Name: שלב מסוים מיון של Spermatids העכבר על ידי cytometry הזרימה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 31 s
Description: למד שיטת מיון ספרמטידים בעכבר באמצעות ציטומטריית זרימה לחקר מולקולרי של ספרמיוגנזה. השיטה מפרידה לארבע אוכלוסיות נפרדות ללא זיהום צולב ומאפשרת ניתוח של תהליכי עיצוב כרומטין ושלמות גנומית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות לד&quot;ר לאוניד וולקוב ואריק Bouchard לייעוץ הטכני שלהם בנוגע למיקרוסקופיה epifluorescence. תמיכה כלכלית ממומן על ידי המכון הקנדי לבריאות מחקר (מענק # MOP-93,781) לGB

<ol><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+production+of+functional+sperm+in+cultured+neonatal+mouse+testes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes.</a> Nature. 471 (7339), 504-507 (2011).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+production+of+fertile+sperm+from+murine+spermatogonial+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">In vitro production of fertile sperm from murine spermatogonial stem cell lines.</a> Nat. Commun. 2, 472(2011).</li>
<li>Sun, X., Kovacs, T., Hu, Y. -J., Yang, W. -X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+actin+and+myosin+during+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Rep%22%5BJournal%5D)">The role of actin and myosin during spermatogenesis.</a> Mol. Biol. Rep. 38 (6), 3993-4001 (2011).</li>
<li>Cheng, C. Y., Mruk, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+junction+dynamics+in+the+testis%3A+Sertoli-germ+cell+interactions+and+male+contraceptive+development%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Cell junction dynamics in the testis: Sertoli-germ cell interactions and male contraceptive development.</a> Physiol. Rev. 82, 825-874 (2002).</li>
<li>Laiho, A., Kotaja, N., Gyenesei, A., Sironen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+profiling+of+the+murine+testis+during+the+first+wave+of+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Transcriptome profiling of the murine testis during the first wave of spermatogenesis.</a> PLoS ONE. 8 (4), (2013).</li>
<li>Leduc, F., Maquennehan, V., Nkoma, G. B., Boissonneault, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+response+during+chromatin+remodeling+in+elongating+spermatids+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">DNA damage response during chromatin remodeling in elongating spermatids of mice.</a> Biol. Reprod. 78 (2), 324-332 (2008).</li>
<li>Meistrich, M. L., Mohapatra, B., Shirley, C. R., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+transition+nuclear+proteins+in+spermiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Roles of transition nuclear proteins in spermiogenesis.</a> Chromosoma. 111 (8), 483-488 (2003).</li>
<li>Grégoire, M. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Male-driven+de+novo+mutations+in+haploid+germ+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Male-driven de novo mutations in haploid germ cells.</a> Mol. Hum. Reprod. 19 (8), 495-499 (2013).</li>
<li>Simard, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Instability+of+trinucleotidic+repeats+during+chromatin+remodeling+in+spermatids%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mutat%22%5BJournal%5D)">Instability of trinucleotidic repeats during chromatin remodeling in spermatids.</a> Hum. Mutat. , (2014).</li>
<li>Wykes, S. M., Krawetz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+spermatogenic+cells+from+adult+transgenic+mouse+testes+using+unit-gravity+sedimentation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Separation of spermatogenic cells from adult transgenic mouse testes using unit-gravity sedimentation.</a> Mol. Biotechnol. 25 (2), 131-138 (2003).</li>
<li>Yoshida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+first+round+of+mouse+spermatogenesis+is+a+distinctive+program+that+lacks+the+self-renewing+spermatogonia+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28Cambridge%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">The first round of mouse spermatogenesis is a distinctive program that lacks the self-renewing spermatogonia stage.</a> Development (Cambridge, England). 133 (8), 1495-1505 (2006).</li>
<li>Moreno, R. D., Lizama, C., Urzúa, N., Vergara, S. P., Reyes, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase+activation+throughout+the+first+wave+of+spermatogenesis+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Caspase activation throughout the first wave of spermatogenesis in the rat.</a> Cell Tissue Res. 325 (3), 533-540 (2006).</li>
<li>Meistrich, M. L., Trostle-Weige, P. K., Van Beek, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+specific+stages+of+spermatids+from+vitamin+A-synchronized+rat+testes+for+assessment+of+nucleoprotein+changes+during+spermiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Separation of specific stages of spermatids from vitamin A-synchronized rat testes for assessment of nucleoprotein changes during spermiogenesis.</a> Biol. Reprod. 51 (2), 334-344 (1994).</li>
<li>van Pelt, A. M., de Rooij, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronization+of+the+seminiferous+epithelium+after+vitamin+A+replacement+in+vitamin+A-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Synchronization of the seminiferous epithelium after vitamin A replacement in vitamin A-deficient mice.</a> Biol. Reprod. 43, 363-367 (1990).</li>
<li>Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+purification+of+mouse+meiotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry purification of mouse meiotic cells.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li>
<li>Kovtun, I. V., McMurray, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trinucleotide+expansion+in+haploid+germ+cells+by+gap+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genet%22%5BJournal%5D)">Trinucleotide expansion in haploid germ cells by gap repair.</a> Nature Genet. 27 (4), 407-411 (2001).</li>
<li>Bastos, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+characterization+of+viable+meiotic+and+postmeiotic+cells+by+Hoechst+33342+in+mouse+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis.</a> Cytometry A. 65 (1), 40-49 (2005).</li>
<li>Lassalle, B., Ziyyat, A., Testart, J., Finaz, C., Lefèvre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+method+to+isolate+round+spermatids+from+mouse+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric method to isolate round spermatids from mouse testis.</a> Hum. Reprod. 14 (2), 388-394 (1999).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תאי זרע ראשוניים תמיד היו מאתגרים ללמוד בהתחשב במורכבות של אפיתל seminiferous, כמו גם ההצלחה המוגבלת של תרבות במבחנה. במהלך השנים, גישות רבות כדי לטהר תאי נבט ממינים שונים פותחו. טכניקות שקיעה באמצעות טיהור הכבידה עם Percoll או הדרגתיים אלבומין בסרום שור בדרך כלל מספקות תשואה טובה של תאים נבטי שלמים, אבל חוסר הגדרה ראויה בין כמה סוגי תאים כמו תאי tetraploid meiotic וspermatids 10. יתר על כן, טכניקות אלה דורשים מכשירים מיוחדים (לעתים קרובות תוצרת בית), שעשויה לא...

