גישה חדשה שמבטל טיפול לחקר תוקפנות והשפעת "לוזר" ב
30 בדצמבר 2015
במהלך זבוב פירות קרבות, דפוסי ההתנהגות שנצפו, להילחם דינמיקה, והלמידה וזיכרון הקשורים מושפעות תנאי ניסוי. הפרוטוקול המובא כאן מתאר הליך רומן שלגמרי מבטל טיפול בזבובים במהלך ניסויים. זה משפר את דינמיקת קרב ומאפשר היווצרות של תופעות "לוזר" חזקות.
המטרה הכללית של שיטה זו היא להציג את היווצרותם של אפקטי "מפסיד" ו"מנצח" ב-drosophila, melanin, gaster, על ידי ביטול הצורך בטיפול ידני בזבובים במהלך ההליך ההתנהגותי. מרבית מחקרי ההתנהגות בבעלי חיים שנערכים בסביבת מעבדה כוללים טיפול ידני בבעלי החיים. טיפול זה גורם בדרך כלל לעקה (stress) בבעלי החיים, ועקה עלולה להפריע למחקרי ההתנהגות שאתם מנסים לבצע; לכן, יש לשאוף לבטל את הטיפול המעקה בבעלי החיים.
פיתחנו תא חדש עבור מחקרי התוקפנות שלנו בזבובים, המבטל לחלוטין את הצורך בטיפול בבעלי החיים לפני, במהלך או אחרי הניסויים. בשימוש בתאים חדשים אלו, כל הפרמטרים ההתנהגותיים שמדדנו הוכחו כטובים יותר. באמצעות שיטה זו, אנו ממזערים את השונות ההתנהגותית בין הפרטים.
הפסקנו את הזמן הדרוש ליצירת קשרי דומיננטיות ברורים, והצלחנו להשריות מנטליות חזקות של מנצחים ומפסידים. תאיים אלו קלים לשימוש ויכולים לשמש למטרות מגוונות כדי לחקור התנהגויות שונות של זבוב הפירות. כדי להתחיל בניסוי, גדלו ושמרו את מאגרי הזבובים באינקובטור במחזור של 12 שעות אור וחושך, בטמפרטורה של 25 degrees Celsius ובלחות יחסית של 50%.
בשלב הבא, הכינו מבחנות בידוד על ידי חימום מזון זבובים טרי עד להמסתו. בעזרת פסטור-פיפט, העבירו כ-1.5 milliliters של מזון זבובים מומס למבחנות זכוכית ריקות ובדקו שהמזון התגבש בעזרת מכחול עדין. הוציאו בעדינות בובת זכר בשלב מאוחר ממבחנת המקור והניחו אותה בצד של מבחנה המכילה מזון שהוכן זה עתה.
סגרו את מבחנות הבידוד עם פקקי כותנה ואחסנו אותן באינקובטור. לאחר הבידוד, הזבובים מוכנים לצביעה. הרדימו את הזבוב באמצעות פחמן דו-חמצני, ולאחר מכן השתמשו בקיסם שיניים דק.
הניחו נקודה קטנה של צבע אקרילי על החזה והימנעו מצביעת הראש, הכנפיים, הבטן או הרגליים. הניחו לצבע להתייבש במשך כ-10 שניות והעבירו בעדינות את הזבובים בחזרה למבחנות הבידוד המקוריות שלהם. החזירו את מבחנות הבידוד לאינקובטור.
המשיכו בהכנת הציוד על ידי חימום מזון טרי לזבובים עד להמסה. השתמשו בפיפטה רחבה כדי להעביר 0.8 milliliters של מזון אל מכסה של מבחנה עם פקק הברגה, והמתינו לקירור המזון. לאחר שהמזון התקרר.
יש למרוח טיפה קטנה של משחת שמרים טרייה במרכז פני השטח של כוס המזון. יש לשטוף את המכשיר ואת תאי הלחימה הבודדים במים לפני כל שימוש ולייבש אותם בעזרת נייר סופג. לאחר מכן, יש למרוח טיפה של שפכטל (putty) על כוס המזון ולהניחה במרכזו של כל תא לחימה.
כסו את תאי הלחימה במכסה המכשיר. הניחו את המכשיר המכוסה תחת מקור אור והתקינו מצלמת וידאו מעל המבנה. התחילו בניסויים ההתנהגותיים על ידי החדרת מחיצות פלסטיק לכל תא לחימה.
הסר את פקק הכותנה מנבובת הבידוד ומקם את הנבובת מתחת לפתח פתוח בצד המכשיר. אפשר לזבוב להיכנס לתא הלחימה באמצעות ציר גאו שלילי. לאחר מכן, סגור את הדופן הנחלקת. לאחר שהזבוב נכנס לתא, חזור על הפעולה כדי להכניס את הזבוב השני לתא הלחימה מהצד השני של המכשיר.
בשלב הבא, החזירו את המערך לעמדת צילום הווידאו המוארת. התחילו בהקלטת הווידאו והסירו את המחיצה מפלסטיק כדי לאפשר לזבובים לתקשר עבור ניסויי אפקט המפסיד (loser effect). הקליטו את הקרבות הראשונים במשך 20 דקות כדי להבטיח יצירה של יחסי דומיננטיות חזקים.
