H על קרח. העבר את הווירוס לצינור ultracentrifuge ולמלא את צינור עם PBS להגיע סוף נפח של 30 מיליליטר. ספין וירוס ב112389 XG במשך 90 דקות בultracentrifuge. הסר supernatant ידי pipetting ולהוסיף 250 μl PBS. משרים גלולה במשך הלילה ב 4 מעלות צלזיוס. Aliquot ולאחסן את וירוס Biotinylated מאוחסן ב -80 ° C שבו יהיה יציב לפחות 24 חודשים. הערה: זה יכול להיות מועיל כדי לקבוע את כייל של p biotinylatedפיצוי של IAV ידי assay פלאק הסטנדרטי. עם זאת, יש לציין כי הפרוטוקול שלאחר מכן יהיה רק ​​למדוד חלקיקי נגיף biotinylated. נותר חלקיקי unbiotinylated בשל biotinylation שלם יתרום לכייל זיהומיות ידי assay פלאק אבל לא לאות שנמדדה בassay המצורף / ההפנמה. </li></ol> 2. לקבוע את הכמות הנדרשת של וירוס Biotinylated הערה: לפני assay המצורף / ההפנמה מתבצע, זה חשוב כדי לקבוע את כמות נגיף biotinylated הנדרשת כדי להדביק את כל התאים של מדגם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות ותאי A549 trypsinize לפי הוראות היצרן. ספירת התאים באמצעות תא תא. תאי 200,000 A549 פיפטה לFACS deepwell צינורות. ספין 3 דקות ב 450 x גרם. הסר גלולה supernatant וגלולה עם 200 μl PBS. תאים להתקרר על קרח למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פי 5 דילולים סידוריים של biotiמניות וירוס nylated בזיהום-PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות ספין המכילים את התאים ב 4 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות ב 450 x גרם. הסר supernatant וגלול גלול עם 100 המכיל וירוס זיהום-PBS μl. כשימוש שליטה מדומה זיהום-PBS ללא וירוס biotinylated. דגירה צינורות על קרח עבור שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות ספין על 4 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות ב 450 x גרם. הסר גלולה supernatant וגלול ב200 μl PBS. חזור על פעולה זו עוד פעם אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקיבעון, צינורות ספין על 4 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות ב 450 x גרם. הסר supernatant וגלול גלול בשל paraformaldehyde 3.7% (PFA) 100 μl. דגירה של 10 דקות ב RT. לאחר מכן, חזור על השלב לשטוף מתואר ב2.4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לpermeabilization, צינורות ספין על 4 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות ב 450 x גרם. הסר גלולה supernatant וגלול ב100 μl PBS המכיל 0.5% Triton X-100. דגירה של 6 דקות ב RT. לאחר מכן, חזור על השלב לשטוף מתואר ב2.4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות ספין על 4 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות ב 450 x גרם. הסר פל supernatant והגלולאח בBSA 50 μl 2% בדילול מלא PBS המכיל STV-Cy3. (לתשומת לבך, את הריכוז המתאים של STV-Cy3 צריך להיקבע לפני תחילת הניסוי התחל עם ריכוז של 1:. 200 ובדיקת דילולים פי 2 עד 1:. 2,400 בידיים שלנו, דילול של 1: 1,000 הוכיח להיות אופטימלי.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה שעה 1 בחושך ב RT. ואז, צעד כביסה חוזרת מתואר ב2.4 אבל resuspend גלולה בBSA 200 μl 2% בדילול מלא PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח דגימות על ידי cytometry זרימה 16. שער על אוכלוסיית Cy3-החיובית. בחר את הריכוז הנמוך ביותר של וירוס biotinylated כתוצאה מהמספר המרבי של תאי Cy3-חיוביים באוכלוסיית A549. </li></ol> 3. לקבוע את הכמות הנדרשת של streptavidin הערה: היעילות של חסימת האותות שמקורם וירוס תאי קובעת את טווח הגילוי של assay. לכן, חשוב לבטל את אות STV-Cy3 ככל האפשר. הדואר כמות הנדרשת של STV דרוש תלוי בכמות של מניות biotinylated וירוס משמשות (שנקבעו בסעיף 2). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את שלבים 2.1-2.4, אבל להשתמש בריכוז וירוס שנקבע בסעיף 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן דילולים סידוריים פי חמישה של STV מדולל PBS המכיל BSA 2% ו -0.1% אזיד הנתרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות ספין על 4 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות ב 450 x גרם. הסר supernatant וגלול גלולים בדילול STV 50 μl. כשימוש שליטה מדומה PBS המכיל BSA 2% ו -0.1% אזיד הנתרן מבלי STV. דגירה צינורות במשך 30 דקות על קרח. לאחר מכן, שלב לשטוף חוזר מתואר ב2.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עקוב 2.5-2.9 צעדים. עבור assay ההפנמה, לבחור את הריכוז הנמוך ביותר של STV וכתוצאה מגוש חזק של Cy3-האות (בהשוואה למדגם שבו לא היה נוכח STV). לשם כך, ניתן להשתמש באחוז תאי CY3-חיובי או את עוצמת הקרינה הממוצעת של אות Cy3. באופן אידיאלי, אות Cy3 של דגימות שטופלו STV צריכה להיות קרובה לאות ממדומה נגועתאים ככל האפשר. </li></ol> 4. קובץ מצורף / ההפנמה Assay הערה: הקפד להכין את כל חומרים כימיים לפני שמתחיל assay. לשלושת קבוצות הביקורת שהוצגו בסעיף התוצאות (תאים נגועים מדומים, תאים טרום שטופלו neuraminidase ותאים אזיד הנתרן שטופלו) שינויים קטנים לפרוטוקול נדרשים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 16 צינורות deepwell כל המכילים 200,000 תאי A549. בסמוך לסט הניסיוני בהיקף של 4 צינורות, יש 3 תנאי שליטה, כל 4 צינורות הדורשים: תאים נגועים מדומים, neuraminidase (NA) תאים -pretreated ותאים שטופלו אזיד הנתרן. כל קבוצה מורכבת מ -4 צינורות