זרעונים עגולים הפלואידים מתמיינים לזרעונים בתהליך הנקרא spermiogenesis. זה כרוך בשלבים רבים ושונים כולל רכישת דגל, שיפוץ כרומטין ושלד ציטו, עיבוי הגרעין וכן אובדן רוב הציטופלזמה. אירועים תאיים ייחודיים אלה חייבים להיות מווסתים היטב על מנת לייצר גמט פונקציונלי בוגר עם גנום שלם המתאים להפריה. בקושי ניתן לחקור את הזרע במבחנה מכיוון שאף מערכת תרבית תאים אמינה לא הצליחה עד כה לתמוך בהתקדמות בשלבים השונים של התהליך. יתר על כן, טכניקות מבחנה בפועל מובילות לתשואה גרועה1,2. in vivo, מעברים נכונים דרך השלבים השונים של הזרע הם חיוניים לשלמות התפקודית הטבעית של הגמט הגברי. טיהור מוצלח של זרעונים על פי שלבי ההתמיינות שלהם מעולם לא הושג ברמת העשרה מספקת כדי לאפשר אפיון מולקולרי של הזרע. לדוגמה, טיהור שלבי המפתח של התמיינות הזרע יהיה שימושי במיוחד לחקר האקרוזום המתפתח, היווצרות האמצע3, דינמיקת צומת התאים4, דינמיקת RNA5, תהליך שיפוץ כרומטין6,7 או יציבות גנומית8. טיהור הזרעונים נפגע על ידי השינוי המורפולוגי המתקדם שלהם, היעדר סמנים ביולוגיים חיצוניים ספציפיים לשלב וצורתם וגודלם הייחודיים. 
למרות שרוב תאי הנבט הזכריים מציגים קשר ישיר בין צביעת DNA לפלואידיה (תכולת DNA), שמנו לב שמתאם חיובי כזה אינו ישים עוד לזרעונים. זה נובע מהתצפית המוקדמת שלנו כי קטעי צינוריות זרע מראים עוצמה משתנה של צביעת DNA לאורך שלבי הזרע השונים. למרות שצביעת ה-DNA עולה בקנה אחד עם מערך הכרומוזומים הפלואידים שלהם משלבי הזרע 1 עד 7 (זרעונים עגולים), ראינו עלייה חדה בעוצמת הקרינה עם DAPI או SYTO 16 סביב תחילת הארגון מחדש הגרעיני ועיצוב מחדש של כרומטין (שלב 8 של זרע) שהגיעו לשיא בתחילת העיבוי הגרעיני (שלבי הזרע 11-12). לאחר עיבוי הגרעין, עוצמת צביעת ה-DNA פוחתת עד לזרע (שלב 16 של זרע). שיערנו שזה ככל הנראה קשור להיווצרות המעבר הייחודי שלהם למבנה הכרומטין שבו היסטונים מוחלפים בפרוטמינים. לכן פיתחנו שיטת זרימה ציטומטרית אמינה המאפשרת הפרדת זרעונים באמצעות וריאציה של עוצמת ה-DNA של זרעונים כפרמטר בחירה עיקרי.
מתוארת גישה פשוטה להפרדת זרעי עכבר עם טוהר גבוה (95-100%) על סמך תכולת ה-DNA לכאורה שלהם (צביעת SYTO16), גודל וגרעיניות. הזרעונים מופרדים לארבע אוכלוסיות; שלבים 1-9, 10-12, 13-14 ו-15-16. זרעונים מטוהרים מתאימים לניתוח גנטי/גנומי, כמו גם ליישומים פרוטאומיים כמתואר בפרסום שפורסם לאחרונה מקבוצה9 שלנו.

