Name: שחזור הקרינה לאחר מיזוג אגל למדוד דיפוזיה דו ממדים של חד שכבתי פוספוליפידים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: למד שחזור קרינה לאחר מיזוג אגל למדידת דיפוזיה דו-ממדית בשכבות פוספוליפידים חד-שכבתיות. שיטה זו מאפשרת תצפית ישירה על ערבוב סורפקטנטים וחילוץ מקדמי דיפוזיה בביופיזיקה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכת על ידי הפרויקט ממומן על-KAIST K-העמק האדום וארוחת בוקר לשינה 2014 ותכנית מחקר המדע בסיסי באמצעות קרן המחקר הלאומית של קוריאה (NRF- 2012R1A6A3A040395, NRF-2013R1A1A2057708, NRF- 2012R1A1A1011023).

<ol><li>Van Meer, G., Voelker, D. R., Feigenson, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+lipids%3A+where+they+are+and+how+they+behave%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Membrane lipids: where they are and how they behave.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (2), 112-124 (2008).</li>
<li>Christon, R., Even, V., Daveloose, D., Léger, C. L., Viret, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+fluidity+and+lipid%E2%80%94protein+relationships+in+pig+intestinal+brush-border+membrane+by+dietary+essential+fatty+acid+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta+-+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Modification of fluidity and lipid—protein relationships in pig intestinal brush-border membrane by dietary essential fatty acid deficiency.</a> Biochim. Biophys. Acta - Biomembr. 980 (1), 77-84 (1989).</li>
<li>Stubbs, C. D., Smith, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+modification+of+mammalian+membrane+polyunsaturated+fatty+acid+composition+in+relation+to+membrane+fluidity+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta+-+Rev.+Biomembr%22%5BJournal%5D)">The modification of mammalian membrane polyunsaturated fatty acid composition in relation to membrane fluidity and function.</a> Biochim. Biophys. Acta - Rev. Biomembr. 779 (1), 89-137 (1984).</li>
<li>Holthuis, J. C. M., Menon, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+landscapes+and+pipelines+in+membrane+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Lipid landscapes and pipelines in membrane homeostasis.</a> Nature. 510 (7503), 48-57 (2014).</li>
<li>Alonso, C., Waring, A., Zasadzinski, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keeping+lung+surfactant+where+it+belongs%3A+protein+regulation+of+two-dimensional+viscosity%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Keeping lung surfactant where it belongs: protein regulation of two-dimensional viscosity.</a> Biophys. J. 89 (1), 266-273 (2005).</li>
<li>Kim, K., Choi, S. Q., Zell, Z. a, Squires, T. M., Zasadzinski, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+cholesterol+nanodomains+on+monolayer+morphology+and+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+%28U.+S.+A.%29%22%5BJournal%5D)">Effect of cholesterol nanodomains on monolayer morphology and dynamics.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. (U. S. A.). 110 (33), E3054-E3060 (2013).</li>
<li>Hormel, T. T., Kurihara, S. Q., Brennan, M. K., Wozniak, M. C., Parthasarathy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Lipid+Membrane+Viscosity+Using+Rotational+and+Translational+Probe+Diffusion%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Letters%22%5BJournal%5D)">Measuring Lipid Membrane Viscosity Using Rotational and Translational Probe Diffusion.</a> Phys. Rev. Letters. 112 (18), 188101(2014).</li>
<li>Ding, J., Warriner, H. E., Zasadzinski, J. a, Schwartz, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+needle+viscometer+for+Langmuir+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Magnetic needle viscometer for Langmuir monolayers.</a> Langmuir. 18 (13), 2800-2806 (2002).</li>
<li>Dhar, P., Cao, Y., Fischer, T. M., Zasadzinski, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+interfacial+shear+microrheology+of+aging+protein+films%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Letters%22%5BJournal%5D)">Active interfacial shear microrheology of aging protein films.</a> Phys. Rev. Letters. 104 (1), 1-4 (2010).</li>
<li>Kim, K., Choi, S. Q., Zasadzinski, J. A., Squires, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interfacial+microrheology+of+DPPC+monolayers+at+the+air-water+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Interfacial microrheology of DPPC monolayers at the air-water interface.</a> Soft Matter. 7 (17), 7782-7789 (2011).</li>
<li>Choi, S. Q., Steltenkamp, S., Zasadzinski, J. A., Squires, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+microrheology+and+simultaneous+visualization+of+sheared+phospholipid+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Commun%22%5BJournal%5D)">Active microrheology and simultaneous visualization of sheared phospholipid monolayers.</a> Nature Commun. 2 (5), 312(2011).</li>
<li>Caruso, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+lateral+diffusion+coefficients+in+air-water+monolayers+by+fluorescence+quenching+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Determination of lateral diffusion coefficients in air-water monolayers by fluorescence quenching measurements.</a> J. Am. Chem. Soc. 113 (16), 4838-4843 (1991).</li>
<li>Filippov, A., Orädd, G., Lindblom, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+cholesterol+on+the+lateral+diffusion+of+phospholipids+in+oriented+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">The effect of cholesterol on the lateral diffusion of phospholipids in oriented bilayers.</a> Biophys. J. 84 (5), 3079-3086 (2003).</li>
<li>Schwille, P., Korlach, J., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+correlation+spectroscopy+with+single-molecule+sensitivity+on+cell+and+model+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Fluorescence correlation spectroscopy with single-molecule sensitivity on cell and model membranes.</a> Cytometry. 36 (3), 176-182 (1999).</li>
<li>Lopez, A., Dupou, L., Altibelli, A., Trotard, J., Tocanne, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+recovery+after+photobleaching+%28FRAP%29+experiments+under+conditions+of+uniform+disk+illumination.+Critical+comparison+of+analytical+solutions%2C+and+a+new+mathematical+method+for+calculation+of+diffusion+coefficient+D%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) experiments under conditions of uniform disk illumination. Critical comparison of analytical solutions, and a new mathematical method for calculation of diffusion coefficient D.</a> Biophys. J. 53 (6), 963-970 (1988).</li>
<li>Axelrod, D., Koppel, D. E., Schlessinger, J., Elson, E., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mobility+measurement+by+analysis+of+fluorescence+photobleaching+recovery+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Mobility measurement by analysis of fluorescence photobleaching recovery kinetics.</a> Biophys. J. 16 (9), 1055-1069 (1976).</li>
<li>Vaz, W. L., Clegg, R. M., Hallmann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+diffusion+of+lipids+in+liquid+crystalline+phase+phosphatidylcholine+multibilayers.+A+comparison+of+experiment+with+theory%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Translational diffusion of lipids in liquid crystalline phase phosphatidylcholine multibilayers. A comparison of experiment with theory.</a> Biochemistry. 24 (3), 781-786 (1985).</li>
<li>Wu, E. S., Jacobson, K., Papahadjopoulos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+diffusion+in+phospholipid+multibilayers+measured+by+fluorescence+recovery+after+photobleaching%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Lateral diffusion in phospholipid multibilayers measured by fluorescence recovery after photobleaching.</a> Biochemistry. 16 (17), 3836-3841 (1977).</li>
<li>Peters, R., Beck, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+diffusion+in+phospholipid+monolayers+measured+by+fluorescence+microphotolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+%28U.+S.+A.%29%22%5BJournal%5D)">Translational diffusion in phospholipid monolayers measured by fluorescence microphotolysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. (U. S. A.). 80 (23), 7183-7187 (1983).</li>
<li>Kuhn, H., Mobius, D., Bucher, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKuhn%2C+H+%22Physical+Methods+of+Chemistry%22">Physical Methods of Chemistry</a>. Crawley, J. N., et al. 1, Part 3B, 651-653 (1972).</li>
<li>Mayer, L. D., Hope, M. J., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicles+of+variable+sizes+produced+by+a+rapid+extrusion+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta+-+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Vesicles of variable sizes produced by a rapid extrusion procedure.</a> Biochim. Biophys. Acta - Biomembr. 858 (1), 161-168 (1986).</li>
<li>Rotenberg, Y., Boruvka, L., Neumann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+surface+tension+and+contact+angle+from+the+shapes+of+axisymmetric+fluid+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Colloid+Interface+Sci%22%5BJournal%5D)">Determination of surface tension and contact angle from the shapes of axisymmetric fluid interfaces.</a> J. Colloid Interface Sci. 93 (5), 169-183 (1983).</li>
<li>Jeong, D. W., Kim, K., Lee, S., Choi, M. C., Choi, S. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+recovery+after+merging+a+surfactant-covered+droplet%3A+a+novel+technique+to+measure+the+diffusion+of+phospholipid+monolayers+at+fluid%2Ffluid+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Fluorescence recovery after merging a surfactant-covered droplet: a novel technique to measure the diffusion of phospholipid monolayers at fluid/fluid interfaces.</a> Langmuir. 30 (48), 14369-14374 (2014).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין אינטרסים פיננסיים מתחרים.