שכותרתו &#39;דק&#39; 0 &#39;,&#39; דק &#39;0 + STV&#39;, &#39;30 דקות &#39;, &#39;30 דקות + STV&#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות ספין על 4 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות ב 450 x גרם. הסר גלולה supernatant וגלול ב200 μl PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות ספין בC ° 4 ב 450 x גרם. הסר פל supernatant והגלולet 200 DMEM μl המכיל 0.3% BSA, 20 מ&quot;מ HEPES ו -1% (בינוני דגירה) פניצילין, סטרפטומיצין. דגירה של 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. הערה: לשליטה neuraminidase: neuraminidase חיידקי השימוש (למשל sialidase מVibrio כולרה) בריכוז של 200 mU / מדולל מיליליטר במדיום דגירה לresuspend התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות ספין על 4 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות ב 450 x גרם. הסר גלולה supernatant וגלול ב200 μl PBS. חזור על פעולה זו עוד פעם אחת, ולאחר מכן צינורות מגניבים על קרח למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות ספין על 4 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות ב 450 x גרם. הסר supernatant וגלול גלול ב100 μl biotinylated וירוס (להשתמש בריכוז הווירוס שנקבע בסעיף 2 בדילול מלא בזיהום-PBS). דגירה שעה 1 על קרח. לאחר מכן, שלב לשטוף חוזר מתואר ב2.4. הערה: לשליטה נגועות מדומה: השתמש זיהום-PBS ללא וירוס. לשליטה נתרן אזיד: השתמש וירוס בדילול מלא בזיהום-PBS בתוספת 0.1% אזיד הנתרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Processing של הדגימות לאחר הזיהום על קרח: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגימות &#39;0 דקות&#39;, בצע את דגימות שלב 2.5 וחנות ב 4 מעלות צלזיוס עד דוגמאות אחרות הם קבועים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ל&#39;דק &#39;0 + STV&#39; דגימות, צינורות ספין על 4 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות ב 450 x גרם. הסר supernatant וגלול גלול בSTV μl 50 (להשתמש בריכוז שנקבע בסעיף 3) מדולל PBS המכיל BSA 2% ו -0.1% אזיד הנתרן (כדי למנוע הפנמה בזמן הטיפול לדוגמא). דגירה 30 דקות על קרח. עקוב דגימות צעד 2.4-2.5 וחנות ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגימות &#39;30 דקות &#39;, צינורות ספין על 4 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות ב 450 x גרם. הסר supernatant וגלול גלול ב200 μl PBS המכיל BSA 2%. דגירה 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. עקוב דגימות צעד 2.4-2.5 וחנות ב 4 מעלות צלזיוס. הערה: לשליטה אזיד הנתרן: השתמש PBS בתוספת BSA 2% ו -0.1% אזיד הנתרן לדגירת 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור &#39;30 דקות + דגימות &#39;STV ספין צינורות ב 4 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות ב 450 x גרם. הסר supernatant וגלול גלול ב200 μl PBS המכיל BSA 2%. דגירה 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. ואז, צינורות ספין על 4 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות ב 450 x גרם. הסר supernatant וגלול גלול בSTV μl 50 (להשתמש בריכוז שנקבע בסעיף 3) מדולל PBS המכיל BSA 2% ו -0.1% אזיד הנתרן (כדי למנוע הפנמה בזמן הטיפול לדוגמא). דגירה 30 דקות על קרח. עקוב דגימות צעד 2.4-2.5 וחנות ב 4 מעלות צלזיוס. הערה: לשליטה אזיד הנתרן: השתמש PBS בתוספת BSA 2% ו -0.1% אזיד הנתרן לדגירת 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את השלבים 2.6-2.8 ולנתח דגימות על ידי cytometry זרימה. לקבוע את אחוז התאים Cy3-חיוביים בכל דגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את וירוס אחוז מצורף וכמות היחסית של וירוס הפנים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לחשב את כמות הנגיף מצורף, להשתמש באחוז Cy3-positiיש תאים מגודר או את עוצמת הקרינה הממוצעת של אות Cy3. לשם השוואה, להגדיר תאים שלא טופלו עד 100% (איור 4). הערה: אחוז הווירוס המצורף מתוארת על ידי המדגם &quot;0 דקות&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לחשב את כמות הנגיף הפנים, לקחת את היחס של &quot;30 דקות + STV&quot; מדגם מדגם &quot;30 דקות&quot; (איור 5). הערה: כפי שצוין לעיל, אחוז תאי Cy3 החיוביים מגודרות או את עוצמת הקרינה הממוצעת של אות Cy3 ניתן להשתמש. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Edinger, T. O., Pohl, M. O., Stertz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entry+of+influenza+A+virus%3A+host+factors+and+antiviral+targets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Entry of influenza A virus: host factors and antiviral targets.</a> J Gen Virol. 95, 263-277 (2014).</li>
<li>Palese, P., Shaw, M. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPalese%2C+P+%22Fields+Virolog%22">Fields Virolog</a>. Knipe, D. M., Howley, P. M. 2, Lippincott Williams and Wilkins. (2007).</li>
<li>Matlin, K. S., Reggio, H., Helenius, A., Simons, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infectious+entry+pathway+of+influenza+virus+in+a+canine+kidney+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Infectious entry pathway of influenza virus in a canine kidney cell line.</a> J Cell Biol. 91, 601-613 (1981).</li>
