Name: בקרה בתיווך RNAi של aflatoxins בבוטנים: שיטה לניתוח ייצור mycotoxin וביטוי transgene בבוטנים / אספרגילוס Pathosystem (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: למד שיטה לניתוח ייצור aflatoxins בבוטנים תוך שימוש ב-RNAi נגד Aspergillus flavus. השיטה מאפשרת כימות יעיל עם פחות מחמישה זרעים במקום מאות גרמים, ומפחיתה 60-100% מהרעלן.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו קיבלה את התמיכה הכספית של פרויקט USDA-ARS CRIS 6604-21000-004-00D, פרויקט CRIS 6604-42000-008-00D, והסכם תוכנית Feed-the-Future של USAID מספר 58-0210-3-012. אנו מודים לואלרי אורנר, לטניה ג'ונסון, ג'וזף פאוול וקתי גריי על הסיוע הטכני שלהם. אזכור שמות מסחריים או מוצרים מסחריים במאמר זה נועד אך ורק למטרת מתן מידע ספציפי ואינו מרמז על המלצה או תמיכה של משרד החקלאות האמריקאי.

למחברים אין מה לחשוף או ניגודי אינטרסים.

בתיווך RNAi צמח-מארח השתקה של גנים בפטריית פתוגנים הודגמה 27,43, לעומת זאת, אין פרסומים המציגים את ההיתכנות של שליטה בתיווך RNAi של הצטברות mycotoxin בצמחים. גורם מגביל אחת עבור מחקרים אלה בבוטנים היה חוסר שיטה להעריך פנוטיפ הצטברות לא-אפלטוקסין בצמחים בודדים, כעלים לא מראים סימפטומים על זיהום פטרייתי של תרמילי מחתרת. בנוסף, ההצטברות לא-מתפלגת נורמלי של aflatoxins, ואת הצורך בדגימות גדולות לניתוח כימי 15,16 מנעו כימות של השפעה פוטנציאלית על RNAi צמח בודד. השיטה המוצגת כאן מורכבת של 72 ניסויי שעות באמצעות חמישה זרעים לבצע שלוש דגימות 24 שעות מרווח בשלושה עותקים (טבלת 1, איור 7). בהשוואה לניתוח אפלטוקסין הטיפוסי שדורש לא פחות מ -100 גרם של זרעים, השיטה שלנו היא מתאימה במיוחד לindividuaאירועים מהונדסים l של צמחי בוטנים שתחילה לייצר לא יותר משניים או שלושה תרמילים. השתקה בתיווך RNA של סינתזת אפלטוקסין הודגמה על ידי הפיכה גנטית flavus אספרגילוס וא parasiticus. מאז aflR הוא רגולטור ראשי של ייצור אפלטוקסין בא flavus וא parasiticus 44,45, הוא הופך להיות יעד מעניין להשתקה בתיווך RNA בצמחים. עם זאת, וריאציות גנטיות בaflR הוכחו בין מיני אספרגילוס 46, וריאנטים גנטיים אלה יכולים לברוח השתקה אם אין רצף מושלם התאמה עם אות RNAi מיוצרת במפעל המארח. לפיכך, aflR היה אחד מהיעדים להשתקה בp5XCAPD וקטור, אבל לא היה יחיד. חוזר הפוך של גן aflR הציג לא flavus וא parasiticus ידי שינוי הביא להשתקה ומינימלית או ללא מוצרהיון של aflatoxins 47 (מקדונלד et al., 2005b). כמו כן, גן aflD השתקה מנע ייצור אפלטוקסין בשיעור של עד 98% בא flavus וא parasiticus בשינוי ישיר 48. כדי להגדיל את ההסתברות להצלחה במערכת שלנו, בוטנים הפכו עם שברים חוזרים הפוכים של חמישה גנים המעורבים בייצור אפלטוקסין בא flavus. כאן הוא הראה כי שימוש בp5XCAPD שמכוון להשתקת מספר גנים במסלול סינתזת אפלטוקסין, 90% -100% רמות נמוכות יותר של אפלטוקסין B 1 ו- B 2 הושגו בקו 288-72, ורמות 60-100% נמוכים שנצברו ב קו 288-74 בהשוואה לשליטה, כאשר מחצית פסיגים היו מחוסן עם א &#39; flavus, איורים 4 7,. והכי חשוב, שיטה זו זוהתה הבדלים מובהקים סטטיסטי בהצטברות אפלטוקסין בקווים 288-72, 288-74 לעומת השליטה לאורך כל הניסוי על ידי יישום statis פרמטריתטיקים, איור 7. בהתחשב בגודל המדגם הקטן, חשוב להדגיש את הצורך בשימוש בשיטה רבת עוצמה לזיהוי aflatoxins, ניסויים אלה נותחו על ידי UPLC שבעל רזולוציה גבוהה, פי חמישה ביצועים גבוהים יותר ורגישות גבוהה פי שלושה מ HPLC 49. ביטוי של RNAi להוסיף ב288-74 התגלה רק בפסיגים בוגרים (צהובים) בשעה 24 דגירה. הכנס RNAi לא זוהה על ידי RT-PCR על פסיגים בוגרים של 288-74 ב 24 שעות, או על כל קבוצה בגרות ב 48 שעות, איור 6. אותו תופעה זו נצפתה בקווי בוטנים אחרים RNAi מהונדסים (אריאס, RS 2015 לא פורסם), שבו בדרך כלל תמלילי RNAi התגלו רק בפסיגים בוגרים ב 24 שעות. טופלו דגימות RNA עם DNAse לפני סינתזת cDNA, הנתונים היו מנורמלים לרמה של ביטוי אקטין ואין עדות לזיהום הדנ&quot;א נצפה. צריך DNA היה נוכח בדגימות, שהוא צריךזוהה בדגימות שעה 48 גם כן, אבל באופן עקבי כי לא היה המקרה. ביטוי תחת השליטה של ​​35S-האמרגן הוא לא תמיד אחיד; יכול להיות מושפע על ידי תנאים סביבתיים זה 50, סוג של רקמה ושלב ההתפתחותי 51,52. במקביל, במסלול של התערבות RNA, השיעור של mRNA ריקבון וקצב דעיכת siRNA יכולים להשתנות באופן משמעותי 53. ייתכן שהשפלה המהירה של mRNA על ידי המנגנון של התערבות RNA יכולה הייתה למנוע זיהוי mRNA ב 48 שעות דגירה. אם היעדרות של ביטוי בשעה 48 הייתה עקב שעתוק הנמוך 35S-אמרגן מונע, או להשפלה מהירה של dsRNA ידי דייסר נותר ענה. כך, זיהוי של RNA קטן על ידי רצף תפוקה גבוה היה נותן תובנה טובה יותר על התהליכים המתרחשים באמצעות RNAi 54 בניסויים אלה. עם זאת, מאז השתקת RNA מתפשטת מערכתית, בעיקר דרך השיפה מphotosyntשונא את המקורות לסוכרוז כיורים (במקרה זרעי בוטנים זה) 55, ההשתקה של אפלטוקסין-סינתזה יכולה להתרחש בזרעים ללא ביטוי מקומי של RNAi להוסיף. מחקרים רבים נותר לעשות כדי לקבוע את רמת הסף של RNA הקטן מפריע (siRNAs) הנחוץ כדי למנוע הצטברות אפלטוקסין בזרעים. חשוב להדגיש את העובדה ששניהם ביטוי mRNA, של RNAi לבנות (איור 6), והצטברות של aflatoxins B 1 ו- B 2 (איור 7) הראתה תוצאות שונות עבור בוגר (צהוב) לעומת. בוגרת פסיגים (חום). יש צמחי בוטנים צמיחה בלתי מוגדרת, כלומר, הם מציגים בקציר מגוון של תרמילים בגרות, איור 2. בנוסף, זרעים מקבוצות בגרות שונות נבדלים בהרכב הכימי שלהם, למשל., סוכרוז 2.4% בזרעים לא בשלה, ושל 1.9% ב זרעים בוגרים באותם 56,57 תנאי שדה. לכן, כדי להבין את efficienc בפועלy שליטה בתיווך RNA של הצטברות אפלטוקסין, חשוב לנתח קבוצות בגרות בנפרד. הגנה טבעית של זרעי בוטנים היא הייצור של phytoalexins, אשר משתנה במגוון של תרכובות המיוצרות והכמויות היחסית שלהם בהתאם לפדיון של הזרעים ותנאים סביבתיים 58-61, והוא גבוה במיוחד בהשוואה לעוברי פסיגים 62. עוברים יש גם ריכוזים גבוהים יותר באופן משמעותי של חומצות גרעין, שני DNA ו- RNA מהפסיגים (RS אריאס, לא פורסמו). כזרעי בוטנים בוגרים, שינויים בפיסיולוגיה שלהם והרכב כימי להתרחש 63. נוגדי חמצון פנול בטאנינים מרוכזים צורת testa בוטנים עם פעילות fungistatic 64; זה ניכר גם בצבע mesocarp המשקף שלבים בגרות, צהובים לשחור 35, כתוכנו של טאנינים ותרכובות פנוליות עולה עם בגרות 65. לפיכך, נוכחותם של לאesta או עוברים בניסוי, נתנו מאפייני מיקרוביאלית שלהם, יכול היה מוגבלים פטרייתי צמיחה ולכן בהערכת ההשפעה של השתקת RNAi, לכן, הם הוסרו. כמו כן, הסרת טסטה והעוברים מסייעת להגביל את המקורות שונים בניתוח, כמחצית טבורית שנושאת את העובר יהיה יותר ויותר תוכן phytoalexins RNA. בנוסף לניתוח על ידי קבוצות בגרות וההסרה של טסטה ועובר בניסויים אלה, חשוב להצביע על עוד כמה תצפיות: א) אם כי תוצאות מוצגות לעד 96 שעות דגירה, מומלץ שלא להשתמש יותר מ 72 שעות כדי להשיג תוצאות עקביות, כמו זרעים לקבל מושפלות על ידי 96 שעות; ב) ואילו מחצית פסיגים מאותו הזרע, אם כי דגמו באופן אקראי, אינם מהווים מדגמים בלתי תלויים לחלוטין, RT-PCR והצטברות אפלטוקסין באירועים מהונדסים הראו וריאציה מינימאלית בין זרעים. גם נבגי פטרייתי מדויקים, לספור, הבידוד נפחים של 2 μl, ויישום של נבגים על פני השטח החתך של הפסיגים הימנעות מטפטף על הצדדים חשובים לוודא הנבגים המונבטים נחשפים לרקמות הצמח. המים / אגר על הצלחות צריכים להיות בשיעור של 1.5% (w / v), אגר רך גורם נגר של נבגים כפי שמוצג במסגרת האחרונה של איור 4 (תחתון). צריך זרע זמינות מאירוע מהונדס מסוים להיות מוגבל, דגימה יכולה להיעשות בשני עותקים במקום תוצאות דומות בשלושה עותקים קבלת (כלומר, איור 7); עם זאת, בשלושה עותקים דגימות יסייעו להפחית את השגיאה סטנדרטית. המגבלה היחידה של שיטה זו היא שהיא דורשת מערכת רגישה מאוד (UPLC) לגילוי אפלטוקסין / כימות, אבל באותו הזמן זה מקטין את ההסתברות של הערכת יתר של השפעת RNAi צריך aflatoxins לא להיות מזוהה על ידי שיטות פחות רגישות. לסיכום, שיטה זו מציעה בפעם הראשונה בגישה אמינה ללמודהשפעה של RNAi בשליטה של ​​aflatoxins. צמצום הזמן לניסוי מעונת גידול כולו לפחות משבוע, בשיטה זו תהיה מאוד להאיץ את המחקר על RNAi-בוטנים / pathosystem Aspergillus להפחתה ו / או החיסול של aflatoxins.