<table><tbody><tr><td>Isoflurane</td><td>ABBOT</td><td>05260-05</td><td>להרדמת עכבר לפני המתת חסד</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Wisent</td><td>90150</td><td>לציפוי צינור</td></tr><tr><td>1x PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>BioShop</td><td>EDT</td><td>להכנת מאגר מיון</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H</td><td>להכנת מאגר מיון</td></tr><tr><td>100% אתנול</td><td>Les alcools de commerce</td><td>092-09-11N</td><td>לקיבוע תאים</td></tr><tr><td>SYTO 16</td><td>Life Technologies</td><td>S7578</td><td>מכתים DNA</td></tr><tr><td>5 מ"ל פוליפרופילן צינורות תחתונים עגולים</td><td>BD Falcon</td><td>352063</td><td>אוסף תאים ממוינים</td></tr><tr><td>15 מ"ל צינורות תחתונים חרוטיים מפוליפרופילן</td><td>PROgene</td><td>1500</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל צינורות תחתונים חרוטיים מפוליפרופילן</td><td>PROgene</td><td>5000</td><td></td></tr><tr><td>וופורייזר הרדמה TEC4</td><td>Ohmeda</td><td>1160526</td><td>להמתת חסד</td></tr><tr><td>של עכבר CO2 מיכל גז</td><td>Praxair</td><td>C799117902</td><td>להמתת חסד של עכבר</td></tr><tr><td>O2 מיכל גז</td><td>Praxair</td><td>O254130501</td><td>להמתת חסד של</td></tr><tr><td>עכבר תא גז</td><td></td><td></td> עכבר תוצרת בית <td>להמתת חסד של עכבר</td></tr><tr><td>40 ומיקרו; מסננת תאי פלקון</td><td>m Corning Incorporated</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>50 &mu; m מסנני קו דגימה</td><td>BD Biosciences</td><td>649049</td><td></td></tr><tr><td>מערבל מערבולת</td><td>Labnet International, inc.</td><td>S0200</td><td>לקיבוע תאים</td></tr><tr><td>צנטריפוגה דינאק</td><td>קליי אדמס</td><td>101</td><td></td></tr><tr><td>Celltrics 50 ומיקרו; m מסננים</td><td>Partec</td><td>04-004-2327</td><td></td></tr><tr><td>488 ננומטר מיישן תאים בלייזר</td><td>BD Biosciences</td><td>FACSAria III</td><td></td></tr><tr><td>Accudop חרוזים פלואורסצנטיים</td><td>BD Biosciences</td><td>345249</td><td></td></tr><tr><td>מאגר מיון: 1x PBS, 1 מ"מ EDTA pH 8.0, 25 מ"מ HEPES pH 7.0, 1% FBS</td><td></td><td></td><td>FBS מושבת בחום. הכינו תמיסה טרייה, 0.22 &mu; מ 'מסונן ושומר על 4 מעלות צלזיוס.</td></tr></tbody></table>

