פרוטוקול בידוד יעיל עבור B ו- T לימפוציטים משקדי הפלטין אדם

המטרה הכוללת של הליך זה היא להשיג שברי לימפוציטים BNT מדגימות שקדים אנושיים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות המפתח בתחום הווירולוגיה, כמו מה התפקידים של שברי לימפוציטים BT בפתוגנזה של מחלות נגיפיות תוך שלוש שעות מהסרתם הכירורגית. העבירו את רקמת השקד למעבדה בצינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר מלא בתוספי HBSS קרים וסטריליים.

לאחר מכן שימוש בהליכי הבטיחות הביולוגית המתאימים המומלצים לטיפול ברקמות אנושיות. הרטיבו את הרקמה עם תוסף טרי המכיל HBSS והעבירו את השקדים לצלחת תרבית תאי פלסטיק בגודל 60 מילימטר על קרח. בעזרת מלקחיים, הסר את כל קרישי הדם הנראים לעין או רקמות שומן וחיבור, ולאחר מכן העביר את השקדים לצלחת חדשה של 60 מילימטר המכילה חמישה מיליליטר HBSS עם תוספי מזון.

לאחר מכן, חתוך. רקמת השקד מתכנסת לשברים של שלושה עד 10 מילימטרים, ולאחר מכן העברת השברים למסננת תאי פלסטיק של 100 מיקרומטר בצלחת תרבית תאים חדשה של 60 מילימטר המכילה 10 מיליליטר של HBSS טרי עם תוספים המשתמשים בקצה הבוכנה של מזרק פלסטיק בצורה חלקה. סחטו את שברי הרקמה דרך מסננת התאים, וודאו ששברי השקדים נשארים שקועים לחלוטין ב-HBSS כאשר כל הרקמה הושרה, השליכו את המסננת והעבירו את תרחיף התאים שנוצר לתוך צינור צנטריפוגה מפלסטיק של 50 מיליליטר על קרח.

הביאו את תמיסת התא לנפח סופי של 35 מיליליטר עם תוספי HBSS טריים, ולאחר מכן הוסיפו 10 מיליליטר של תמיסת שיפוע צפיפות בטמפרטורת החדר לכמה צינורות חרוטיים של 50 מיליליטר. שכבו בעדינות את מתלי התאים על גבי שיפועי הצפיפות, הקפידו לא לערבב את התמיסות ואז להפריד את התאים באמצעות צנטריפוגה. התאים החד-גרעיניים ייפרדו לשכבה לבנה רכה בממשק עם תאי הדם האדומים, הפיברובלסטים ופסולת התאים הממוקמים במשקעים בתחתית הצינור.

בעזרת פיפטה של 10 מיליליטר, אסוף בזהירות את שכבת התא החד-גרעיני ומשוך את התאים החד-גרעיניים בצינור חדש של 50 מיליליטר. לאחר מכן שטפו את התאים שלוש פעמים ב -25 מיליליטר PBS קר כקרח לכל שטיפה והשעו מחדש את הגלולה הסופית ב -15 מיליליטר PBS. לאחר ספירת מספר התאים הקיימאים, הנח את התאים על קרח כדי לבודד את תאי ה-T על ידי הפרדת חרוזים מגנטיים.

סובב את תרחיף התאים החד-גרעיניים והשהה מחדש את הגלולה ב-80 מיקרוליטר של מאגר הפרדה קר כקרח לכל אחד כפול 10 לשבעת התאים. לאחר מכן העבירו את תרחיף התאים לצינור סטרילי של שני מיליליטר ודגרו ב-20 מיקרוליטר CD שלושה נוגדנים מגנטיים למשך שעה בארבע מעלות צלזיוס עם ערבוב עדין רציף כדי לשמור על התאים והתרחיף בסוף הדגירה, העבירו את התאים לצינור של 15 מיליליטר המכיל חמישה מיליליטר של מאגר הפרדה קר כקרח ושטפו אותם במהלך הכביסה. חבר את המפריד המגנטי למעמד וטען עמוד על המגנט.