<li>Sieczkarski, S. B., Whittaker, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+virus+can+enter+and+infect+cells+in+the+absence+of+clathrin-mediated+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Influenza virus can enter and infect cells in the absence of clathrin-mediated endocytosis.</a> J Virol. 76, 10455-10464 (2002).</li>
<li>Rust, M. J., Lakadamyali, M., Zhang, F., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+endocytic+machinery+around+individual+influenza+viruses+during+viral+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Assembly of endocytic machinery around individual influenza viruses during viral entry.</a> Nat Struct Mol Biol. 11, 567-573 (2004).</li>
<li>Vries, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+the+influenza+A+virus+endocytic+routes+reveals+macropinocytosis+as+an+alternative+entry+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Dissection of the influenza A virus endocytic routes reveals macropinocytosis as an alternative entry pathway.</a> PLoS Pathog. 7, e1001329(2011).</li>
<li>Vries, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+A+virus+entry+into+cells+lacking+sialylated+N-glycans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Influenza A virus entry into cells lacking sialylated N-glycans.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109, 7457-7462 (2012).</li>
<li>Londrigan, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-linked+glycosylation+facilitates+sialic+acid-independent+attachment+and+entry+of+influenza+A+viruses+into+cells+expressing+DC-SIGN+or+L-SIGN%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">N-linked glycosylation facilitates sialic acid-independent attachment and entry of influenza A viruses into cells expressing DC-SIGN or L-SIGN.</a> J Virol. 85, 2990-3000 (2011).</li>
<li>Wang, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DC-SIGN+mediates+avian+H5N1+influenza+virus+infection+in+cis+and+in+trans%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">DC-SIGN mediates avian H5N1 influenza virus infection in cis and in trans.</a> Biochem Biophys Res Commun. 373, 561-566 (2008).</li>
<li>Pohl, M. O., Edinger, T. O., Stertz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolidase+is+required+for+early+trafficking+events+during+influenza+A+virus+entry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Prolidase is required for early trafficking events during influenza A virus entry.</a> J Virol. 88, 11271-11283 (2014).</li>
<li>Konig, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+host+factors+required+for+influenza+virus+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human host factors required for influenza virus replication.</a> Nature. 463, 813-817 (2010).</li>
<li>Ludwig, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+cell+signalling+pathways+to+fight+the+flu%3A+towards+a+paradigm+change+in+anti-influenza+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemothe%22%5BJournal%5D)">Targeting cell signalling pathways to fight the flu: towards a paradigm change in anti-influenza therapy.</a> J Antimicrob Chemothe. 64, 1-4 (2009).</li>
<li>Simoes, S., Slepushkin, V., Duzgunes, N., Pedroso de Lima, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+mechanisms+of+internalization+and+intracellular+delivery+mediated+by+pH-sensitive+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">On the mechanisms of internalization and intracellular delivery mediated by pH-sensitive liposomes.</a> Biochim Biophys Acta. 1515, 23-37 (2001).</li>
<li>Tran, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockdown+of+specific+host+factors+protects+against+influenza+virus-induced+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+death%2C+and+disease%22%5BJournal%5D)">Knockdown of specific host factors protects against influenza virus-induced cell death.</a> Cell death, and disease. 4, e769(2013).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgramm+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgramm quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Macey, M. G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMacey%2C+MG+%22Flow+Cytometry+Principles+and+Applications%22">Flow Cytometry Principles and Applications</a>. Macey, M. G. , Humana Press. (2007).</li>
<li>Burness, A. T., Pardoe, I. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+enzymes+on+the+attachment+of+influenza+and+encephalomyocarditis+viruses+to+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Viro%22%5BJournal%5D)">Effect of enzymes on the attachment of influenza and encephalomyocarditis viruses to erythrocytes.</a> J Gen Viro. 55, 275-288 (1981).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