שלב מסוים מיון של spermatids העכבר על ידי cytometry הזרימה

Step-specific Sorting of Mouse Spermatids by Flow Cytometry

הבידול של spermatids העכבר הוא תהליך קריטי אחד לייצור תא מין זכרי פונקציונלי עם הגנום שלם כדי להיות מועבר לדור הבא. עד כה, מחקרים מולקולריים של מעבר מורפולוגיים זה כבר הקשו על ידי חוסר שיטה המאפשרת הפרדה נאותה של צעדים החשובים אלה של בידול spermatid לניתוחים שלאחר מכן. הניסיונות קודמים בgating התקין של תאים אלה באמצעות cytometry זרימה ייתכן שהיו קשים בגלל עלייה מוזרה בקרינת ה- DNA בspermatids עובר שיפוץ הכרומטין. המבוססים על התבוננות זו, אנו מספקים פרטים של זרימה פשוטה cytometry תכנית, המאפשרים טיהור שחזור של ארבע אוכלוסיות של spermatids עכבר קבוע עם אתנול, המייצג כל מדינה אחרת בתהליך שיפוץ הגרעיני. העשרת אוכלוסייה אישרה באמצעות סמני צעד ספציפי וקריטריונים מורפולוגיים. Spermatids המטוהר יכול לשמש להגנומי וproteomIC ניתוחים.

אסטרטגית gating שימוש עם cytometry הזרימה איור 1 מייצג את אסטרטגית gating המשמשת בcytometry הזרימה למיין ארבע אוכלוסיות spermatid טהורות ביותר. בקצרה, תאים עם מכתים DNA חיובי (אלקסה פלואוריד 488-A) נבחר ראשון עם שער 1. Spermatids מspermiogenesis מרתיע 1-12 נבחרים (שער 2) על מגרש נקודה מראה granulosity (SSC-) לעומת גודל (FSC -A) מהש...

אנו מתארים אסטרטגיית מיון עבור זרעונים של עכברים באמצעות זרימה ציטומטרית. הזרעונים ממוינים לארבע אוכלוסיות טהורות ביותר, כולל עגולות (שלבי זרע 1-9), התארכות מוקדמת (שלבי זרע 10-12), התארכות מאוחרת (שלבי זרע 13-14) וזרעונים מוארכים (שלבי זרע 15-16). צביעת DNA, גודל וגרגיריות משמשים כפרמטרים לבחירה.

שלב מסוים מיון של Spermatids העכבר על ידי cytometry הזרימה

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to ...