שוטפים את העמוד עם 500 מיקרוליטר של מאגר הפרדה קר כקרח, ואז מניחים מסננת של 40 מיקרומטר על גבי העמוד. כעת השעו מחדש את גלולת התא ב-500 מיקרוליטר של מאגר הפרדה טרי והעמיסו את התאים דרך המסננת על העמודה שאוספת את תא B המכיל EIT בחרוט של 15 מיליליטר. שני קרח בון כאשר כל התאים עברו לתוך צינור האיסוף.

שטפו את העמוד ארבע פעמים עם 500 מיקרוליטר של מאגר הפרדה לכל פעם 10 לשבעת התאים בהמתנה שמאגר העמודים יתרוקן לפני החלת השטיפה הבאה. לאחר הכביסה האחרונה, העבירו את העמוד לצינור איסוף חדש של 15 מיליליטר. לאחר מכן השתמש בבוכנת העמודה כדי ללחוץ על שני מיליליטר של מאגר הפרדה דרך העמודה לתוך הצינור כדי לאסוף את ה-CD שלושה שבר תאי T חיובי.

כדי לנתח את שברי תאי הטונזור B ו-t המבודדים, גלול את ה-CD שלושה שברי תאים חיוביים ו-CD שלושה שברי תאים שליליים ושטוף את שתי קבוצות התאים במיליליטר אחד של PBS בתוספת 0.2% BSA או PBSA לאחר הסיבוב השני. חלקו 100 מיקרוליטר של התאים ו-PBSA למספר המתאים של צינורות לתיוג פקס, והוסיפו את הכמות המתאימה של פלואורו ארבעה נוגדנים חד-שבטיים מצומדים או בקרה לכל צינור. לאחר מכן מערבל לזמן קצר את הצינורות ודוגר אותם במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס בחושך בסוף הדגירה.

שטפו את הצינורות פעמיים עם PBSA טרי ולאחר מכן תקנו את צביעת התאים עם אלדהיד פרפורמי של 1% כדי לזהות נוכחות של DNA אדנו-וירוס בתאים על ידי PCR. בצע את הגברת ה-PCR בתנאי הרכיבה המתאימים, תוך הפרדת תוצרי הגברת ה-PCR המתקבלים על ג'ל AGROS של 1.5% ומאגר EDTA בין-אחוזתי. לבסוף, דמיין את הרצועות המתקבלות עם כתם חומצת הגרעין המתאים.

על פי פרוטוקולים סטנדרטיים, הפרדה מוצלחת של תאים חד-גרעיניים של טונסור מביאה לתת-אוכלוסיות מטוהרות מאוד של לימפוציטים BNT כפי שאושר על ידי ניתוח ציטומטרי זרימה באמצעות אנטי CD 20 ואנטי CD שני נוגדנים לאיתור אוכלוסיות הלימפוציטים b ו-t בהתאמה. לעומת זאת, הפרדה לא יעילה של התאים המונו-גרעיניים גורמת לשברי תאים שהם תערובת של תאים מלימפוציטים b ו-t. ניתן לחלץ תת-אוכלוסיות, DNA ו-RNA מלימפוציטים b ו-t המופרדים בחרוזים מגנטיים לניתוח במורד הזרם כפי שהודגם זה עתה.

לדוגמה, כאן, הזיהוי הספציפי של DNA אדנו-וירוס בלימפוציטים TONSOR T כפי שזוהה על ידי PCR מוצג ציטופלזמה איכותית. ניתן להפיק RNA גם מלימפוציטים מבודדים או מסוג B NT. ברגע שמפלצת ניתן לעבד שתי דגימות שקדים תוך שש שעות אם הטכניקה מבוצעת כראוי.

בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לעבד את דגימות השקדים במהירות האפשרית. מספר שלבי הכביסה ונפח מאגר הכביסה הם גם פרמטרים קריטיים לתוצאה טובה. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו QPCR ו-R-T-Q-P-C-R כדי לענות על שאלות נוספות לגבי הנוכחות הכמותית של DNA ויראלי ו-mRNA לאחר פיתוחו.

טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הווירולוגיה לחקור את הפתוגנזה והחביון של מינים נגיפיים שונים ברקמות הלימפה האנושיות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד שברי לימפוציטים BT מדגימות שקדים אנושיים. אל תשכח שעבודה עם חומרים לא מוקרנים ממקור אנושי כמו דם ורקמות עלולה להיות מסוכנת ביותר.

לכן, יש להקפיד על נוהלי בטיחות מתאימים.