פראם חולק הרבה עקרונות יסוד עם FRAP, במיוחד למדידת התאוששות הקרינה לאחר הלבנת אזור מסוים, אבל פראם משתמש בתהליך של מיזוג אגל על ​​הממשק השטוח כדי ליצור אזור מולבן, במקום ליישם אור אינטנסיבי. תהליך המיזוג הוא כך צעד החשוב ביותר בפראם, ובמיוחד, את הצורה של הכתם הכהה בmonolayer השטוח לאחר מיזוג טיפה קובעת את הדיוק של מדידת diffusivity. באופן ספציפי, המבוססים על שיטה נוכחית, שרק להגדיר את המעגל עם רדיוס R כאזור של עניין כדי לחשב את העצמה הממוצעת של הכתם הכהה, המוצגת בהליך 4, ואם יש סטייה גדולה מדי מהצורה העגולה, זה יפריע המדידה המדויקת של מקדם הדיפוזיה. לכן, יש צורך להשיג אזור כהה בצורה מעגלית, אבל, צורות noncircular נוצרות לעתים בשל מספר סיבות. ראשית, אם קיים זרימת הסעה בחיות המחמדצלחת רי, את הצורה של האזור הכהה הופכת מוארכת לאורך כיוון הזרימה. כאמור בהליך 1.3, מכשיר קונוס-צורה מסייע לדכא את זרימת ההסעה, והתארכות זו תהיה מזערית. שנית, אם סוף קצה הנימים נוגע ממשק השטוח בתהליך מיזוג, האזור הכהה נוצר עם מגוון רחב של צורות מאז סוף הנימים קוטע את תהליך המיזוג. על ידי קבלת טיפה שתלוי רק מהסוף מאוד של הנימים, ניתן למנוע הפרעה זו. בפרט, טיפול הידרופובי של הנימים עוזר הטיפה לשבת בסוף מאוד של הנימים. לכן, ירי צרות לעיל ושינויים יאפשרו לנו למדוד תכונות דיפוזיה מדויקת יותר. תהליך זה troubleshot גם כך מאפשר פראם יש כמה יתרונות משמעותיים על פני FRAP. ראשית, פראם דורש ציוד פשוט בהשוואה לFRAP. לפראם, זה מספיק כדי להשתמש במייקרו הקרינה פשוטלהתמודד, במקום מיקרוסקופ confocal יקר עם לייזר בהספק גבוה באורך גל שחייב להתאים עם ספקטרום הבליעה של הצבע. בנוסף, יש צורך להשתמש במכשיר נוסף כדי להתאים את הגודל לאזור מולבן בFRAP, תוך פראם שולט בגודל השטח בקלות על ידי התאמת גודל הטיפה, או לחץ המשטח על פני השטח אגל. שנית, ניתן להשתמש במינים שונים של צבעים בפראם. FRAP משתמש רק מולקולות צבע הלבנה שתהליך הוא הרבה יותר מהר מאשר תהליך דיפוזיה. אם דיפוזיה של הצבעים מתרחשת במהלך תהליך ההלבנה, קשה להעריך את רכוש דיפוזיה מדויקת. פראם, לעומת זאת, אינו דורש תהליך להלבנת צבעים וזה ובכך מאפשר שימוש בסוגים שונים של צבעים בהדמית הקרינה. בנוסף, דורש FRAP לייזרי מתח גבוה נוספים ומסנן קובע לשנות את מיני צבע, בזמן שהוא רק צורך להחליף את מערכות הסינון בפראם. לבסוף, מאז monolayers על פני השטח אגל והממשק השטוח יכול להיווצר באופן עצמאי, ובכך לאפשר את הלימוד בין-דיפוזיה או ערבוב בין שני monolayers שומנים שונה על ידי מיזוג מסוג monolayer לmonolayer B-הסוג, בעוד FRAP מודד רק דיפוזיה עצמית של שכבה. למרות יתרונות אלה, תהליך איחוד אגל על ​​ממשק אוויר מים שטוח עלול להגביל בטכניקה זו בשל כמה בעיות שעלולות להיות לדאגה, כגון אי-התאמת לחץ משטח בין שני monolayers, בקנה מידה של תהליך מיזוג הזמן , ועלייה בלחץ פני השטח של monolayer השטוח לאחר מיזוג טיפות. נושאים אלה, עם זאת, אינם משפיעים על מדידת דיפוזיה באופן משמעותי מהסיבות הבאות. ראשית, למרות שלחצי המשטח בשני monolayers שונה הם שונים לגמרי, תהליך איזון יושלם בשלב מוקדם מאוד בתהליך ההחלמה. לדוגמא, אם לאהוא משטח לחץ של monolayer על פני השטח הטיפה גבוה יותר מזה של monolayer בממשק אוויר מים השטוח, האזור הכהה מתרחב עד לחץ משטח equilibrates. מכיוון שתהליך זה יושלם בתוך 10 אלפיות שני, לחץ המשטח יהיה equilibrated לפני זה משפיע על תהליך דיפוזיה באופן משמעותי. שנית, אם בקנה מידה של תהליך מיזוג הזמן הוא מספיק מהר, זה לא להגביל את מדידת דיפוזיה בכלל. למרבה המזל, תהליך מיזוג אופייני גם יושלם בתוך 10 אלפיות שניים. לבסוף, גם מיזוג מרובה של הטיפות על הממשק השטוח לא להגביר את הלחץ מאז את שטח הפנים של שוקת המשטח הוא גדול בהרבה משטח הפנים של הטיפה. על פי הגדלים של השוקת והטיפין, שתוארה בפרוטוקול, האזור למולקולה מגביר פחות מ 0.015% על ידי מיזוג אגל. בהתאם לכך, הגידול של לחץ משטח עקב השינוי של אזור כל מולקולה הוא פחות מ -0.1%, שהוא negligiblדואר כי זה הרבה יותר קטן מהשגיאה האופיינית בלחץ משטח, כפי שנמדד על ידי tensiometer צלחת Wilhelmy. לסיכום, הצגנו שיטה חדשה למדידת רכוש דיפוזיה לרוחב של monolayer פוספוליפידים ידי מיזוג monolayer אגל על ​​הממשק השטוח. טכניקה זו דורשת ציוד פשוט יחסית וגם מאפשרת השימוש בסוגים שונים של מיני צבע. פראם הוא בכך שעלול להיות רלוונטי למדידת דיפוזיה של כל סוכנים פעילים שטח, כוללים פוספוליפידים, קופולימרים לחסום, חלבונים ואפילו חלקיקים בנוזל ממשק-נוזל. יתר על כן, אנו מצפים שפראם מספק דרך חדשה ללמוד בין-דיפוזיה או ערבוב בין שני סוכנים פעילים שטח שונים.