הפרוטוקול שלנו מתאר את דרך קלה של מדידה מצורף וירוס והפנמה על ידי cytometry זרימה. זה מאפשר שימוש בוירוס wildtype שכותרת אשר מחקה באופן הדוק יותר זיהומי נגיף בהשוואה לשימוש בחלקיקים כמו וירוס (אן אל פי). בעוד הפרוטוקול שלנו כבר מותאם למדידה מצורף והפנמה של IAV זה יכול בקלות להיות מותאם לוירוסים אחרים. בנוסף, כcytometry זרימה משמש לקריאת נתונים, ניתן להוסיף שיתוף stainings בקלות לדוגמא הפרוטוקול לבדוק רמות הביטוי הבאים מציאה או ביטוי יתר של חלבון של עניין. לפיכך, assay מאפ...

הכניסה של וירוס שפעת (IAV) היא תהליך רב שלבים שמתחיל בכריכה של הווירוס לקולטנים על קרום הפלזמה של תאי המטרה 1. קולט לIAV הוא חומצת sialic אשר קיים במגוון גדול של גליקופרוטאינים וglycolipids. חלבון hemagglutinin (HA) של IAV אשר שוהה במעטפת הנגיפית נקשר לחומצת sialic ובכך מתווך קובץ מצורף של החלקיקים הנגיפיים על קרום הפלזמה של תאי המטרה 2. הווירוס נכנס לתאים באמצעות אנדוציטוזה תיווך clathrin אלא גם מסלולי כניסה חלופיים, כגון macropinocytosis, תוארו 3-6. האינטראקציה בין HA וחומצת sialic נראית מספיק לתיווך שניהם, מצורף ומפעיל הפנמה של חלקיקים נגיפיים 7. עם זאת, קולטני כניסה חלופית הוצעו ותפקידיהם בכניסת IAV כרגע נחקרים 1,8,9. כֶּלֶבrently, נעשים מאמצים לזהות גורמי מארח שמעורבים במחזור החיים של הנגיף במטרה לפתח טיפולים אנטי רומן צורך דחוף 10-12. כניסת וירוס תהיה צעד חיובי עבור מיקוד צמיחת IAV כדי לחסום זיהום ויראלי בשלב המוקדם ביותר שלה. מדידת שלבים שונים של כניסת IAV ניסוי היא מאתגרת כמו כמויות גדולות של וירוס בדרך כלל נדרשות לזהות את הווירוס הנכנס. בנוסף, טווח גילוי לשינויים בכניסת וירוס הוא ליניארי רק בשל חוסר השכפול נגיפי. זה מדגיש את הצורך במבחנים עם רגישות גבוהה. Assay אנו מציגים כאן מאפשר זיהוי של וירוס מצורף על פני השטח של התאים, כמו גם זיהוי של וירוס הפנים ביחס לסכום הכולל של הווירוס הקשורים תא. השימוש בוירוס wildtype biotinylated מאפשר מדידה נוחה באמצעות צביעה עם STV-Cy3 וreadout ידי cytometry זרימה. וירוס Biotinylated קר-קשור לתאים כדי לאפשר מצורף אבל למנוע הפנמה של חלקיקים נגיפיים. יכולים להיות קבועים תאים, permeabilized ומוכתמים בSTV-Cy3 למדוד וירוס מצורף. האות מvirions תאית, מצורף יכולה להיות מבוטלת אם צעד חסימה מיושם לפני הקיבעון שבו התאים הודגרו עם streptavidin ללא כותרת (STV). בשלב הבא, לאחר התקשרות של IAV biotinylated, טמפרטורה מוסטת עד 37 מעלות צלזיוס והפנמה של חלקיקים נגיפיים מותר לקחת מקום. חלקיקים הפנימו מוגנים מכריכה של STV ובכך מאפשר האפליה בין וירוסים שמחוץ ולתאיים. לתנאי ניסוי, ארבע דגימות נדרשות: &#39;דק&#39; 0 &#39;: המדגם הראשון, שכותרתו&#39; דק &#39;0&#39;, הוא למדוד וירוס הנכנס קר על פני התא. &#39;דק&#39; 0 + STV &#39;: המדגם השני, שכותרתו&#39; דק &#39;0 + STV&#39;, נותן את עוצמת האות הבסיסית של הניסוי. וירוס מצורף חסום שנינותSTV שעות והצביעה הבא האות עם STV-Cy3 צריך להיות נמוכים בהרבה בהשוואה