כ -4.5 מליארד בני אדם חשופים באופן קבוע aflatoxins 1, החומרים המסרטנים החזקים ביותר הידועים בטבע 2. mycotoxins אלה לזהם 25% מיבולי המזון בעולם 3, כולל תירס, קסבה, אורז, אגוזים, דגנים ותבלינים. 4. Aflatoxins סיבת להטוטים בילדים 5, לפגוע במערכת החיסונית 6, נמצא ב58% מhepatocellular-קרצינומה בביופסיות אנושיות 7,8, ולהרוג מאות אנשים במהלך התפרצויות תקופתיות של aflatoxicosis 9,10. Aflatoxins הוא mycotoxins נגזר polyketide בדרך כלל מיוצרת על ידי flavus אספרגילוס וא parasiticus; aflatoxins B 1 ו- B 2 מיוצרים על ידי א &#39; flavus, ואילו א parasiticus גם מייצר G 1 וG 2. המבנה הכימי של תרכובות אלה וchromatogram מראה ההפרדה שלהם על ידי UPLC מוצג באיור 1. </strאונג&gt; <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53398/53398fig1.jpg" /> איור 1. aflatoxins וRNAi להכניס לראש:. מבנה כימי (משמאל) ודוגמא של chromatogram (מימין) של ארבעה aflatoxins נגזר polyketide הנפוץ ביותר: B 1, B 2, G 1 וG 2, המיוצר על ידי parasiticus אספרגילוס, . Flavus מייצר B 1 ו- B 2 תחתון: סכמטי של שברי גן בRNAi לבנות p5XCAPD משמש לשינוי בוטנים, מספרים תחת חצים מספרי הצטרפות גן-בר בגנום flavus אספרגילוס;. PIV2: אינטרון תפוחי אדמה; זוגות בסיסים;: BP RT_5X_1 וRT_5X_2:. אתרי פריימר PCR בזמן אמת <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53398/53398fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> הפסדים כלכליים ביצוא בשל aflatoxins בבוטנים לבד יעלו 450,000,000 $ דולר ארה&quot;ב אם מחושב על בסיס 4 ng. ז -1 מגבלה של אפלטוקסין מותר למאכל אדם באיחוד האירופי 11. Aflatoxins כבר ידוע במשך 60 שנים 12; עם זאת, למרות שרבים שיטות חקלאיות שפותחו כדי להקל את השפעתן, כולל יישום של זני פטריות אחרים 13,14, אין שיטה של שליטה עקבית קיימת, וזני צמחים עמידים אינם זמינים. germplasm מפעל בדיקות להתנגדות לaflatoxins הוא קשה במיוחד, משום שגם בתנאים תורמים לפלישת פתוגן, הצטברות mycotoxin היא בלתי צפויה ולא פעלה התפלגות נורמלית. כך, ניסויים דורשים בדרך כלל אזורי נטיעה גדולים, מאות זרעים ודוגמאות רבות של 100-1,700 גרם להפחתת שונות של 15,16 נתונים. התערבות RNA הייתהגילה בשנת 1998 17; ואת היתרונות של &quot;השתקה&quot; כרגע נבדקות במספר היישומים החדשים, לדוגמא., בטיפולים אנושיים נגד סרטן השד גרורתי 18, סרטן כבד 19, לוקמיה מיאלואידית 20, ובהגנת צומח נגד חרקים 21 ונמטודות 22. בצמחים, אותות התערבות RNA יכולים לנסוע תא לתא, עם RNA הקטן מפריע (siRNA) ו- RNA משקל המולקולרי הגבוה להיות אחראי לגן posttranscriptional המערכתי השתקת 23,24, אפילו בתוך פתוגנים פטרייתי שנמצאים בקשר הדוק עם מארח צמח 25. היעילות של RNAi בהשתקה בתיווך מפעל של גנים פטרייתי לפתוגן תוארה בכמה pathosystems צמח, לאלה, בדיקה חזותית של תסמינים בחלקי האוויר של צמחים (עלים) אפשרה כימות מחלה, כלומר, Bremia oomycete בחסה 26 , Puccinia בחיטה <sup&gt; 27 וFusarium בבננה 28. הרבה יותר קשה הוא להעריך את יעילות RNAi לשלוט mycotoxins בצמחים, במיוחד בaflatoxins בוטנים כעלים לא מראים סימפטומים של זיהום, האיברים פלשו (זרעים) נמצאים תחת כמה אינץ &#39;של אדמה, את המופע של זיהום הוא בלתי צפוי, ורק כימי ניתוח יכול לקבוע את הנוכחות של aflatoxins. בנוסף, כל אירוע מהונדס בבוטנים בדרך כלל מייצר כמה זרעים (4-6 לכל צמח); לכן, בדיקה מסורתית לתכונה לא-אפלטוקסין הצטברות בחלקות שדה גדולים, שנמשך עונות חיתוך כל, ובאמצעות מאות זרעים היא לא ריאלי. שיטה מתוארת כאן כדי לנתח בפחות משבוע, זרעי RNAi בוטנים לנוכחות של transgene ועבור תכונת הצטברות לא-אפלטוקסין, באמצעות כמה רק זרעים.