<html> פוספוליפידים הם רכיבים עיקריים של קרום תא והקרומים של האברונים, ואת הנזילות של שכבות קרום אלה לעתים קרובות משפיעים על תפקודים תאיים על ידי שינוי הפעילות של חלבונים בממברנה 1 - 3. לדוגמא, קרום &#160; הומאוסטזיס שומנים מושגת על ידי ויסות זרימת קרום, שהוא זוהה על ידי חלבונים בממברנה, ורמה חריגה של נזילות גורמת למחלות קשות, כגון steatosis וcholestasis 4 בכבד. בנוסף, יש נזילות של monolayer פוספוליפידים בממשק נוזל אוויר alveoli השלכות חשובות בפונקציות שלה. נזילות גבוהות של monolayer פוספוליפידים שטח הריאה מקלות הפצה של השכבה בשאיפה, ואילו נזילות נמוכות מאפשרת השכבה להישאר בתוך alveoli במהלך הנשיפה 5,6. מכיוון שכך, חשוב להעריך את הנזילות של שכבות פוספוליפידים להבין את תפקידם. _content &quot;&gt; מדידה ישירה של הנזילות היא צמיגות, והצמיגות של שכבות פוספוליפידים כבר נמדדה באמצעות קולואידים בגודל מיקרון 7, מחטים מגנטיות 8,9, ומיקרו-כפתורים מגנטיים 6,10,11. עם זאת, טכניקות אלה מוגבלים לסרטים קשיחים יחסית, ולא יכול למדוד סרטים פחות צמיגים. במקרים כאלה, diffusivity יהיה אלטרנטיבה ללכמת נזילות של שכבות פוספוליפידים. במשך כמה עשורים, מגוון של טכניקות כדי למדוד את תכונות דיפוזיה של שכבות פוספוליפידים פותחו, כגון שיטת הקרינה מרווה 12, NMR שיפוע השדה פעמו 13, וספקטרוסקופיה מתאם הקרינה (FCS) 14. אחת השיטות מייצגות ביותר היא התאוששות הקרינה לאחר photobleaching (FRAP) 15,16. בשל הפשטות של הליך המדידה וקשור תאוריות, כמה מחקרים על תכונות דיפוזיה של שכבות פוספוליפידים בוצעו באמצעות FRAP <sup&gt; 17-19. עם זאת, בדרך כלל דורש FRAP התקנת מיקרוסקופ confocal יקר עם לייזר בעצמה גבוהה. כאן, אנו מציגים טכניקה חדשה למדידת דיפוזיה לרוחב של monolayers פוספוליפידים, כפי שכונה התאוששות הקרינה לאחר המיזוג (פראם). ההבדל העיקרי בין FRAP ופראם הוא שצעד photobleaching הוא הוחלף על ידי גיבוש הירידה. מיזוג אגל מכוסה על ידי monolayer אינו הקרינה על monolayer השטוח שכותרתו fluorescently משאיר כתם כהה מעגלי על monolayer השטוח בהיר, ולכן הגדרה אותו מצב ראשוני עם צעד photobleaching. לאחר מכן, אנו צופים בהתאוששות הקרינה בכתם הכהה עם זמן למדוד את diffusivity לרוחב. צעד זה חדש &quot;הלבנה&quot; על ידי גיבוש ירידה מספק יתרונות משמעותיים על פני FRAP: פראם דורש מיקרוסקופ פלואורסצנטי ולא מיקרוסקופ confocal יקר עם לייזר בהספק גבוה שיש צורך לFRAP בלבד. אניבנוסף n, יש פראם מבחר רחב של צבעי הקרינה שכן הוא אינו כרוך בתהליך photobleaching. לבסוף, שני monolayers שונה, monolayer אגל וmonolayer שטוח, ניתן להכין באופן עצמאי, ובכך מאפשרים interdiffusion להימדד, בעוד FRAP מודד את דיפוזיה העצמית של monolayers בלבד. פראם מספק מגוון רחב של מדידות דיפוזיה מחומרים צמיגים מאוד לחומרים כמעט בלתי צמיגים. בעיקרון, פראם ניתן למדוד את diffusivity המרבי של 10 מיקרומטר 6 2 / sec, אשר ניתן להשוות טכניקות קיימות, כאשר מתרחשת דיפוזיה על פני השטח של 100 מיקרומטר על ידי 100 מיקרומטר בזמן לתהליך גיבוש ירידה (~ 10 אלפיות השנייה). יתר על כן, ניתן למדוד תהליך דיפוזיה איטי בקלות, אלא אם כן monolayers הוא מוצקים. פראם יכול לשמש לכל מיני סוגים של חומרים פעילים שטח, כל עוד מולקולות מתויגות fluorescently מתאימים זמינות.