לאחר 20 דקות, החזירו בעדינות את המחיצה מפלסטיק לתוך תאי הלחימה כדי להפריד בין הזבובים והפסיקו את تسجيل הוידאו. כדי להשרות מנטליות חזקה של מפסיד, ודאו שהזבובים מבססים ושומרים על יחסי דומיננטיות במהלך הלחימה הראשונה, ולאחר מכן מזעזעו ככל הניתן את בעלי החיים בעת הכנסת המחיצות להפרדת הזבובים. לאחר תקופת מנוחה של 10 דקות, התחילו בהקלטה והסירו בעדינות את המחיצה מפלסטיק.
השאירו את הזבובים לאינטראקציה למשך 20 דקות נוספות. הפסיקו את ההקלטה לאחר 20 דקות כדי לסכם את הניסוי. הוציאו את הזבובים מתאי ההתנהגות באמצעות ציר גיאוגרפי שלילי, על ידי ביצוע הפוך של הפרוצדורה שתוארה לפני השימוש בשיטה החדשה לצפייה בקרבות הראשונים.
בממוצע, המפגש הראשון נצפה לאחר שתי דקות. הזינוק הראשון מתרחש לאחר ארבע דקות, והזבובים מבססים מערכת יחסי דומיננטיות לאחר שמונה דקות. במהלך 12 הדקות הנותרות, מערכת יחסי הדומיננטיות מתחזקת.
ככל שהמנצחים תוקפים יותר ויותר והמפסידים נסוגים יותר ויותר. הגישה החדשה שימשה לכימות "אפקט המפסיד" – אחוז המפסידים המפסידים קרבות שניים במהלך קרבות אלו. השפעה משמעותית נצפתה כאשר מפסידים קודמים הוצמדו למנצחים מוכרים או למנצחים שאינם מוכרים בקרבות השנייה שלהם.
בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לבצע את בדיקת התוקפנות באמצעות זבובים זכרים בני שישה עד שבעה ימים שגודלו בבידוד חברתי. לאחר השליטה בטכניקה, תאים אלו מאפשרים הכנסה, ניטור, אינטראקציות והפרדה קלה של הזבובים ללא כל טיפול ידני, דבר המשרה אפקט מפסיד (loser effect) חזק. השימוש במחיצות להפרדת הזבובים לאחר הקרב הראשון מאפשר גיוון בפרוטוקול הניסויי.
ניתן לשמור את המנצחים ולהצמידם ליריבים שונים בקרב השני כדי להשרות "אפקט מנצח" (winner effect). באמצעות התאמות קטנות, ניתן להשתמש באותם תאי בידוד כדי לחקור התנהגות חיזור, לוקומוציה והתנהגויות חברתיות אחרות של זבוב הפירות. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן ביצוע בדיקות תוקפנות וכיצד להשרות "אפקט מפסיד" (loser effect) ללא מניפולציה של הזבובים לפני ובמהלך הניסויים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג שיטה חדשנית לבדיקת תוקפנות בזבובי פירות על ידי ביטול הצורך בטיפול ידני, מה שמפחית את רמת הלחץ ומשפר את התוצאות ההתנהגותיות. עיצוב התא החדש משפר את המהימנות של מדידת אפקטי המנצח והמפסיד ב-Drosophila melanogaster.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה התנהגותית
- התנהגות בעלי חיים
רקע
- טיפול בבעלי חיים עלול לגרום למצבי סטרס, המשפיעים על מחקרי התנהגות.
- שיטות מסורתיות כוללות לרוב טיפול ידני, דבר המוביל לשונות בתוצאות.
- הבנת התוקפנות ב-Drosophila יכולה לספק תובנות לגבי דינמיקה התנהגותית.
- ביטול הצורך בטיפול ידני עשוי להוביל להערכות התנהגותיות מדויקות יותר.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה הממזערת את רמת הסטרס בזבובים במהלך מחקרי תוקפנות.
- בחינת ההשפעות של הטיפול בדגימות על תוצאות התנהגותיות.
- שיפור המהימנות של מדידת התנהגויות הקשורות לתוקפנות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- פיתוח של תא חדש למחקרים על תוקפנות.
- ביטול הצורך בטיפול ידני לפני, במהלך ואחרי הניסויים.
- מדידה של פרמטרים התנהגותיים שונים ב-Drosophila.
- השוואת תוצאות עם שיטות טיפול ידני מסורתיות.
תוצאות עיקריות
- פרמטרים התנהגותיים הראו שיפור באמצעות השיטה החדשה.
- נצפתה שונות מופחתת בין פרטים.
- השפעות "מפסיד" (loser effects) חזקות יותר נרשמו בהיעדר טיפול ידני.
- הדינמיקה הכללית של הקרבות שופרה.
מסקנות
- עיצוב התא החדש מפחית ביעילות את רמות הלחץ בזבובים פירות.
- ביטול הצורך בטיפול ידני מוביל לנתוני התנהגות אמינים יותר.