למדגם &#39;0 דקות&#39;. &#39;30 דקות &#39;: המדגם השלישי, &#39;30 דקות&#39; מכילה מצורפים והפנימו וירוס עקב שינוי הטמפרטורה על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. &#39;30 דקות + STV &#39;: המדגם הרביעי, &#39;30 דקות + STV&#39; צעדי החלק תאיים של וירוסים. צעד חסימת STV מיושם לאחר תקופת הדגירה 30 דקות. כתוצאה מכך, חלקיקים נגיפיים בתא השטח כפופים STV עוזבים וירוסים רק הפנימו זמינים לצביעה עם STV-Cy3. הכמות היחסית של וירוס הפנים ניתן מחושבת כיחס של וירוס הפנים (נמדד בדקות &#39;30 + STV &#39;המדגם) מחולק בסכום הכולל של וירוס (שתואר על ידי &#39;30 דקות&#39; לדוגמא). כפקדים אנו מציעים לכלול תאים נגועים מדומים. האות הבאה מכתים STV-Cy3 של תאים נגועים מדומים נותנת רקעכתוצאה מהפרוטוקול מכתים. שליטה לקובץ מצורף IAV היא הטיפול מראש של תאים עם neuraminidase חיידקים (NA). דבק NA את חומצת sialic מגליקופרוטאינים סלולריים, ובכך להסיר קולטנים קובץ מצורף מתא השטח. אזיד הנתרן (SA) הוא מעכב חילוף חומרים חזק ובכך חוסם אנדוציטוזה 13. תאים שטופלו עם אזיד הנתרן צריכים להיות חיוביים לוירוס מחייב אך שליליים להפנמה.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>41966-052</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>טכנולוגיות חיים</td><td>15140-163</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-169&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>VWR Calbiochem</td><td>126579</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>15630-100</td><td></td></tr><tr><td>D-סוכרוז</td><td>פלוקה</td><td>84100</td><td></td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Biosolve</td><td>BV 20092391</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3680</td><td></td></tr><tr><td>EZ-LINK NHS-SS-BIOTIN ערכת</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td><a href="https://extranet.fisher.co.uk/insight2_ch/getProduct.do?productCode=W9971E">W9971E&nbsp; </a></td><td></td></tr><tr><td>Bio Rad חלבון Bio Assay</td><td>Bio Rad</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>צינורות עמוקים (1.2 מ"ל מיקרו-צינורות)</td><td>Milian</td><td>82 00 001</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>&nbsp; Lucerna chem&nbsp; מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>צינורות אולטרה-צנטריפוגה</td><td>Hemotec HmbH</td><td>253070</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fluka</td><td>93420</td><td></td></tr><tr><td>STV-Cy3</td><td>Life Technologies</td><td>43-4315</td><td></td></tr><tr><td>STV</td><td>Life Technologies</td><td>43-4302</td><td></td></tr><tr><td>נתרן אזיד</td><td>Fluka</td><td>71290</td><td></td></tr><tr><td>חיידקי neuraminidase/ סיאלידאז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>N6514-1UN</td><td></td></tr></tbody></table>