<table><tbody><tr><td>תאגיד Acetone</td><td>OCI</td><td>אצטון 3.8 ליטר טוהר טהור במיוחד</td><td>: &ge; 99.5%, נא לעיין בגיליונות נתוני בטיחות החומרים (MSDS) לפני השימוש.</td></tr><tr><td></td><td>תאגיד אתנול OCI</td><td>אתנול 3.8 ליטר טוהר טהור במיוחד</td><td>: &ge; 94%, נא לעיין בגיליונות נתוני בטיחות החומרים (MSDS) לפני השימוש.</td></tr><tr><td>דיולאוילפוספטידילכולין,</td><td>DOPC Avanti Polar Lipids</td><td>850375C</td><td>אנא עיין בגיליונות נתוני בטיחות החומרים (MSDS) לפני השימוש. כלורופורם הוא מסרטן.</td></tr><tr><td>כלורופורם</td><td>LiChrosolv</td><td>כלורופורם אולטרה-טהור (A3633)</td><td>טוהר: &ge; 99.8%, נא לעיין בגיליונות נתוני בטיחות החומרים (MSDS) לפני השימוש. </td></tr><tr><td>רודמין מסרטן DPPE</td><td>Avanti שומנים קוטביים</td><td>810158C, 810158P</td><td>הימנע מחשיפה ישירה לאור כדי למנוע הלבנת פוטו</td></tr><tr><td>צלחת Wilhelmy טנסיומטר</td><td>R& K טכנולוגיית סרט אורגני אולטרה-דק</td><td>טנסיומטר וילהלמי</td><td>http://www.rieglerkirstein.de/index.htm</td></tr><tr><td>חולץ מיקרופיפטה</td><td>מכשיר סאטר</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו-מזרק</td><td>אפנדורף</td><td>פמטו-ג'ט</td><td></td></tr><tr><td>מיקרומניפולטור מיקרומניפולטור</td><td>אפנדורף</td><td>5171</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ 1</td><td>עדשת אובייקטיבית: אולימפוס</td><td>עדשת אובייקטיבי: UPlanFl 10x</td><td>עדשת אובייקטיבית: 10X NA 0.3</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ 2</td><td>עדשת אובייקטיבית: אולימפוס, עדשת צינור: Thorlabs</td><td>עדשת אובייקטיבית: UPlanFl 10x</td><td>עדשת אובייקט: 10X NA 0.3, עדשת צינור: אורך מוקד 17 ס"מ</td></tr><tr><td>CCD למיקרוסקופ 1</td><td>Jai</td><td>CV 950 מצלמה</td><td></td></tr><tr><td>CCD למיקרוסקופ 2</td><td>Andor</td><td>iXon3 EMCCD</td><td></td></tr><tr><td>סט מסננים</td> טכנולוגיית <td>Chroma</td><td>סט קטלוג 49004: ET545, T565, ET605</td><td>הכן מתאים למולקולות צבע</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>DAIHAN Scientific</td><td>Wiseclean WUC-D06H</td><td></td></tr></tbody></table>

