מדידה מצורף והפנמה של שפעת וירוס בתאי A549 על ידי cytometry הזרימה

המטרה הכוללת של הליך זה היא למדוד התקשרות והפנמה של שפעת. נגיף חלקיקים לתוך 5 49 תאי אפיתל ריאה. זה מושג על ידי קשירת הצטננות ראשונה על ידי שפעת, נגיף ל-5 49 תאים, המאפשר היצמדות אך מונע ספיגה של חלקיקים נגיפיים.

לאחר מכן, נותנים לנגיף להפנים על ידי העברת הטמפרטורה ל-37 מעלות צלזיוס. ואז שלב חסימה שבו סטרפ עדן ללא תווית קשור למשטח התא. וירוסים מחוברים מבוצעים על מנת להבחין בין חלקיקים נגיפיים מחוברים ומופנמים.

לבסוף, הנגיף הביוטיניל הקשור לתא מודגר עם CY 3 המסומן סטרפטווידין וזרימה ציטומטרית משמשת לאיתור הנגיפים המוכתמים. בסופו של דבר, מחושבת הכמות היחסית של נגיפים מחוברים ומופנמים. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי הכמות היחסית של שפעת, נגיף שנצמד ומפנים לתוך 5 0 9 תאים.

ניתן ליישם אותו גם על מערכות אחרות המשתמשות בקווי תאים שונים או בנגיפים אחרים לאחר יצירת נגיף ביוטיניל וקביעת הכמויות הנדרשות של הנגיף המסומן סטרפטוקוס דין ו-SI שלוש סטרפטוקוס דין מסומן על פי פרוטוקול הטקסט, הכינו ארבעה צינורות באר עמוקים שכל אחד מהם מכיל 200,000, A 5 49 תאים המסומנים בצינורות כאפס דקות. אפס דקות, פלוס STV, 30 דקות ו-30 דקות פלוס STV. לאחר מכן, סובב את הצינורות.

הסר את ה-supernatant והשתמש ב-200 מיקרוליטר PBS כדי להשעות מחדש את הכדורים. לאחר מכן לאחר סיבוב הצינורות שוב, השתמש ב-200 מיקרוליטר של מדיום גידול סטנדרטי 5 49 כדי להשעות מחדש את התאים לדגור ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לאחר צנטריפוגת הדגירה של הדגימות ולהשעות מחדש את הכדורים ב-200 מיקרוליטר PBS לאחר חזרה על הכביסה פעם נוספת, יש לקרר את הצינורות על קרח למשך 10 דקות. כאשר הצינורות התקררו, סובב שוב והשתמש ב-100 מיקרוליטר של נגיף ביוטיניל מדולל בזיהום PBS כדי להשעות מחדש את הכדורים לאחר דגירה על קרח למשך שעה, חזור על הסיבוב ושטוף עם PBS פעמיים, ועבד את הדגימות הבאות במקביל ככל האפשר עבור דגימות האפס דקות.

לאחר הסחיטה, השתמש ב-100 מיקרוליטר של 3.7% אלדהיד פרפורמי או PFA כדי להשעות מחדש את גלולת התא. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות לפני הסיבוב ושימוש ב-PBS כדי לשטוף את התאים פעמיים לאחר הקיבוע. יש לאחסן בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס עד לעיבוד כל הדגימות.

כדי לטפל בדגימות האפס דקות פלוס STV, סובב את הצינורות, הסר את הסופרנטנט והשתמש ב-15 מיקרוליטר של STV 2% BSA ו-0.1% נתרן אזי ב-PBS כדי להשעות מחדש את דגירה של כדור התא על הקרח למשך 30 דקות. לאחר מכן צנטריפוגה והשתמש ב-PBS כדי לשטוף את התאים פעמיים לאחר קיבוע עם PFA כפי שהודגם זה עתה דלת הדגימות בארבע מעלות צלזיוס עבור הדגימות של 30 דקות. לאחר סיבוב והסרת הסופרנט, השתמש ב-PBS 2% BSA כדי להמיס את הדגימות.

דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפני שטיפה עם PBS וקיבוע עם PFA. לאחר מכן אחסן את הדגימות בארבע מעלות צלזיוס למשך 30 דקות בתוספת דגימות STV. לאחר הגלולה, אנו משהים את הדגימות ב-200 מיקרוליטר של PBS 2% BSA, לאחר דגירה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.

סובב והשהה מחדש את התאים ב-50 מיקרוליטר של STV 2% BSA 0.1% נתרן azi ב-PBS דגירה על ICE למשך 30 דקות לפני הכביסה והקיבוע. לאחר מכן, לאחר חדירה וצביעה של כל הדגימות ב-STV SI שלוש, בהתאם לפרטים בפרוטוקול הטקסט, אחסנו את הדגימות בארבע מעלות צלזיוס. לבסוף, נתח את הדגימות על ידי ציטומטריית זרימה.

קבע את אחוז שלושת התאים החיוביים CY בכל דגימה. חשב את אחוז הנגיף המחובר ואת הכמות היחסית של הנגיף המופנם. על פי פרוטוקול הטקסט כפי שמוצג כאן בדגימת אפס דקות, נגיף ה-ated קשור בקור לתאי מטרה כפי שמוצג על ידי St.V.SI שלושה צביעה.

כאשר STV מיושם כצעד חוסם, לא ניתן עוד לזהות את הווירוס על פני התא על ידי S St.V.SI שלוש, מה שמפחית מאוד את האות. כאשר הטמפרטורה עולה ל-37 מעלות צלזיוס, הנגיף המחובר נקלט לתאים. נגיף מופנם אינו רגיש לחסימה עם STV ללא תווית וכתוצאה מכך ירידה פחות דרמטית בעוצמת האות ב-30 הדקות פלוס דגימות STV המוצגות.

להלן האחוזים של שלושה תאים חיוביים לע"כ עבור כל תנאי הניסוי המתוארים בסרטון זה. תאים נגועים מדומים נותנים את עוצמת אות הרקע לניסוי ופועלים כבקרה שלילית על היצמדות הנגיף. נוירמינידאז בקרה אחר מבטל מאוד את ההתקשרות ל-IAV ב-90% בהשוואה לתאים לא מטופלים.

נתרן אזי, המדלדל TP, ובכך מעכב אנדוציטוזיס, עיכב את ההפנמה של חלקיקי הנגיף הן במהלך ההדבקה והן לאחריה, כפי שמוצג כאן לאחר טיפול בנתרן זי תאים שהודגרו במשך 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס הראו ירידה דרמטית בהפנמה בהשוואה לתאים לא מטופלים שהודגרו באותם תנאים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד למדוד התקשרות והפנמה של שפעת, נגיף ב 5 0 9 תאים. פרוטוקול זה מאפשר קריאה נוחה על ידי ציטומטריית זרימה וניתן להתאים אותו בקלות להגדרות ניסיוניות אחרות.