<table><tbody><tr><td>פריימרים, אוליגונוקלאוטידים</td><td>DNA טכנולוגיות, קורלוויל, IA, ארה"ב</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Dneasy Plant Mini Kit</td><td>Qiagen, ולנסיה, CA</td><td>69106</td><td></td></tr><tr><td>Czapek Dox אגר בינוני</td><td>אוקסואיד, מאת Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>CM0095</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>BP 1423</td><td></td></tr><tr><td>מקפיא -80&nbsp; &deg; C</td><td>n/</td><td>a n/a</td><td></td></tr><tr><td>תחמוצת אלומיניום, Al2O3</td><td>Fisher Scientific</td><td>A941</td><td></td></tr><tr><td>SPE Reservoirs 1.5 מ"ל</td><td>גרייס דייוויסון דיסקברי Scientific</td><td>210011</td><td></td></tr><tr><td>פריטס למאגר SPE 1.5 מ"ל</td><td>גרייס דייוויסון דיסקברי</td><td>211401</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקוני Autosampler</td> של <td>תאגיד ווטרס, מילפורד, מסצ'וסטס</td><td></td><td></td>186005221</tr><tr><td>מכשיר Waters Acquity Ultra-Performance Liquid-Chromatography (UPLC); מנהל ממס רבעוני מסוג UPLC-H; מנהל דוגמאות UPLC; גלאי פלואורסצנטי UPLC (FLR); UPLC BEH C18 2.1&nbsp; מ"מ x 50&nbsp; מ"מ, 1.7&nbsp; עמודת מ"מ</td><td>תאגיד ווטרס, מילפורד, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Finnigan LCQ Advantage MAX ספקטרומטר מסה של מלכודת יונים, עם תוכנת Xcalibur גרסה 1.4</td><td>Thermo Electron Corp., סן חוזה, קליפורניה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>תקני אפלטוקסין, B1, B2, G1 ו-G2</td><td>Sigma-Aldrich, סנט לואיס, מיזורי</td><td>A6636; A9887; A0138; A0263</td><td></td></tr><tr><td>Systat Software 12.2</td><td>SYSTAT Software Inc., פוינט ריצ'מונד, קליפורניה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מגיב Trizol</td><td>Invitrogen, CA</td><td>15596-018</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III First Strand Synthesis Super Mix</td><td>Invitrogen, CA</td><td>11752-050</td><td></td></tr><tr><td>ABI 7500 Real-Time</td><td>PCR Lifetechnologies, גרנד איילנד, ניו יורק</td><td>4406984</td><td></td></tr><tr><td>Luria Broth-Miller</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>R453642</td><td></td></tr><tr><td>pENTR1A</td><td>Invitrogen, CA</td><td>A10462</td><td></td></tr><tr><td>LR Clonase II תערובת אנזימים</td><td>Invitrogen, CA</td><td>11791-020</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>NEB Biolabs</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>ג'לריט</td><td>סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, MO</td><td>G1919</td><td></td></tr><tr><td>אצטוסירינגון</td><td>סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי</td><td>D134406</td><td></td></tr><tr><td>תחנת עבודה רובוטית QIAcube</td><td>Qiagen, ולנסיה, קליפורניה</td><td>9001292</td><td></td></tr><tr><td>אנטיביוטיקה: קנמיצין, צפוטקסים, גנטמיצין; סטרפטומיצין</td><td>גולדביו, סנט לואיס, מיזורי</td><td>cef.: C-104-25; kan: K-120-5; gent.: G-400-1; strep.: S-150-50</td><td></td></tr><tr><td>פלטינום Taq DNA פולימראז High Fidelity</td><td>Invitrogen, CA</td><td>11304-029</td><td></td></tr></tbody></table>

בקרה בתיווך rnai של aflatoxins בבוטנים: שיטה לניתוח ייצור mycotoxin וביטוי transgene בבוטנים /<em&gt; אספרגילוס</em&gt; pathosystem

RNAi-mediated Control of Aflatoxins in Peanut: Method to Analyze Mycotoxin Production and Transgene Expression in the Peanut/Aspergillus Pathosystem

ארגון המזון והחקלאות של האו&quot;ם מעריך כי 25% מיבולי המזון בעולם מזוהמים בaflatoxins. המייצג את מזון 100 מ&#39;טונות נהרסות או מופנות לצריכה שאינה בני אדם בכל שנה. Aflatoxins הם חומרים מסרטנים חזקים בדרך כלל שנצברו על ידי flavus פטריות אספרגילוס וparasiticus א בדגנים, אגוזים, גידולי שורש ומוצרים חקלאיים אחרים. השתקה של חמישה גני אפלטוקסין-סינתזה על ידי התערבות RNA (RNAi) בצמחי בוטנים הייתה משמשת לשליטה הצטברות אפלטוקסין הבאה חיסון עם א &#39; flavus. בעבר, לא הייתה קיימת שיטה לנתח את האפקטיביות של RNAi באירועים מהונדסים בוטנים בודדים, כמו אלה בדרך כלל לייצר כמה זרעים, ושיטות מסורתיות של ניסויי שדה גדולים בתנאי אפלטוקסין-תורם לא אופציה. בתחום, את ההסתברות למציאת זרעים מזוהמים באופן טבעי היא לעתים קרובות 1/100 ל1/1,000. בנוסף, זיהום אפלטוקסין לא מפוזר באופן אחיד. השיטה שלנו משתמשת בכמה זרעים מהונדס לאירוע, עם חתיכות קטנות מעובד בזמן אמת PCR (RT-PCR) או רצף RNA קטן, וניתוח של הצטברות אפלטוקסין ידי כרומטוגרפיה אולטרה ביצועים נוזלית (UPLC). קווי להביע RNAi בוטנים 288-72 ו288-74, הראו הפחתה של עד 100% (p≤0.01) באפלטוקסין B 1 ו- B 2 בהשוואה לשליטה שנצברה עד 14,000 ng. ז -1 של אפלטוקסין B 1 כאשר מחוסן עם א aflatoxigenic flavus. כהתייחסות, סך המרבי של aflatoxins המותר לצריכת אדם בארצות הברית הוא 20 ng g -1.. פרוטוקול זה מתאר את היישום של שליטה בתיווך RNAi של aflatoxins בזרעים מהונדסים בוטנים ושיטות להערכתה. אנו מאמינים כי יישומה בגידול של בוטנים וגידולים אחרים יביא התקדמות מהירה בתחום חשוב זה של מדע, רפואה ותזונת אדם, ויתרמו באופן משמעותי למאמץ הבינלאומי כדי לשלוט aflatoxins, וmycotoxins פוטנציאלית אחרת ביבולי מזון עיקריים.