שחזור הקרינה לאחר מיזוג אגל למדוד דיפוזיה דו ממדים של חד שכבתי פוספוליפידים

Fluorescence Recovery after Merging a Droplet to Measure the Two-dimensional Diffusion of a Phospholipid Monolayer

אנו מציגים שיטה חדשה למדידת הדיפוזיביות הרוחבית של חד-שכבת פעילי שטח בממשק נוזל-נוזל, הנקראת התאוששות פלואורסצנטית לאחר מיזוג (FRAM). FRAM מאמצת את אותם עקרונות כמו טכניקת התאוששות הקרינה לאחר פוטו-הלבנה (FRAP), במיוחד למדידת התאוששות הקרינה לאחר הלבנת אזור מסוים, אך FRAM משתמש בהתלכדות טיפה במקום במולקולות צבע פוטו-הלבנה כדי לגרום לשיפוע פוטנציאלי כימי של מולקולות צבע. לטכניקה שלנו יש כמה יתרונות על פני FRAP: היא דורשת רק מיקרוסקופ פלואורסצנטי ולא מיקרוסקופ קונפוקלי המצויד בלייזרים בעלי הספק גבוה; הוא למעשה חופשי ממבחר צבעי פלואורסצנטיות; ויש לו הרבה יותר חופש להגדיר את אזור הדיפוזיה הנמדד. יתר על כן, FRAM מספק פוטנציאל לחקר ערבוב או דיפוזיה הדדיפוזיה של שני פעילי שטח שונים, כאשר החד-שכבות על פני השטח של טיפות ובממשק אוויר/מים שטוח מוכנות עם מינים שונים, באופן עצמאי.

סדרה של תמונות הקרינה התקבלו עם זמן בתהליך ההתאוששות לאחר מיזוג אגל מצופה monolayer dOPC על monolayer dOPC שטוח, כפי שמופיעה באיור 1. Monolayer dOPC בממשק אוויר מים השטוח היה מסומם עם כמויות נמוכות של Rhodamine-DPPE, וזה ובכך הפך אותו אפשר לדמיין רקע עם צבע בהיר וכהה באזור חדש שנוסף לממשק השטוח. יש, תהליך התאוששות נצפה בMN 23 / מ &#39;של לחץ משטח קבוע. בכושר של משוואת 1 לשינוי של עוצמת השבר לפי הזמן מוצג באיור 2. R 2 הערך של כושר זה הוא 0.999, ובכושר זה עדיין עובד היטב גם בלחצי משטח נמוכים או גבוהים יותר. מקדם דיפוזיה של monolayer dOPC מתקבל מכושר זה היה 27.54 מיקרומטר 2 / sec בMN 23 / ​​מ &#39;של לחץ פני השטח. לאימות נוספת של פראם, מקדמי דיפוזיה של DOמחשב וdipalmitoylphosphatidylcholine monolayers (DPPC) נמדדו לפי לחץ פני השטח. כפי שניתן לראות באיור 3, פראם לוכד את הירידה המהירה של מקדם הדיפוזיה של monolayer DPPC ב ~ 9 MN / מ &#39;של לחץ משטח, שבי LC (נוזל מרוכז) - LE (נוזל מורחב) שלב מעבר מתרחש 10, ואת הערכים של מקדמי דיפוזיה גם הסכימו גם עם המדידות בעבר על ידי פיטרס et al. 19. בנוסף, דעיכה מעריכית של מקדם דיפוזיה עם לחץ המשטח נצפתה בשכבת dOPC, ונטייה זו היא כמעט זהה לאחד שנמדד על ידי קארוזו et al. 12. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53376/53376fig1.jpg" /> איור 1. איור סכמטי של פראם (התאוששות הקרינה לאחר המיזוג) טכניקה (). כשפהאגל מצופה monolayer id ממוזג לממשק אוויר מים שטוח, monolayer השומנים ללא הקרינה מתויג שומנים מוכנס לתוך monolayer שומנים ניאון שטוח. תמונות מיקרוסקופ (ב) הקרינה עם זמן בתהליך ההתאוששות של monolayer dOPC בMN 23 / ​​מ &#39;של לחץ משטח (סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר). האזור האפל של monolayer dOPC הוא התאושש באופן מלא על ידי תהליך דיפוזיה בתוך כמה דקות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53376/53376fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53376/53376fig2.jpg" /> איור 2. עוצמת חלקית לעומת זמן. עיגולים שחורים והקו המקווקו האפור מציינים את הערכים של עוצמות השבר שהתקבלו מניתוח תמונה (נהלים 4.1 ו -4.2) ואת ההתאמה של משוואת 1 לעוצמות השבר עם זמן,הראה בהליך 4.3, בהתאמה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53376/53376fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53376/53376fig3.jpg" /> 3. מקדמי דיפוזיה איור של dOPC (משולש) וDPPC (ריבוע ריק) monolayers כפונקציה של לחץ פני השטח. הקווים עם הצבע האפור הבהיר ועם הצבע האפור הכהה מצביעים על הערכים של מקדם הדיפוזיה שדווח בעבר על ידי פיטרס et al. וקארוזו et al., בהתאמה. נתון זה שונה מet al ג&#39;אונג. 23. הודפס מחדש באישור מet al ג&#39;אונג. אנגמיור. 30 (48), 14,369-14,374. כל הזכויות שמורות 2,014 האגודה האמריקנית לכימיה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53376/53376fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ עליה</a>דואר כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