המטרה הכללית של הליך זה היא להפריד ספרמטידים של עכבר לארבע אוכלוסיות נפרדות, ובכך לאפשר מחקר מולקולרי של הספרמיוגנזה. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הרבייה, כגון מהי ההשפעה של עיצוב הכרומטין על השלמות הגנומית. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת הפרדה של תאי זרע לאוכלוסיות תאים טהורות ללא זיהום צולב.הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כאשר הבחנו בשונות משמעותית בעוצמת צביעת ה-DN במהלך עיצוב מחדש של כרומטין בפרמטרים של haplo ביום שלפני מיון התאים. הוסיפו 1 עד 2 מיליליטר של FBS שעבר אינאקטיבציה חומית לשפורי פוליפרופילן בעגול תחתית בנפח של חמישה מיליליטר, ולשפורי פוליפרופילן קוניים בנפח של 15 ו-50 מיליליטר. לאחר מכן, בצעו ציפוי איטי של השפורים על ידי היפוך למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס על גבי רוטטור, ביום למחרת.שפוך בזהירות את ה-FBS באמצעות פיפט P 200 כדי להסיר כל שארית FBS מהמבחנות בנפח 15 ו-50 מיליליטר, והשאר נפח שארית קטן של 100 עד 200 מיקרוליטר של FBS במבחנות בנפח חמישה מיליליטר לצורך איסוף התאים המזוהים ביום המיון התאי. קצץ את חתיכות הבדיקה העטופות ב-500 מיקרוליטר של בופר מיון. לאחר מכן, העבר את חלקי הרקמה למבחנה בנפח 1.5 מיליליטר באמצעות טיפ של מיקרו-פיפט קצוץ.שטפו את תאי הנבט מהפתלים המבצעים על ידי פיפוט עדין למעלה ולמטה, ולאחר מכן שטיפה באמצעות טיפ שלם. לאחר מכן, השתמשו במסננת תאים של 40 micron כדי להסיר שיירי תאים וגושים, תוךما איסוף התסננת לנבובת קונית של 50 milliliter מצופה ב-FBS. שטפו את המסנן פעם אחת עם באפר מיון עד לנפח כולל של שלושה milliliters, והעבירו את התסננת לנבובת קונית של 15 milliliter מצופה ב-FBS.לאחר מכן, הוסיפו לתאים 16 µL של EDTA לכל מיליליטר של תגלי התאים, והשתמשו בפיפט של 10 mL כדי לקבע לאט את התאים במשך דקה אחת באמצעות שלושה נפחים של 100% ethanol קר מהקרח תוך כדי ערבוב חלש ב-vortex; התגלי יהפוך לחלבי לאחר הקיבוע. הדגרירו את התאים על קרח למשך 15 דקות עם היפוך מדי פעם. לאחר מכן, צנטריפוגו את תגלי התאים, השעיו מחדש את המשקע ב-2 mL של sorting buffer וצבעו את תאי הנבט עם 4 µL של cyto 16 DNAD מיד לפני המיון.