פלסמיד p5XCAPD נעשה כנגזרת של pCAPD 29, והשתמש בו כדי להפוך את צמחי בוטנים; וקטור זה נושא חוזר הפוכה של חמישה שברים קטנים, 70-80 נ&quot;ב כל, של גני אפלטוקסין-סינתזה של א &#39; flavus מופרד על ידי אינטרון (איור 1). ברי AFL2G_07224 (aflR), AFL2G_07223 (aflS או aflJ), AFL2G_05027 (משאבת זרימת אפלטוקסין, aflep), AFL2G_07228 (aflC / pksA / pksL1), וAFL2G_07731 (pes1) שמשו למבנה, מספרים בלהתכתב איור 1 ל . ביאור הגנום flavus לאור מכון, Cambridge, MA, וספרות 42. סך של 99 קווי בוטנים היו מחדש לאחר שעובר את תהליך השינוי, 50 היו PCR חיובי לNPTII זוהה על ידי STN-PCR, ו -33 קווים היו זרעים חיוביים ומיוצרים PCR. רק שבעה קווים חיוביים PCR היו מופצים clonally ונבדקו על ידי presenשיטה לא להצטברות אפלטוקסין, כל שבע הראתה בין 60% ל- 100% פחות הצטברות אפלטוקסין מהשליטה. כאן אנו מראים תוצאות של שניים משבעת קווים אלה. אירועים מהונדסים בודדים בדרך כלל לייצר כמה זרעים, שיטה פותחה לשימוש במספר מינימאלי של זרעים ועדיין להיות מסוגל לעשות את הניתוח סטטיסטי פרמטרית. תרשים זרימה של הכנת המדגם והגדרת ניסוי מוצגת באיור 5 ולוח 1. למרות שהדור הראשון של זרעים מהונדסים הוא בדרך כלל hemizygous, צפוי כי (siRNA) נוצר תא אל תא ותנועה מערכתית של RNA התערבות הקטן באמצעות התערבות RNA צריך להעניק השתקת אפלטוקסין-סינתזה ברחבי המפעל. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/53398/53398fig5.jpg" /> איור 5. תרשים זרימה סכמטי של השיטה לנתח את האפקטיביות של RNAi בהשתקה </sטרונג&gt; גני אפלטוקסין-סינתזת אספרגילוס בזרעי בוטנים. ייצוג גרפי של זרימת העבודה בעת עיבוד דגימות בוטנים לביטוי גנים או ניתוח אפלטוקסין. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53398/53398fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> קווי RNAi בוטנים 288-72 ו288-74 הראו נוכחות של יצרנית בחירת NPTII כאשר נבדקו על ידי STN-PCR, סעיפי ג &#39;מוצגים באיור 6 (למעלה), תמונות מקוריות זמינות מהמחברים על פי דרישה. פלסמיד pCAPD לא היה בשימוש כשליטה של שינוי שכן הוא מקודד חוזר הפוך של שני גנים CMR (התנגדות chloramphenicol) וCcdB (רעלן) של השפעה ידועה על צמחים. PCR קו שלילי בוטנים 288-9 ואחרים שעברו את תהליך ההתחדשות וגדל באותם תנאים כמו קווי RNAi, שימש כקון השליליTrol. <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/53398/53398fig6.jpg" /> . איור 6. איתור של transgenics וביטוי בזמן אמת של RNAi להוסיף למעלה: Single-צינור, זיהוי מקונן PCR של קווים מהונדסים בוטנים RNAi-288-72 וRNAi-288-74, צמחים חיוביים. בקרה: W (מים), PP (צמח חיובי), MM (תערובת אמן), עמ &#39;(פלסמיד p5XCAPD); שברים 1/2 1/4 1/8 1/16 מייצגים דילולים פי 2 של ה- DNA תחתון:. Real-Time PCR לגילוי ביטוי של RNAi להכניס (סטי פריימר: RT_5X_1, RT_5X_2, כמו באיור 1, על בוגר ( קו אפור; צהוב) ובוגר (פסיגים חום) של קווים מהונדסים ב 24 ודגירת 48hr: C T היסטוגרמות = 1. מייצגות את האמצעים וברים שגיאה סטנדרטיים (T) של שלוש דגימות ביולוגיותעם שלושה משכפל טכני. הכימות היחסי של הוספת RNAi היה מנורמל ביחס לגן המשק אקטין כבקרה פנימית וביטוי של פי השוואתי של transgene מחושב כפי שמתואר ב5.2.2 ו -5.3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53398/53398fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> כדי לבחון את האפקטיביות של בקרה פוטנציאלית בתיווך RNAi צמח-מארח של הצטברות אפלטוקסין, נבגים טריים שנקטפו של אספרגילוס flavus NRRL 3357 יושמו על פני השטח החתך של מחצית פסיגים ממנו את העוברים וtesta הוסרו (איורים 3, 4). NRRL א flavus 3357, שהגנום כבר רצף והיה הבסיס לעיצוב p5XCAPD, נמסר באדיבות על ידי ד&quot;ר הורן בUSDA-ARS-NPRL. פלישת כתוצאה פטרייתי של מחצית טבורית לאחר 24, 48 ו -72 שעות על 30 מעלות צלזיוס היא מופע<html> n באיור 4. דוגמאות של מחצית פסיגים מחוסנים נאספו ב 24, 48, 72, 96 שעות של דגירה, ונותחו במשך ארבעה aflatoxins B העיקרי 1, B 2, G 1 וG 2 באמצעות UPLC ואושרו על ידי LC-MS ; תוצאות מוצגות באיור 6. ריכוזי אפלטוקסין נקבעו באמצעות שיטה שפורסמה עם שינויים 36. בשעה 96 דגירה, פסיגים מתחילים להתפורר בשל הזיהום פטרייתי. קו RNAi 288-72 הציג רמות נמוכות יותר באופן משמעותי של aflatoxins מאשר השליטה בכל תאריכי הדגימה בפסיגים לא בוגרים ולכל היותר תאריכי דגימה בבוגרים אלה. קו RNAi 288-74 הראה רמות