אנו מציגים טכניקה חדשה למדידת הדיפוזיה הרוחבית של מין פעיל על פני השטח בממשק נוזל-נוזל על ידי מיזוג חד-שכבת טיפה על חד-שכבה שטוחה.

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after ...

המטרה הכוללת של טכניקה זו היא לצפות בערבוב דו-ממדי של שני חומרים פעילים שטחית (surfactants) שונים ולהסיק ממנו את מקדם הדיפוזיה. טכניקה זו יכולה לסייע במתן תשובה לשאלות מפתח בתחומי הביופיזיקה ומדע השטחים, כגון נזילות ואינטראקציות של מינים שונים בממברנות של תאים, וכן אינטראקציה בין גורמים פעילים שטחית. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא היכולת לצפות ישירות בערבוב של כל שתי שכבות מונו-מולקולריות פעילות שטחית.שניהם נשלטים באופן עצמאי באמצעות מערך פשוט מאוד ליצירת שכבה מונו-מולקולרית של פוספוליפידים. ראשית, הכין תמיסת פוספוליפידים על ידי ניקוי של בקבוקון בנפח ארבעה ליטר בעל פקק מצופה פוליטטרהפלואורואתילן. שטוף באצטון, אתנול ומים דה-יוניים לפחות שלוש פעמים.לאחר מכן, נשב גז חנקן ביסודיות לתוך המבחנה כדי להסיר את המים, והמס mg 1 של פוספוליפיד בתוך mL 1 של כלורופורם במבחנה כדי להגיע לריכוז של mg/mL 1. לאחר מכן, הוסף פוספוליפידים מסוג dag בכמות של פחות מ-1% נוסף מתמיסת הפוספוליפיד. כדי להדמיאן את השכבה החד-מולקולרית (monolayer) של הפוספוליפידים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה, עטוף את המבחנה בסרט polytetrafluoroethylene למניעת התאיידות הממס, ואחסן את הדגימה במקפיא בטמפרטורה של 20°C- כדי להשקיע את הפוספוליפידים בממשק האוויר-מים.ראשית, נקו Petri dish באמצעות אתנול ומים דאיוניים לפחות שלוש פעמים. לאחר מכן, מלאו את ה-Petri dish ב-10 milliliters של מים דאיוניים כדי ליצור ממשק אוויר-מים. פזרו מספר microliters של תמיסת הפוספוליפיד באמצעות micro syringe על ממשק נקי כדי להגיע ללחץ הפנים הרצוי, והמתינו לפחות 30 דקות לאידוי מלא של הממס לפני ביצוע הניסוי.מדוד את לחץ הפני面 של השכבה המונוליירית של הפוספוליפידים באמצעות לוחת וילהלם (Wilhelm plate) ותנסיומטר (Tensiometer). השתמש במערכת בצורת קונוס הכוללת מאגר של שלושה מילימטרים עם שני תעלות דקות המחוברות לחלק גדול של צלחת הפטרי, כדי לדכא את הזרימה הקונבקטיבית של המונולייר, שעלולה להפריע למורפולוגיה, לדימוי ולמדידת לחץ הפני面. צפה את הפוספוליפידים בקצה של קפילרית זכוכית מחודדת.ראשית, נקוה זכוכית באמצעות אצטון, אתנול ומים דה-יוניים לפחות שלוש פעמים. הניחו את הקפילרה המצרת על זכוכית נקייה והטו אותה כדי לאפשר מגע של קצה הסיב עם הזכוכית. טפטפו מספר טיפות של תמיסת הפוספוליפידים על קצה הסיב של הקפילרה המודבק לזכוכית באמצעות מזרק זכוכית, והמתינו לפחות 30 דקות עד להתאיידות מלאה של הממס ליצירת טיפה המכילה שכבה בודדת (monolayer) של פוספוליפידים על פני השטח המעוקלים.מלאו את הנימיים המצרים ב-10 µL של מים דה-יוניים. חברו את הנימיים למזריק מיקרו אוטומטי כדי לספק את הלחץ הדרוש ליצירת הטיפה. התקינו את הנימיים המחוברים למזריק המיקרו על מניפולטור מיקרו כדי לשלוט במיקום הנימיים באופן מדויק.הכינו מיקרוסקופ שדה בהיר (bright field) לצילום מבט צדי של הנימי באמצעות מצלמת CCD. מיקרוסקופ זה משמש כמיקרוסקופ ראשון ומאפשר התבוננות במיקום המדויק של הטיפה לאורך ציר Z, וכן הערכה של גודל הטיפה. בעזרת מיקרו-מניפולטור, העבירו את קצה הסיכה למיקום המאפשר מבט צדי של הקצה.