שלב מסוים מיון של Spermatids העכבר על ידי cytometry הזרימה

המטרה הכוללת של הליך זה היא להפריד את הזרעונים של העכברים לארבע אוכלוסיות נפרדות, מה שמאפשר מחקר מולקולרי של זרע. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום רביית המראה, כגון מהי ההשפעה של מודלים כרומטיים על שלמות הגנום. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מספקת הפרדת זרע לאוכלוסיית תאים טהורים ללא זיהום צולב.

הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כאשר צפינו בשינויים חשובים בעוצמת צביעת ה-DNA במהלך שיפוץ כרומטין בפרמטרים של האפלו ביום שלפני מיון התאים. הוסף אחד עד שניים מיליליטר FBS מושבת חום לתחתית עגולה של חמישה מיליליטר פוליפרופילן, וצינורות חרוטיים מפוליפרופילן של 15 ו-50 מיליליטר. לאחר מכן, צפו לאט את הצינורות בהיפוך לילה בארבע מעלות צלזיוס על מסובב למחרת.

שפכו בזהירות את ה-FBS באמצעות פיפטה P 200 כדי להסיר כל שאריות FBS מהצינורות של 15 ו-50 מיליליטר והשאירו נפח שיורי קטן של 100 עד 200 מיקרוליטר של FBS בצינורות של חמישה מיליליטר לאיסוף התאים המטוהרים ביום התא. מיון, טוחנים את חלקי הבדיקה העטופים ב-500 מיקרוליטר של מאגר מיון. לאחר מכן העבירו את שברי הרקמה לצינור של 1.5 מיליליטר באמצעות קצה מיקרו פיפטה קטום.

שטפו את תאי הנבט מצינורות הזרע עם פיפטינג עדין למעלה ולמטה, ולאחר מכן שטיפה עם קצה שלם. לאחר מכן, השתמש במסננת תאים של 40 מיקרון כדי להסיר את הפסולת והגושים שאוספים את המסנן בצינור חרוטי מצופה FBS של 50 מיליליטר. שטפו את המסנן פעם אחת עם מאגר מיון עד לנפח כולל של שלושה מיליליטר והעבירו את המסנן לצינור חרוטי מצופה FBS של 15 מיליליטר.

לאחר מכן הוסף לתאים 16 מיקרוליטר של EDTA למיליליטר של תרחיף תאים והשתמש בפיפטה של 10 מיליליטר כדי לתקן לאט את התאים במשך דקה אחת עם שלושה נפחים של קרח קר, 100% אתנול תוך מערבולת במהירות נמוכה, המתלה יהפוך לחלבי לאחר הקיבוע. דגרו את התאים על הקרח למשך 15 דקות עם היפוך מדי פעם. לאחר מכן צנטריפוגה את תרחיף התא, השעו מחדש את המשטח בשני מיליליטר של מאגר מיון וצבעו את תאי הנבט בארבעה מיקרוליטרים של cyto 16 DNAD מיד לפני המיון.

סנן את התאים דרך מסנן 50 מיקרון לתוך צינור פקס מצופה FBS ושטוף את המסנן בהרחבה עם מיליליטר עד שניים של מאגר מיון. טען את תאי הנבט הקבועים על סדרן תאים המצויד בלייזר 488 ננומטר. לאחר מכן, הצג את סך האירועים עם היסטוגרמה המייצגת את מספר האירועים כנגד אזור רצפת Alexa 4 88 ושער את תאי צביעת ה-DNA החיוביים.

לאחר מכן הצג את התאים משער זה באזור פיזור צדדי כנגד חלקת אזור פיזור קדמית ושער. התאים כפי שצוין, מציגים את התאים המגודרים הללו באזור פיזור קדמי כנגד אזור, חלקה ושער של אלקסה בקומה 4 88. התאים מציגים שוב את השערים הללו ברוחב נפרד של אלקסה קומה 4 88 לעומת חלקות שטח של אלקסה בקומה 4 88.

הזרע משלב 1 עד 9 ו-10 עד 12. לאחר מכן ניתן לסגור את הזרעונים למיון כדי לאסוף את שלבים 13 עד 14 ו-15 עד 16. זרעונים מציגים את התאים מהשער הראשון לאזור פיזור קדימה כנגד חלקת שטח ושער EXOR 4 88.

אוכלוסיות התאים כפי שצוין. לאחר מכן הצג את השערים הללו באלקסה בודדת. קומה 4 88 רוחב מול אלכסה קומה 4 88 שטח מגרשים ושער.

השלבים 13 עד 14 ו-15 עד 16 זרעונים למיון. לבסוף, אסוף את השברים המטוהרים ב-100 עד 200 מיקרוליטר של FBS בצינורות תחתונים עגולים מצופים FBS בנפח חמישה מיליליטר על קרח. בתמונות אלה מוצג צביעה מטופשת של אוכלוסיות מוכות ממוינות בזרימה.

שלב הזרע אחד עד תשעה זרעונים מציג בדרך כלל גרעינים בצורת עגול שנראים בצורת אליפסה בזרע. שלב תשע זרעונים, ונצפים כקרסים מוארכים בשלבים 10 עד 12. שלבי הזרע של זרעונים 13 עד 14 ו-15 עד 16 זרעונים מציגים גרעינים בעלי צורה דומה, אך עם עוצמת צביעת DNA שונה במקצת, המאפשרת לזהות את אוכלוסיות הזרע המובחנות הללו במהלך מיונם על ידי ציטומטריית זרימה.

בעקבות הפרוטוקול המוכח, ניתן לצפות שהטוהר של אוכלוסיות ה-S הבודדות שנבדקו יהיה בין 95 ל-100% טכניקה זו יכולה להסתיים תוך שש עד שמונה שעות. אם כל שלב מתבצע כראוי. יש לזכור תמיד לשמור את התאים על הקרח לאורך כל ההליך על ידי ביצוע הליך זה עבור אוכלוסיות זרע נפרדות, המספקים כמות מספקת של חומר לניתוח מולקולרי, כגון אפיון תהליך השיפוץ הדרמטי או לחקור את ההשפעה הגנטית של מעבר זה.