מדידה מצורף והפנמה של שפעת וירוס בתאי a549 על ידי cytometry הזרימה

Measuring Attachment and Internalization of Influenza A Virus in A549 Cells by Flow Cytometry

היצמדות לתאי מטרה ואחריה הפנמה הם השלבים הראשונים במחזור החיים של נגיף שפעת A (IAV). אנו מספקים כאן פרוטוקול מפורט למדידת שינויים יחסיים בכמות החלקיקים הנגיפיים הנצמדים לתאי A549, קו תאי אפיתל של ריאות אנושיות, כמו גם בכמות החלקיקים המופנמים בתא. אנו משתמשים בנגיף ביוטיניל שניתן לזהות בקלות לאחר צביעה עם סטרפטווידין עם תווית Cy3 (STV-Cy3). אנו מתארים את הצמיחה, הטיהור והביוטינילציה של A/WSN/33, זן מעבדה IAV בשימוש נרחב. חלקיקי IAV ביוטיניליים הקשורים לקור על תאי A549 נצבעים ב-STV-Cy3 ונמדדים באמצעות ציטומטריית זרימה. כדי לחקור ספיגה של חלקיקים נגיפיים, מותר לנגיף הקשור לקור להפנים ב-37 מעלות צלזיוס. על מנת להבדיל בין חלקיקים נגיפיים חיצוניים ומופנמים, מיושם שלב חסימה: נקודות קשירה חופשיות על הביוטין של הנגיף המחובר על פני התא נקשרות על ידי סטרפטווידין (STV) ללא תווית. חדירה וצביעה של תאים לאחר מכן עם STV-Cy3 מאפשרת זיהוי של חלקיקים נגיפיים מופנמים. אנו מציגים חישוב לקביעת הכמות היחסית של הנגיף המופנם. בדיקה זו מתאימה למדידת השפעות של טיפולים תרופתיים או מניפולציות אחרות על התקשרות או הפנמה של IAV.

קריקטורה המתארת ​​את ארבעת תנאי ניסוי שונים מוצגת באיור 1 תוצאות של ניסוי נציג מוצגות באיורים 2 -. 5. במדגם &quot;0 דקות&quot;, וירוס biotinylated קר-מחויב למקד תאים שניתן דמיינו ידי מכתים STV-Cy3 (איורים 1 ו -2). כאשר צעד חסימה (ב&quot; דקות 0 + STV &quot;מדגם) מוחל, וירוס על פני התא כבר לא יכול להיות מזוהה על ידי צביעת STV-Cy3. כתוצאה מכך, עוצמת האות ב&quot; דקות 0 + STV &quot;מדגם חום מופחת בהש...