יש לוודא שהקצה נראה היטב תחת מיקרוסקופ מספר אחת ולהפעיל לחץ משתנה באמצעות קצה הקפילרה עד להיווצרות טיפה בגודל מתאים. כדי לנטר ולשלוט במיקום הטיפה, יש להכין מיקרוסקופ הפוך שישמש כמיקרוסקופ מספר שתיים, כפי שהודרך בפרוטוקול הטקסט, תוך שימוש במיקרו-מניפולטור. העבירו את הטיפה המצופה בפספוליפיד לממשק אוויר-מים שטוח לאורך ציר Z, אך אל תמזגו את הטיפה עדיין.השתמש במיקרוסקופ מספר אחת כדי להדמיות של מבט צדי של הטיפה. מקם את הטיפה במרכז המבט העליון של השכבה החד-שכבתית השטוחה.שימוש במיקרו-מניפולטור. השתמש במצב מיקרוסקופ שדה בהיר (brightfield) של מיקרוסקופ מספר שתיים כדי להדמיות מבט על של השכבה החד-שכבתית השטוחה. כדי לחשב את מקדם הדיפוזיה באופן מדויק יותר, אזור ה-Tacho הנוצר ממיזוג צריך להיות בצורה מעגלית, לכן חשוב להגביל את הזרימה בצלחת הפטרי ולוודא שקצה השפיץ אינו נוגע בממשק.כדי למזג את הטיפה אל ממשק האוויר-מים השטוח, השתמשו במיקרו-מניפולטור כדי להזיז את הטיפה רחוק יותר לעבר הממשק השטוח עד שהטיפה תתמזג עם הממשק. הקליטו סדרה של תמונות פלואורסצנציה בהתאם לזמן שחלף מאז מיזוג הטיפה, באמצעות מצב הפלואורסצנציה של המיקרוסקופ. שתיים. עיינו בפרוטוקול הטקסט לצורך ניתוח התמונות.סדרת תמונות פלואורסצנטיות התקבלה לאורך זמן במהלך תהליך ההתאוששות. לאחר מיזוג טיפה מצופה בשכבה אחת של A-D-O-P-C על גבי שכבה אחת שטוחה של DOPC, נצפה תהליך התאוששות בלחץ פנים קבוע של 23 millitant per meter. התאמה של השינוי בעוצמה השברית ביחס לזמן מוצגת כאן.ערך ה-R squared של התאמה זו הוא 0.999. מקדם הדיפוזיה של שכבת ה-DOPC המוני-שכבתית שהתקבל מהתאמה זו היה 27.54 square microns per second בלחץ פנים של 23 millinewtons per meter. לצורך תיקוף נוסף של ה-fluorescence recovery after merging או מקדמי הדיפוזיה של ה-fram, נמדדו מקדמי הדיפוזיה של שכבות ה-DOPC וה-DPPC המוני-שכבתיות בהתאם ללחץ הפנים, כפי שמוצג כאן. ה-Fram לוכד את הירידה המהירה במקדם הדיפוזיה של שכבת ה-DPPC המוני-שכבתיות בלחץ פנים של כ-9 millinewtons per meter, שם מתרחש מעבר פאזה מנוזל מורחב לנוזל מרוכז.ערכי מקדמי הדיפוזיה תאמו היטב עם מדידות קודמות. בנוסף, נצפה דעיכה מעריכית של מקדם הדיפוזיה ביחס ללחץ הפני של שכבת המונולייר של DOPC, בדומה למחקרים שפורסמו בעבר. לאחר רכישת המיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שעתיים, אם היא מבוצעת כראוי.במעקב אחר הליך זה, ניתן לצפות בערבוב בין שני סוגי ליפידים שונים על ידי יצירת שתי שכבות מונו-מולקולריות שונות, אחת על פני השטח הגרמניים והשנייה בממשק החץ השטוח, וזאת כדי לענות על שאלות נוספות כגון אינטראקציה בין סוגי ליפידים שונים לאחר כל פיתוח. טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחומי הביופיזיקה ומדעי השטחים לחקור נזילות ואינטראקציות של מינים שונים בממברנות של תאים, כמו גם אינטראקציה בין חומרים פעילים שטחית.אל תשכחו שעבודה עם כלור עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון שימוש במנדף כימי, בעת ביצוע הליך זה.

fluorescence-recovery-after-merging-droplet-to-measure-two

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

במאמר זה נתאר את הליך למדידת מקדמי דיפוזיה באמצעות רב פוטון התאוששות הקרינה לאחר photobleaching. נתחיל על ידי יישור לייזר לאורך השביל אופטי המדגם קביעת פרמטרים ניסיוניים נאותה, ולאחר מכן להמשיך לייצר והתאמת עקומות בסופו של דבר התאוששות פלואורסצנטי.

