מדידת תגובות פיזיולוגיות של תסיסנית עצב סנסורי כדי ליפידים פרומונים שימוש סידן הדמיה חיה

המטרה הכוללת של הליך זה היא למדוד את התגובות הפיזיולוגיות של נוירונים טעמיים של דרוזופילה לפרומונים שומנים. ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לענות על שאלות מפתח בנוירוביולוגיה חושית כגון זיהוי הליגנדים לקולטני טעם יתומים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן ללמוד את התגובות של נוירונים טעמיים בודדים בחיה חיה שלמה.

לאחר הרדמת הזבוב, חבר אותו לכיסוי כיסוי של 0.17 מילימטר באמצעות טיפה קטנה מאוד של לק שקוף. חבר את צד הזבוב למגלשה באמצעות הטיפה כולה. לאחר מכן, תחת מיקרוסקופ מנתח, השתמש במכחול רטוב כדי להאריך את הרגל הקדמית של הזבוב.

לאחר מכן, בעזרת שתי רצועות סרט דקות מאוד, אבטח את מקטעי הטרסל הראשון והחמישי להחלקת הכיסוי. אם רוצים לדמות נוירונים על הפרובוסקיס, הנח רצועת סרט דקה נוספת מעל דוכן הפרובוסקיס כדי לחשוף את התווית. כעת, צור קיר קצר סביב הזבוב באמצעות עט PAP.

הניחו להרדמה להתפוגג למשך חצי שעה לפני ביצוע המדידות. עבור פרוטוקול זה, הכינו את הדילולים הדרושים של תמיסת ליגנד מלאי של מיליגרם אחד למיליליטר, באמצעות PBST. כדי להתחיל בהליך, שכבו 10 מיקרוליטר PBST על מקטעי הטרסל המאובטחים והחשופים.

זה מרטיב את הרגל ומונע ממנה לצאת מהמיקוד. לאחר מכן, התמקד בקטעים באמצעות מערכת אופטית שיכולה להשיג אות פלואורסצנטי טוב עם רזולוציית זמן מהירה כגון מיקרוסקופ קונפוקלי של דיסק מסתובב עם מצלמת sCMOS. אסוף שלוש ערימות Z קדם-גירוי של הנוירונים המעניינים במקטע הטרסל.

בדוגמה זו, התמונות מצולמות עם חשיפות של 200 אלפיות השנייה ושילוב של שניים על שניים על פני קטע של שישה מיקרון על חצי מיקרון כל שתי שניות. הקפד לייעל את עוצמת הלייזר כדי למזער את הלבנת הצילום תוך מתן יחס אות לרעש גבוה. כאן, לייזר 491 ננומטר 100 מילי-וואט מופעל בשידור של 30%.

האות חייב להיות ניתן לזיהוי לפני הגירוי אך לא להתקרב לרוויה. כעת, פיפטה 10 מיקרוליטר של תמיסת גירוי על הקטע הטרסל המעניין. בזמן הפיפטינג, היזהר מאוד להימנע מלגעת ברגל או בכל אחד מגופו של הזבוב או שהטרסי יזוז ממקומו.

לאחר מכן, רכשו מיד את התמונות הראשונות לאחר הגירוי והמשיכו לאסוף מספיק תמונות כדי לתעד את השינוי המקסימלי בפלואורסצנטיות. לצורך ניתוח, פתח סדרה של ערימות Z קונפוקליות באמצעות תוכנת ניתוח ועיבוד תמונה של פיג'י או ImageJ. בצע הקרנת עוצמת סכום של כל פרוסות ה-Z עבור כל אחת מנקודות הזמן.

כאן, יש שש פרוסות ו-120 נקודות זמן. ראשית, בחר באפשרות הערימה תחת תמונה ולאחר מכן בחר באפשרות הקרנת Z. הזן אחד עבור פרוסת ההתחלה וארבעה עבור פרוסת הסטופ.

לסוג ההטלה, הזן פרוסות סכום ובחר את כל מסגרות הזמן. כעת, הגדירו אזור עניין, או החזר ROI כגון גוף תא או הקרנה עצבית. השתמשו בכלי הבחירה ביד חופשית כדי לצייר סביב גבולות המבנה.

לאחר מכן, לחץ על תווית הניתוח ובחר באפשרות מנהל החזר ההשקעה תחת כלים. כמת את הקרינה של ההחזר על ההשקעה על ידי בחירה תחילה באפשרות המדידות המוגדרות בתפריט הניתוח. סמן את התיבות עבור צפיפות משולבת, שטח, ערך אפור ממוצע ומקסימלי ותווית.

לאחר מכן, בחר באפשרות עוד תחת תפריט מנהל החזר ההשקעה ובחר באפשרות הרב-מדידה. כעת, חשב את השינוי המקסימלי בקרינה עבור נקודת זמן t. כדי לכמת את הקרינה שלאחר הגירוי, מדוד את הצפיפות המשולבת של ההחזר על ההשקעה.

עבור t שווה לאפס, מדוד את הקרינה הקדם-גירוי מתמונות הקדם-גירוי של ה-ROI באותו אופן. ממוצע הערכים משלוש תמונות עבור t זה שווה לערך אפס. כדי לכמת את הקרינה ברקע, מדוד את הצפיפות המשולבת מאזור רקמה נטול נוירונים הניתנים לזיהוי בעל גודל וצורה זהים להחזר ההשקעה.

אסוף ערך רקע ייחודי עבור כל נקודת זמן. אינדיקטור הסידן GCamP בא לידי ביטוי באמצעות שני דפוסי ביטוי שונים של Gal4. כל תבנית מסמנת אוכלוסייה מובחנת של נוירונים ברגל הקדמית ותאי תמיכה שאינם עצביים.

עבור שני דפוסי הביטוי, נצפו תגובות ספציפיות לליגנד לפרומון הליפופילי CH503. השינוי היחסי בעוצמת הקרינה של אות GCamP גדל עם ריכוזים גבוהים יותר של CH503. באופן מוזר, מינון של חמישה ננוגרם של CH503 עשוי לדכא את התגובה העצבית.

התגובות שנמדדו של נוירוני Gr68a ו-ppk23 היו שונות. התגובה העצבית של נוירונים המסומנים עם הנהג Gr68a Gal4 הראתה דפוס טוניק ואילו נוירונים ppk23 הראו תגובה פאזית ותנודתית ברגל. בחרטום, נוירונים ppk23 הראו תגובה טונית מאוחרת מגוף התא ותגובה תנודתית מהקרנה אקסונלית.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד למדוד את התגובות הפיזיולוגיות של נוירונים טעמיים בודדים לפרומונים ליפידים וליגנדים הידרופוביים אחרים. טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה הכימו-סנסורית למדוד את התגובות של נוירונים טעמיים בודדים בדרוזופילה מלנוגסטר. באמצעות טכניקה זו, ניתן להשתיק או להפעיל את הפעילות העצבית באמצעות שיביר מבוקר טמפרטורה או טרנסגן TRiP a-one על ידי צימוד מיקרוסקופ הדיסק המסתובב לאינקובטור מבוקר טמפרטורה על הבמה.

לאחר שליטה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך חמש דקות, לא כולל הזמן שלוקח לזבוב להתאושש מההרדמה. בעת ביצוע שיטה זו, חשוב לתקן את הזבוב בחוזקה על החלקת הכיסוי מבלי לפגוע ברגלו הקדמית. בזמן ההדמיה, חשוב לרכוש תמונות ברגע שהרגל הקדמית מגורה בתמיסת פרומון.