אנו מציגים פרוטוקול המתאר שיטה כמותית למחצה למדידת שניהם, היצמדות של נגיף שפעת A לתאי A549, כמו גם הפנמת חלקיקי הנגיף לתאי המטרה על ידי זרימה ציטומטרית.

מדידה מצורף והפנמה של שפעת וירוס בתאי A549 על ידי cytometry הזרימה

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed ...

המטרה הכללית של הליך זה היא למדוד הידבקות והפנמה של חלקיקי נגיף השפעת A לתאי אפיתל של ריאה מסוג A549. דבר זה מושג תחילה על ידי קישור בקור של נגיף השפעת A לתאי A549, תהליך המאפשר הידבקות אך מונע את ספיגת חלקיקי הנגיף.בשלב הבא, מאפשרים לווירוס להיכנס לתא (internalize) על ידי העלאת הטמפרטורה ל-37 °C. לאחר מכן, מבוצע שלב חסימה שבו נקשר strp Aden לא מסומן לפני השטח של התא, וזאת כדי להבדיל בין חלקיקי וירוס שנקשרו לפני השטח לבין אלו שנכנסו לתא.לבסוף, הנגיף הביוטינילי שהתחבר לתא מדגגר עם streptavidin המסומן ב-CY3, ונעשה שימוש בציטומטריית זרימה כדי לזהות את הנגיפים הצבועים. בסופו של דבר, מחושבת הכמות היחסית של נגיפים שהתחברו לתא ואלו שהופנמו לתוכו. שיטה זו יכולה לספק מידע על הכמות היחסית של נגיף השפעת הנצמד לתאי 5 0 9 ומופנם לתוכם.ניתן ליישם זאת גם על מערכות אחרות המשתמשות בשורות תאים שונות או בנגיפים אחרים. לאחר הפקת נגיף ביוטינילי (biotinylated) וקביעת הכמויות הנדרשות של הנגיף המסומן, הסטרפטידין (strep din) ו-SI three המסומן בסטרפטידין בהתאם לפרוטוקול הכתוב, הכין ארבעה מבחנות בעלות באר עמוקה, שכל אחת מהן מכילה 200,000 תאי A 5 49. סמן את המבחנות כ: 0 דקות, 0 דקות פלוס STV, 30 דקות, ו-30 דקות פלוס STV. לאחר מכן, סובב את המבחנות בצנטריפוגה.הסיר את הנוזל העליון והשתמש ב-200 microliters של PBS

measuring-attachment-internalization-influenza-virus-a549-cells-flow

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

שיטת מדידה של קינטיקס Fusion ויראלי ברמה חלקיק יחיד

שיטה זו מתארת ​​את השימוש במערכת הדמיה צבע אינפרא אדום מבוסס על זיהוי של H1N1 בנוזל bronchioalveolar (BAL) שטיפה של עכברים נגועים על רגישות גבוהה. מתודולוגיה זו ניתן לבצע 96 - או 384 גם צלחת, דורש &lt;10 נפח μl של חומר הבדיקה יש פוטנציאל הקרנה בו זמנית של פתוגנים רבים.

תפוקה גבוהה איתור שיטת וירוס השפעת

אנו מתארים את הבידוד המהיר של תאים ראשוניים Murine סוג II (אפיתל מכתשיים AECII) על ידי סלקציה שלילית זרימת cytometric. AECII אלה להראות כדאיות וטוהר גבוה ומתאימים למגוון רחב של מחקרים מולקולריים פונקציונליים ובנוגע לתפקידם בתנאי נשימה כגון מחלות אוטואימוניות או זיהומיות.

בידוד Cytometric זרימה של תאים ראשוניים Murine Type II alveolar אפיתל ללימודים פונקציונליים ומולקולריים

Source: Klaus, J. P., et al Highly Sensitive Assay for Measurement of Arenavirus-cell Attachment. J. Vis. Exp. (2016).This video demonstrates how to measure arenavirus attachment to monkey kidney cells. The assay uses low temperatures to block endocytosis and isolate the virus binding step. The approach enables precise quantification of surface-bound virus particles under conditions that restrict internalization.