נמוכות יותר באופן משמעותי של aflatoxins ברוב תאריכי דגימה. רמות של משמעות של הבדיקה של Tukey מסומנות בכוכבית בגרפיקה של איור 7. <html> g7.jpg &quot;/&gt; . איור 7. aflatoxins B 1 ו- B 2 בפסיגי בוטנים חצי לאחר דגירה (24, 48, 72 ו -96 שעות) עם flavus אספרגילוס בקרה: זרעים של 288-9 קו שאינו מהונדס; RNAi: זרעים מRNAi-288-72 וRNAi-288-74, מהונדס לRNAi p5XCAPD להשתיק חמישה גני אפלטוקסין-סינתזה. אפלטוקסין B 1 בזרעים בשלים (חום) (א); אפלטוקסין B 2 זרעים בשלים (ב); אפלטוקסין (ג) ב 1 בזרעים בשלים (צהוב) ואפלטוקסין (ד &#39;) ב&#39; 2 בזרעים לא בשלה. ערכים ממוצעים עם הברים המקבילים סטנדרטי שגיאה (T) של דגימות ביולוגיות כפולות מיוצגים. הבדלים מובהקים סטטיסטי הבדיקה * של Tukey: p ≤ 0.05, **: p ≤ 0.01, ***: p ≤ 0.001.S: //www.jove.com/files/ftp_upload/53398/53398fig7large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. בסך הכל, RNAi-288-72 הראה לאורך כל הניסוי (24-96 שעות דגירה), 94% הפחתה -100% באפלטוקסין B 2, והפחתה של 90% -100% באפלטוקסין B 1 בהשוואה לשליטה. RNAi-288-74 הראה 63% -100% הפחתה באפלטוקסין B 2 ו -60% -100% הפחתה באפלטוקסין B 1, איור 7. פריימרים המשמשים לזיהוי PCR בזמן אמת של ביטוי של להכניס את RNAi מוצגים באיור 1. פסיגים בוטנים-זרע נותחו ללא עוברים, כדי להסיר את ההגנות טבעיות שלהם ולהיות מסוגל לזהות את ההשפעה הפוטנציאלית של RNAi באזור החשוף ביותר ל פטריית פלישה, הפסיגים. ביטוי של RNAi מזוהה להוסיף בפסיגים בוגרים (צהוב) של קו 288-74 על ידי פריימר להגדיר RT_5X_1 היה פי ארבעה על T C </sUB&gt; = 1 סף של הביקורת השלילית, ועל ידי פריימר להגדיר RT_5X_2 היה 19 לקפל מעל הסף, בבת 24 שעות דגירה. לפחות שלוש מתוך חמישה שברי גן ברציפות בשימוש בשינוי הבוטנים, 5027, 7223 ו7228 (aflep, aflS / aflJ, וaflC / pksA, בהתאמה) אותרו על ידי RT-PCR (איור 1, 6). ביטוי של הכנס RNAi לא זוהה בפסיגים בוגרים ב 24 שעות, או בפסיגים בוגרים או לא בוגרים ב 48 שעות דגירה, איור 6 (למטה). <table fo:keep-together.within-page="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr height="21"><td height="65" rowspan="3" style="height:65px;width:64px;"> בוטנים קו </td><td rowspan="3" style="width:64px;"> זמן של דגימה </td><td colspan="3" style="width:192px;"> דוגמאות לRT-PCR </td><td colspan="3" rowspan="2" style="width:192px;"> דוגמאות לניתוח אפלטוקסין (מחוסן) </td><td rowspan="3" style="width:64px;"> Nחום-אדמדם של זרעים </td></tr><tr height="22"><td colspan="3" height="22" style="height:22px;width:192px;"> (לא מחוסן) </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:64px;"> נציג 1 </td><td style="width:64px;"> נציג 2 </td><td style="width:64px;"> נציג 3 </td><td style="width:64px;"> נציג 1 </td><td style="width:64px;"> נציג 2 </td><td style="width:64px;"> נציג 3 </td></tr><tr height="22"><td height="66" rowspan="3" style="height:66px;width:64px;"> RNAi (צהוב) </td><td style="width:64px;"> 24 שעות </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td rowspan="3" style="width:64px;"> 4.5 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:64px;"> 48 שעות </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><tdסגנון &quot;רוחב: 64px;&quot; =&gt; 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:64px;"> 72 שעות </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:64px;"> לִשְׁלוֹט </td><td style="width:64px;"> 24 שעות </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td rowspan="3" style="width:64px;"> 4.5 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:64px;"> (צָהוֹב) </td><td style="width:64px;"> 48 שעות </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td&gt; <td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:64px;"></td><td style="width:64px;"> 72 שעות </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td></tr></tbody></table> טבלה 2. דוגמא להתקנה קטן מדגם לנתח ביטוי גנים והצטברות אפלטוקסין בזרעי בוטנים RNAi. ניתוח מלא של ביטוי וaflatoxins לקבוצה בגרות אחת (כלומר., צהובה), עם שלוש פעמים דגימה (24, 48 ו -72 שעות) , בשלושה עותקים, ידרוש 4.5 זרעים, כל מספר אחד בטבלה מייצג מחצית טבורית.