סננו את התאים דרך מסנן של 50 micron אל תוך מבחנה מסוג fax מצופה ב-FBS, ושטפו את המסנן ביסודיות עם 1 עד 2 milliliters של תמיפת מיון (sorting buffer). העמיסו את תאי הנבט המקובעים לממיין תאים המצויד בלייזר של 488 nanometer. לאחר מכן, הציגו את סך האירועים באמצעות היסטוגרמה המייצגת את מספר האירועים לעומת שטח ה-Alexa floor 4 88, ובצעו gating לתאים עם צביעת DNA חיובית.לאחר מכן, הצג את התאים משער זה בגרף של פיזור צדי (side scatter area) מול פיזור קדמי (forward scatter area) ובצע סינון (gate). עבור התאים שסומנו, הצג את התאים המסוננים הללו בגרף של פיזור קדמי מול שטח פלואורסצנציה של Alexa Fluor 488, ובצע סינון. שוב, הצג את התאים המסוננים הללו בגרפים נפרדים של רוחב (width) של Alexa Fluor 488 מול שטח (area) של Alexa Fluor 488.שלבי הספרמיוגנזה (Spermiogenesis) מאחד עד תשע ומעשר עד שתים-עשרה. ניתן להגדיר אזורי בחירה (gating) לספרמטידים לצורך מיון, כדי לאסוף את שלבים 13 עד 14 ו-15 עד 16. תצוגת הספרמטידים מראה את התאים מהשער הראשון באזור של פיזור קדימה (forward scatter) מול תרשים שטחים של EXOR 4 88 והגדרת שער.אוכלוסיות התאים כפי שצוין. לאחר מכן, הצג את השערים הללו בגרפים נפרדים של Alexa Fluor 488 width מול Alexa Fluor 488 area ובצע סינון (gate).שלבים 13 עד 14 ו-15 עד 16 מיועדים למיון תאי זרה. לבסוף, אספו את הפראקציות המופרקות לתוך 100 עד 200 µL של FBS, במבחנות בעלות תחתית עגולה בנפח 5 מ"ל מצופות FBS, על קרח. בתמונות אלו מוצגת צביעת DAPI של אוכלוסיות תאי זרה שעברו מיון באמצעות זרימה.בשלבים אחד עד תשע של הספרמיוגנזה (spermiogenesis), ספירמטידים מציגים בדרך כלל גרעינים עגולים הנראים כתבנית אובלית. ספירמטידים בשלב תשע, ואלו הנצפים בשלבים 10 עד 12, נראים כווייים מוארכים. ספירמטידים בשלבי ספרמיוגנזה 13 עד 14 ובשלבים 15 עד 16 מציגים גרעינים בעלי צורה דומה, אך עם עצימות צביעה שונה מעט של ה-DNA, מה שמאפשר לזהות אוכלוסיות ספירמטידים נפרדות אלו במהלך המיון שלהן באמצעות ציטומטריית זרימה.בעקביה אחר הפרוטוקול המוצג, ניתן לצפות שטוהרן של אוכלוסיות ה-S הבודדות שנבדקו יהיה בין 95 ל-100%. ניתן להשלים טכניקה זו תוך שש עד שמונה שעות, בתנאי שכל שלב יבוצע כראוי. יש לזכור להשאיר את התאים תמיד על קרח לאורך כל ההליך. על ידי ביצוע הליך זה ניתן להשיג אוכלוסיות נפרדות של תאי זרע, המספקות כמות מספקת של חומר לניתוח מולקולרי, כגון אפיון תהליך הרימודורמינג הדרמטי או חקר ההשפעה הגנטית של מעבר זה.