An In Vitro Assay to Study Arenavirus Attachment to the Host Cell

מקור: Pohl, M. O. &amp; Stertz, S. מדידת היצמדות והפנמה של נגיף השפעת A בתאי A549 באמצעות ציטומטריית זרימה. J. Vis. Exp. (2015)סרטון זה מדגים את השימוש במבחן חסימה של סטרפטאווידין כדי להבחין בין נגיף השפעת קשור לפני השטח לבין נגיף שהופנם לתאי אפיתל של ריאה אנושית. השוואה בין אותות פלואורסצנציה מראה כי עוצמה גבוהה יותר לאחר אינקובציה מעידה על הפנמה ויראלית מוצלחת.

ניתוח הפנמה של נגיף השפעת באמצעות בדיקת חסימת סטראפטאווידין

בסרטון זה, אנו דנים בקורלציה בין CIT50 לבין ריבוי זיהומים ויראליים. התאים הנגועים בנגיף מציגים השפעות ציטופתיות, הגורמות למותם ולניתוקם מהמיקרואלקטרודה המוזהבת, שבתורה מפחיתה את העכבה.

בדיקה סלולרית מבוססת עכבה למדידת ריבוי הדבקה בנגיף השפעת

השלב הראשון במחזור החיים של וירוס הזירה הוא הצמדה של חלקיקים נגיפיים לתאים מארחים. אנו מדווחים על בדיקה כמותית מבוססת RT-PCR לזיהוי וכימות רגישים במיוחד של אירועי התקשרות ל-arenavirus.

Assay הרגיש ביותר למדידה של Attachment Arenavirus התאים

אנו מתארים את בדיקת הלקטין המקושרת לאנזים (ELLA) למדידת טיטר נוגדנים לעיכוב שפעת נויראמינידאז (NA) ב-sera. הבדיקה משתמשת באגלוטינין בוטנים כדי לכמת שאריות גלקטוז שהופכות לנגישות כאשר NA מסיר חומצה סיאלית מצלחות מצופות פטואין, 96 בארות.

מדידת טיטר נוגדנים עיכוב Neuraminidase שפעת ידי enzyme-linked Assay לקטינים

אנו מתארים שיטה כדי למדוד ההפעלה של פונקציות אפקטור Fc בתיווך על ידי נוגדנים את המטרה hemagglutinin וירוס שפעת. ניתן גם להתאים assay הזה כדי להעריך את היכולת של נוגדנים חד-שבטיים או polyclonal סרה מיקוד אחרים glycoproteins משטח ויראלי לזירוז חסינות בתיווך Fc.

שיטה להערכת פונקציות אפקטור בתיווך Fc המושרה על ידי שפעת Hemagglutinin נוגדנים ספציפיים

פרוטוקול זה מספק שיטה מהירה ואמינה כדי לכמת את phagocyציטוזה של אספגינוס באמצעות הפגוציטים הגוף האנושי באמצעות הזרימה cy, try ולהפלות את הפגוציטוזה של המחט מתוך הדבקה ללוקוציטים בלבד.

מדידת פאיגוציטוזה של אספרגייוס מחטאים מחט על ידי האדם לוקיולוציטים באמצעות זרם ציטוטוטרי

דיווח כאן הוא פרוטוקול לכימות של חלקיקים ויראליים זיהומיות באמצעות ניטור בזמן אמת של עכבה חשמלית של תאים נגועים. יישום מעשי של שיטה זו מוצג על ידי כימות שפעת A וירוס ריקבון תחת פרמטרים פיסיקוכימיים שונים המחקים תנאים סביבתיים.

ניטור הישרדות וירוס שפעת מחוץ למארח באמצעות ניתוח תאים בזמן אמת

למד שיטה למדידת הצמדה והפנמה של נגיפי שפעת A בתאי אפיתל ריאתיים A549 באמצעות ציטומטריית זרימה. הפרוטוקול כולל קישור בקורה, שינוי טמפרטורה ל-37 מעלות ושימוש בנוגדנים חוסמים להבחנה בין נגיפים מצורפים לפנימיים.

מדידה מצורף והפנמה של שפעת וירוס בתאי A549 על ידי cytometry הזרימה

גלה סרטונים נוספים