- ניתן ליישם שיטה זו במחקרי התנהגות בעלי חיים נוספים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסגרת ניהולית
שיטה זו נותנת מענה לאתגר מרכזי במדעי העצבים ההתנהגותיים: מזעור משתנים מתערבים ניסויים הנובעים מטיפול בבעלי חיים. על ידי ביטול ההתערבות הידנית, הגישה משפרת את מהימנות הנתונים במחקרי שינויים התנהגותיים תלויי-ניסיון, כגון אפקטים של מפסידים ומנצחים. דבר זה תומך בתיקוף מדויק יותר של יעדים במסלולי גילוי נוירו-התנהגותיים, שבהם מדדים התנהגותיים מנחים השערות מכניסטיות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של השפעות גנטיות וסביבתיות על מסלולים הקשורים לתוקפנות, ללא משתפי גורם של סטרס הנגרם מטיפול ידני.
- ערך תפעולי: מפחית שונות התנהגותית בין פרטים, ובכך משפר את רגישות הבדיקה לזיהוי שינויים פנוטיפיים עדינים.
- ערך ניבוי: תומך בהפחתת סיכונים של מטרות המעורבות בלמידה, זיכרון והתנהגות חברתית, על ידי אספקת תוצרי התנהגות נקיים יותר.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מספק פלטפורמה סטנדרטית וניתנת לשחזור לכימות דינמיקת תוקפנות ויצירת היררכיה חברתית.
- ערך תפעולי: מאפשר תהליכי עבודה התואמים לסריקה בתפוקה גבוהה באמצעות הכנסה אוטומטית של זבובים על ידי geotaxis והפרדת תאים באמצעות מסיקים.
- מוכנות הבדיקה: מייצר פלטים כמותיים כגון זמן השהיה עד לקרב, תדירות הסתערויות ותזמון יחסי דומיננטיות עבור יישומים של סריקת תרכובות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות תרגומית: מאפשר מחקר של שינויים התנהגותיים הקשורים לניסיון, המדמים היבטים של הפרעות פסיכיאטריות הקשורות לתבוסה חברתית ותגובתיות למתח.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מאפשר בידוד של מעגלים עצביים ספציפיים או מסלולים מולקולריים התורמים להיווצרות "אפקט המפסיד" ללא רעש הנובע מטיפול ידני.
- המשכיות פרה-קלינית: תומך במעקב התנהגותי לאורך זמן על פני מספר סבבי לחימה כדי להעריך פלסטיות התנהגותית אדפטיבית או מילאדפטיבית.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
השיטה משתלבת בזרימות עבודה של שלבי גילוי מוקדמים, שבהן פנוטיפים התנהגותיים משמשים לתיקוף מטרות המשפיעות על תפקוד מעגלים עצביים ועל ויסות התנהגותי. היא מאפשרת ביצוע פנוטיפConsistent לפני המעבר למחקרי התערבות טיפולית או מנגנונית.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת השערות סביב גנים או תרופות המשפיעים על תוקפנות, זיכרון חברתי ונתיבי תגובה למעבדה.
- סריקה: מספקת מדדי התנהגות כמותיים וניתנים לשחזור, החיוניים להשוואה בין תנאים גנטיים או פרמקולוגיים.
- אנליזה: מאפשרת מדידה של פרמטרים התנהגותיים זמניים (למשל, תחילת קרב, תדירות זינוקים, ביסוס דומיננטיות) לצורך הבנת קשרי מינון-תגובה או קורלציות גנוטיפ-פנוטיפ.
- מחקר תרגומי: מקשר למודלים פרה-קליניים על ידי לכידה של התנהגויות חברתיות רלוונטיות מבחינה אתולוגית, המשקפות מנגנונים שמורים של למידה ולחץ.
- שימוש חוזר ארגוני: עיצוב התא ניתן להתאמה להתנהגויות חברתיות אחרות של Drosophila, ובכך מגביר את התועלת במגוון תוכניות גילוי.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי במערכי בדיקה התנהגותיים על ידי הסרת הטיפול הידני כמשתנה מתערב.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות ואת יכולת ההרחבה באמצעות תהליכי עבודה סטנדרטיים ללא טיפול ידני.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשך התקדמות (go/no-go) באימות יעדים על ידי הפחתת תוצאות חיוביות כוזבות הנובעות מרעש התנהגותי מושרא על ידי סטרס.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מדויק יותר של יעדים בהתבסס על פנוטיפים התנהגותיים אמינים במערכות רלוונטיות למחלה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בגידול Drosophila, תצפית התנהגותית ופנוטיפיקה מבוססת וידאו.
- תלוי בגישה למערכות מעקב התנהגותי ובקרים סביבתיים (מחזורי אור/חושך, טמפרטורה, לחות).
- מחייב סטנדרטיזציה בין מעבדות עבור הגדרת התא, בידוד זבובים ותזמון של תקופות התנהגותיות.
- התאמה למערכות מודל אחרות עשויה לדרוש שינוי של מנגנוני כניסה המבוססים על geotaxis.
- מגבלות מעשיות כוללות הגבלות גודל של התא ותלות בניידות הזבובים לצורך טעינה עצמית לתוך הזירות.