step-specific-sorting-of-mouse-spermatids-by-flow-cytometry

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

שיטה יעילה להשגת מטוהרים שברים meiotic קיימא מהעכבר testis מתואר, המשלבת תא מעודן דיסוציאציה פרוטוקול עם מיון פלורסנט התא הפעיל (FACS). שיטה זו מנצלת את ההבדלים בתוכן דנ"א צפיפות גרעינית של שברים meiotic בדידים.

Cytometry זרימה טיהור תאים עכבר meiotic

פרוטוקול חדש להכנה מכאנית של השעיות אשכים סלולריים מחומר מכרסם, הימנעות אנזימים וחומרי ניקוי, מתואר. השיטה היא מאוד פשוטה, מהירה, לשחזור, והופכת השעיות תא באיכות טובות, אשר מתאימות למיון זרימה ומיצוי RNA.

טכניקה פשוטה ויעילה להכנת השעיות תא אשכים

שיטת STA-PUT מאפשרת הפרדה של אוכלוסיות שונות של תאי spermatogenic בהתבסס על גודל וצפיפות.

הפרדה של סוגי תאי Spermatogenic שימוש בשקיעה מהירות STA-PUT

מיוזה הוא תהליך התפתחותי שבו נוצרות גמטות דרך סבב אחד של שכפול ה-DNA, שני סיבובים רצופים של כרומוזום סגרגציה. מיוזה יונקים יכולים להיבדק על ידי ניצול טכניקה כדי להכין ממרחים כרומוזום meiotic. . הנה, נדגים שיטה של הכנת השטח-התפשטות גרעינים של העכבר spermatocytes.

הכנה של כרומוזום Meiotic מתפשטת העכבר Spermatocytes

עבודה זו מתארת ​​את סטנדרטיזציה של שיטה להשיג אוכלוסיות תאים נבט מטופלים מרקמת האשכים של מינים שונים של יונקים. זהו פרוטוקול פשוט המשלב דיסוציאציה פשוטה מכנית, מכתים עם Hoechst-33342 ו propidium iodide, ו FACS מיון, עם יישומים רחב במחקרים השוואתיים של ביולוגיה הרבייה הגברית.

גישה סטנדרטית עבור multispecies טיהור תאים יונקים זכר יונקים על ידי דיסוציאציה רקמות מכנית זרימת cytometry

מטרת טכניקה זו סקווש צנורית הוא להעריך במהירות תכונות cytological של פיתוח העכבר spermatocytes תוך שמירה על תקינות הסלולר. שיטה זו מאפשרת הלימוד בכל שלבי יצירת זרע, ניתן ליישם בקלות לצד הביוכימי והמולקולרי ביולוגי גישות אחרות לצורך המחקר של העכבר מיוזה.

טכניקה סקווש צנורית וכמה לניתוח Cytological של יצירת זרע שימוש במודל עכבר

מוצג כאן הוא פרוטוקול עבור העשרת החומר העשיר pachytene, עגול spermatocytes, ו להאריך spermatocytes מתוך האשכים עכבר למבוגרים באמצעות סרום מתמשך פרה אלבומין הדרגתי עם מעבדה סטנדרטית ציוד.

העשרה של פכיטנא ספרציטים וספרטידים מאשכים עכבר באמצעות ציוד מעבדה סטנדרטית

כאן אנו מציגים שיטה פשוטה ויעילה לבודד תאי חיידקים מיוטיים ופוסט-מיוטיים חיים מערכי עכבר בוגרים. באמצעות ציטוקסיות נמוכה, צבע מחייב DNA סגול-נרגש ומיון תאים המופעלים על-ידי פלואורסצנה, ניתן לבודד אוכלוסיות תאי זרע מועשרים מאוד עבור יישומים רבים במורד הזרם.

בידוד של תאי זרע מורין באמצעות צבע מחייב DNA סגול-נרגש תא חרוש

מאמר זה מדווח על עיכוב in vivo של CENP-E באמצעות ניתוח בטן והזרקת GSK923295 באשכים, מודל רב ערך לחלוקה מיוטית גברית. באמצעות בדיקות אימונופלואורסצנטיות, ציטומטריית זרימה ומיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת, אנו מראים כי עיכוב CENP-E גורם לחוסר תיאום כרומוזומים וחוסר יציבות גנומית בזרעונים של עכברים.

הערכה תפקודית של קינזין-7 CENP-E בזרעונים באמצעות עיכוב Vivo , אימונופלואורסנציה וציטומטריית זרימה

כאן, אנו מציגים שיטה לביצוע הזרקת זרע עגולה (ROSI) בעכברים, טכניקה עם יישומים קליניים מבטיחים ותועלת לחקר המנגנונים העומדים בבסיס התפתחות עוברית.

הזרקת זרע עגולה לעכבר

למד שיטת מיון ספרמטידים בעכבר באמצעות ציטומטריית זרימה לחקר מולקולרי של ספרמיוגנזה. השיטה מפרידה לארבע אוכלוסיות נפרדות ללא זיהום צולב ומאפשרת ניתוח של תהליכי עיצוב כרומטין ושלמות גנומית.

שלב מסוים מיון של Spermatids העכבר על ידי cytometry הזרימה

גלה סרטונים נוספים