אנו מדגימים שיטה לניתוח aflatoxins וביטוי transgene בזרעי בוטנים המכילים אותות RNA-התערבות להשתקת גני אפלטוקסין-סינתזה בflavus אספרגילוס הפטרייה. השליטה בתיווך RNAi של mycotoxins בצמחים לא דווחה בעבר.

בקרה בתיווך RNAi של aflatoxins בבוטנים: שיטה לניתוח ייצור mycotoxin וביטוי transgene בבוטנים /<em&gt; אספרגילוס</em&gt; Pathosystem

The Food and Agriculture Organization of the United Nations estimates that 25% of the food crops in the world are contaminated with aflatoxins. That ...

המטרה הכוללת של עבודה זו היא לספק שיטה אמינה, מדויקת, זולה ומהירה לבדיקת היעילות של השתקה בתיווך RNAi של גנים לסינתזה של אספרגילוס בבוטנים טרנסגניים תוך שימוש במספר מינימלי של זרעים, בדרך כלל נדרשים מאות גרם זרעים כדי לכמת ביעילות אפלטוקסינים בדגימות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא משתמשת בפחות מחמישה זרעים לבדיקת טיפול מסוים 10 ימים לפני הכנת הזרעים, הקימה תרבית של אספרגילוס פלבוס חיובי לאפלטוקסין NR RL 3 3 5 7 במדיום מקדחה ZAP Pex. גדל את התרבות הזו ב-25 מעלות צלזיוס.הוא ישמש לחיסון זרעים. לאחר הכנת הצמחים הטרנסגניים המבטאים את ה-RNAI, המפורט בפרוטוקול הטקסט, המשיכו בקטיף הזרעים שלהם. ראשית, הסר את קרפיון הפריק באמצעות שחיקה ממכונת שטיפה בלחץ המכוונת לנמוך, או גרד את קרפיון הפריק ביד.לאחר הסרת קרפיון הפרי, זהה את צבע קרפיון המזו על ידי הנחת התרמילים על לוח בגרות לקבוצות המתאימות. כעת הסר את החורים ועבד את הזרעים הצהובים והחומים בנפרד. חשב את מספר הזרעים הדרושים לניסוי לפחות שלוש חתיכות זרעים, כלומר יש צורך בשלושה חצאי עופרת לכל קו בוטנים שנדגם.מכסים את תחתית הכוס הסטרילית בשכבת זרעים, ואז פשוט מכסים את הזרעים בנפח מדוד של 75% אתנול. ואז תכפיל את הנפח הזה. הניחו לזרעים לדגור בתמיסה למשך 30 שניות, ולאחר מכן שטפו אותם במים מזוקקים מעוקרים.לאחר מכן, טפל בזרעים בנפח של 2% היפוכלוריט כפי שנעשה עם אתנול F. תן לדגירה זו להימשך חמש דקות. לאחר מכן השתמש בשלוש שטיפות בנפחים של פי חמישה של מים מזוקקים מעוקרים.כדי להסיר את ההיפוכלוריט, זה קריטי שכל תמיסת ההיפוכלוריט תישטף בשלב זה. הזרעים עוברים כעת עיקור פני השטח. לאחר מכן, הרטיבו את הזרעים על ידי טבילתם במים מזוקקים מעוקרים למשך שעתיים מוכנים להניח את הזרעים המיוברים על צלחת פטרי סטרילית.יש לעקר את כל החומרים בשלב זה. הסר את שכבות הזרעים בעזרת מלקחיים, ואז הפרד את הקוהיין. לבסוף, הסר את העוברים בעזרת אזמל.ניתן להשליך את העוברים או להשתמש בהם לחידוש צמחים חדשים. לאחר מכן, חותכים את האולאין לשניים בעזרת אזמל וטובלים את החצאים ומים מזוקקים מעוקרים עד שהם מוכנים לחיסון. לאחר מכן, כתם עודפי מים מחצי עופרת על מגבות נייר סטריליות והניח חתיכות זרעים בצלחות מקדחה נפרדות של 1.5% עם שקעים בגודל זרעים ותוחב לתוכם את הזרעים כשהצדדים החתוכים כלפי מעלה כדי לחסן את חצאי העופרת המשותפת.הוסף למשטחים החתוכים שני מיקרוליטר של נבגי אספרגילוס של 10,000 לכל תרחיף מיקרוליטר. אל תתנו למתלה לזרום בצידי חציית הזרע. לבסוף, הניחו את הכלים באינקובטור חשוך בחום של 30 מעלות צלזיוס למשך יום עד ארבעה ימים עד שהם נבדקים.לאחר יום אחד, לאחר יומיים, ולאחר שלושה או ארבעה ימים דגמו את הזרעים הסירו בעדינות חצאים מחוסנים שנבחרו באקראי לפי הצורך. השתמש בטישו כדי לנגב עודפי נבגים ומקדחה והנח את הדגימה לתוך בקבוקון מכסה בורג מזכוכית. העבר דגימות לא מחוסנות לשני צינורות מיליליטר לניתוח R-T-P-C-R.דגימות חינם בחנקן נוזלי ואחסנו דגימות קפואות במקפיא עד לעיבודן. לניתוח האפלטוקסין, קבל את חצי מיטת התינוק המחוסן מובילין בבקבוקון מכסה בורג זכוכית של ארבעה מיליליטר במידת הצורך. הדגימה תהיה יציבה במשך חודשים רבים במינוס 80 מעלות צלזיוס.כאשר הזרעים בטמפרטורת החדר, חלץ את הדגימה על ידי הוספת ארבעה נפחים של מתנול ולתת לצינורות לדגור למשך הלילה בחושך בטמפרטורת החדר ללא תסיסה. למחרת, בצע תחילה את ה- UPLC, הכין עמוד מיני פרופילן בנפח 1.5 מיליליטר עם פריט תואם. לאחר מכן מוסיפים 200 מיליגרם תחמוצת אלומיניום.ואחר כך, הכניסו פריט נוסף. המיקום הבא, בקבוקון דגימה אוטומטי A-U-P-L-C מתחת ובמגע עם עמודת המיני כדי למזער את האידוי. כעת הוסף 0.5 מיליליטר תמצית מתנול מהדגימה לכוס חד פעמית שתיים לא פלסטיק.לאחר מכן הוסיפו 0.5 מיליליטר אצטו ניטריל לצינור וערבבו את התמיסות עם פיפטה. כעת מרחו 0.5 מיליליטר מהתערובת על עמודת המיני המוכנה ואספו את ה- EIT באמצעות כוח הכבידה בלבד. לאחר איסוף ה- EIT במהירות חבר מכסה ספיגה לבקבוקון האיסוף לשימוש ב- UPLC.הנח את הבקבוקונים ב-A-U-P-L-C שכבר הוכן עם שלב נייד של ניסוי מים, מתנול ואצדוניט. לאחר מכן כמת את תכולת האפלטוקסין ב- EITs. עיין בפרוטוקול הטקסט לפרטים נוספים יחד עם ניתוח UPLC.הגדר את חתיכות הזרעים המשמשות למיצוי בבקבוקוני זכוכית בודדים. לאחר מכן ליופיליזציה של הבקבוקונים למשך הלילה ומדידת המשקל היבש של דגימת הרקמה בבוקר כך שריכוזי האפלטוקסין יוכלו להתבטא בננוגרם לגרם דגימה. לאחר מכן מוציאים את הדגימות מהמקפיא ומוסיפים טריול וטוחנים את הרקמות הקפואות עם הומוגנייזר טחנת חרוזים ב -3, 100 סל"ד למשך 40 שניות וממשיכים למיצוי RNA וקטור RNAI הנושא שברים קטנים של חמישה גנים לסינתזה של אפלטוקסין מפלביס שימש לשינוי צמחי בוטנים.מספרי הזיהוי תואמים את מספרי הערות הגנום של המכון הרחב מ-99 TRANSFORMANTS מחודשים, שבעה קווים חיוביים ל-PCR שוכפלו ונבדקו כמתואר. כל השבעה הראו הצטברות של 60 עד 100% פחות אפלטוקסין בהשוואה לקווי הביקורת. מוצגות תוצאות משניים מתוך שבע הקווים.שני קווי RN AI אלה הראו את נוכחותו של שני הסמנים הניתנים לבחירה של NPT. על פי תוצאות S-T-N-P-C-R, הבקרה השלילית ששימשה הייתה קו PCR שלילי שעבר את תהליך הטרנספורמציה כדי לבדוק את קווי ה-RNAi ליכולתם להתנגד לאפלטוקסינים שנקטפו טריים של אפלטוקסין חיובי. קו פלביס NRRL 3 3 5 7 הוחל על עופרת חצי עריסה חסרת עובר ואשך לאחר הדגירה עד 96 שעות.הרקמות המחוסנות עובדו באמצעות UPLC כדי למדוד את רמות האפלטוקסין שלהן כמתואר. תוצאות אלו אושרו עוד יותר על ידי ספקטרומטריית מסה של כרומטוגרפיה נוזלית. בסך הכל, RNAi 2 88 72 הראה ירידה של 94 עד 100% באפלטוקסין B 2 והפחתה של 90 עד 100% באפלטוקסין B 1 בהשוואה לביקורת.ואילו RNAi 2 88 74 הראה ירידה של 60 עד 100% בשני האפלטוקסינים. בעקבות הליך זה, ניתן להשתמש באותן תמציות זרעים כדי לנתח פיטו שין על מנת להבין טוב יותר את תגובת הזרעים לפלישה פטרייתית. שיטה זו תספק גם כלי ייחודי שיסייע בפיתוח טכנולוגיית RNAI לבקרת מיקוטוקסינים.