מדידת מקדמי דיפוזיה באמצעות שחזור שני הפוטונים Fluorescence לאחר photobleaching

Droplet מבוססי פלטפורמות microfluidic הם המועמדים המבטיחים לניסויים תפוקה גבוהה שכן הם מסוגלים להפיק, picoliter עצמית מידור כלי ובזול בשיעורים קילוהרץ. באמצעות שילוב עם מהירות, רגישות גבוהה שיטות ספקטרוסקופיות ברזולוציה פלואורסצנטי, כמויות גדולות של מידע שנוצר בתוך מערכות אלה ניתן לחלץ ביעילות, לרתום ולנצל אותו.

שיטות גילוי הקרינה לפלטפורמות אגל microfluidic

דו"ח זה מתאר את השימוש הדמיה תא חי וטכניקות photobleach לקבוע את הבעת פני, מסלולי תחבורה קינטיקה סחר exogenously GFP-מתוייגים הביע pH רגיש, חלבונים על הממברנה של נוירונים.

דיפוזיה Exocytosis לרוחב של חלבונים בממברנה של נוירונים בתרבית הוערכה באמצעות שחזור פלואורסצנציה Fluorescence מסופקים Photobleaching

התפלגות מרחבית ודינמיקה זמנית של חלבוני קרום פלזמה ושומנים היא נושא חם בביולוגיה. כאן נושא זה מטופל על ידי ניתוח תנודות תמונה מרחבי-זמני המספק מבחינה רעיונית את אותן כמויות פיזיקליות של מעקב אחר חלקיקים בודדים, אך הוא משתמש בתוויות מולקולריות קטנות ובהגדרות מיקרוסקופיה סטנדרטיות.

מהדמיה מהירה פלואורסצנטי לחוק דיפוזיה מולקולרי בקרום תא חי במיקרוסקופ מסחרי

הכנת שכבות דו-שכבתיות של שומנים מישוריים הנתמכים בזכוכית מתפקדת בחלבון, קביעת ניידות החלבון בפנים ומדידת צפיפות החלבון מוצגת כאן. מתוארת מפת דרכים לבניית מיקרוסקופ השתקפות פנימית כוללת מופחת רעש, המאפשרת הדמיה של פלואורוכרומים דו-שכבתיים בודדים ברזולוציה מרחבית-זמנית גבוהה.

המולקולה בודדת מיקרוסקופ פלואורסצנטי במישורים נתמך bilayers

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לזהות אירועי היתוך אחד, בתיווך מלכודת בין ליפוזומים bilayers נתמך ערוצי microfluidic באמצעות TIRFM המקוטב, עם רגישות מולקולה בודדת ~ 15 ברזולוצית זמן msec. ליפידים ושחרור מטען מסיס ניתן לאתר בו זמנית. Liposome גודל, diffusivity שומנים, ואת הנקבוביות היתוך מאפיינים נמדדים.

מלכודת בתיווך Fusion של יחיד Proteoliposomes עם Bilayers Tethered הנתמך בתוך תא זרימת Microfluidic מנוטר על ידי Polarized TIRF מיקרוסקופי

מתוארת שיטה למדידת דיפוזיה של חלבון בממברנות של תאי חיסון ראשוניים באמצעות ספקטרוסקופיה של מתאם פלואורסצנטי (FCS). במאמר זה מודגם השימוש בנוגדנים לסימון פלואורסצנטי.

דיפוזיה מולקולרית פלזמה ממברנות יסודי לימפוציטים נמדד באמצעות מתאם ספקטרוסקופיה פלואורסצנטי

כאן אנו מציגים bilayer שומנים בדם בהקשר של פלטפורמת microfluidic ללמוד אינטראקציות חלבון- phosphoinositide בשיטה ללא תווית המבוססת על אפנון pH.

PIP על שבב: מחקר ללא תווית של אינטראקציות חלבון- phosphoinositide

פרוטוקול זה מתאר את הייצור של ליפוזומים וכיצד ניתן להשתמש בקיבוע על פני השטח ולעבור באופן אינדיבידואלי בצורה מקבילה מסיבית תוך שימוש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית. הדבר מאפשר לכמת את הגודל והאחידות בין ליפוזומים בודדים של האוכלוסייה.

מיקרוסקופ כמותי מיקרופלואורסצנטית בודד מבוססי ליפומה שיטת הזיהוי של הומוגניות בין ליפוזומים בודדים

המטרה הכוללת של הפרוטוקול היא להכין מעל 1,000,000 הורה, אחיד, יציב, ותואם ביולוגי טיפות של ליטר על 1 ס מ2 מצע מישורי שניתן להשתמש בו עבור סינתזה של חלבון תא ללא.

מערך מערכת Droplet ליטר ליצירת חלבון מקבילי בנפט ממולקולות דנ א יחיד

פרוטוקול זה מתאר כיצד להשתמש במיקרוסקופ TIRF כדי לעקוב אחר תעלות יונים בודדות ולקבוע את פעילותן בקרומי שומנים נתמכים, ובכך להגדיר את יחסי הגומלין בין תנועת הממברנה הצידית לתפקוד הערוץ. הוא מתאר כיצד להכין את הממברנות, לרשום את הנתונים ולנתח את התוצאות.

הדמיה של מולקולה בודדת של תנועתיות צידית ופעילות תעלות יונים בשכבות שומנים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת (TIRF)

למד שחזור קרינה לאחר מיזוג אגל למדידת דיפוזיה דו-ממדית בשכבות פוספוליפידים חד-שכבתיות. שיטה זו מאפשרת תצפית ישירה על ערבוב סורפקטנטים וחילוץ מקדמי דיפוזיה בביופיזיקה.

שחזור הקרינה לאחר מיזוג אגל למדוד דיפוזיה דו ממדים של חד שכבתי פוספוליפידים

גלה סרטונים נוספים