rnai-mediated-control-aflatoxins-peanut-method-to-analyze-mycotoxin

Research

JoVE Journal

Environment

סביבה

כאן אנו מציגים פרוטוקול לנתח אספרגילוס flavus צמיחה וייצור aflatoxin ב תירס גרעינים ביטוי של חלבונים נגד פטריות.  באמצעות זן GFP-לבטא flavus א לנו פיקוח זיהום או התפשטות הפטרייה ב גרעינים בוגרת בזמן אמת. וזמינותו היא מהירה, אמינה, לשחזור.

עיכוב של צמיחה אספרגילוס flavus Aflatoxin ייצור הטרנסגניים תירס לבטא מעכב α-עמילאז מן Lablab purpureus ל'

אנו מדגימים שיטת תפוקה בינונית לכימות של אפלטוקסינים ופיטואלכסינים סטילבנואידים בזרעי בוטנים בודדים באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים מעולים. שיטה זו פותחה במיוחד לניתוח של מיני ארכיס בר המאותגרים על ידי מיני אספרגילוס אפלטוקסיגניים.

כימות מבוסס SPEP-UPLC לא הרסני של אפלטוקסינים ופיטואלכסינים סטילבנואידים בבוטנים בודדים (Arachis spp.) זרעים

גז פליטה מתחנות כוח הוא CO 2 מקור זול לצמיחת אצות. בנינו "גז פליטה לאצות טיפוח" אב טיפוס של מערכות ותיארו כיצד בהיקף של עד תהליך טיפוח האצות. אנחנו הדגמנו את השימוש במודל ביו תגובת העברה המוני כדי לדמות ולעצב את הפעולה האופטימלית של גז פליטה לצמיחה של sp כלורלה. בצילום bioreactors אצות.

לייעל ארובות הגדרות גז לקידום Microalgae צמיחה בphotobioreactors באמצעות הדמיות מחשב

עבודה זו מתארת ​​את שיטה חדשה למיקוד סלקטיבי אברונים subcellular בצמחים, assayed באמצעות BioRad ג'ין האקדח.

ביטוי גנים חולף בטבק באמצעות גיבסון הרכבה והאקדח הגן

חומצות שומן פוספוליפידים לספק מידע על המבנה של קהילות חיידקי אדמה. אנו מציגים שיטות חילוץ מתוך דגימות קרקע בתערובת כלורופורם חד פאזיים, חלוקה של שומני חילוץ באמצעות עמודות מיצוי שלב מוצק, methanolysis לייצר אסטרים מתיל חומצות שומן, אשר מנותחים על ידי גז כרומטוגרפיה נימים.

הפקה וניתוח של פוספוליפידים מיקרוביאלית חומצות שומן בקרקעות

טבלאות תרמו-שיפוע מסורתיות יוצרות טווח של טמפרטורות על פני השטח. שקעי ריתוך בניצב לפני השטח של שולחן תרמו-שיפוע ישלוט בטמפרטורה לעומק ויגדיל את יישומי המחקר האפשריים.

לוח א gusseted Thermogradient לשלוט טמפרטורות קרקע להערכת גדילת צמחי ניטור תהליכי אדמה

מאמר זה מתאר מבצע הליכים כדי להפוך את הרווארד סביבתיים קאמרית (HEC) קשורים אינסטרומנטציה עבור מדידת גז ומינים של חלקיקים. תא סביבתיים משמש כדי לייצר וללמוד משני מינים אורגני המופק את סימנים מקדימים אורגני, במיוחד הקשורים אטמוספרי חלקיקים אורגניים.

ייצור, מדידה של חלקיקים אורגניים בבית הבליעה סביבתיים הרווארד

כאן, אנו מציגים את פרוטוקול כדי לבדוק התקפה אלימה צמח עם המחלה צמח Magnaporthe grisea. דוח זה לתרום הקרנת בקנה מידה גדול pathotypes של פטריות מבודד, לשמש נקודת התחלה מצוינת להבנת מנגנוני עמידות הצמחים במהלך ההתרבות מולקולרית.

הבדיקה זיהום צמח: ריסוס, בתיווך הפצע חיסון עם הפתוגן של צמח Magnaporthe Grisea

היעילות של בריאות הציבור הדברה מיקוד חרקים מטרד, מחלת-וקטור אינה אחידה על פני אזורי אקולוגיים שונים. כאן אנו מציגים מערכת של טכניקות באמצעות וקטור בשבי חרקים כמו זקיפים על יעילות ההדברה להפיק מפות אלקטרוניות תמיכה האבחון הסטנדרטי של חומרי הדברה לרוחב סביבות מרובות.

להמחיש את היעילות של חומרי הדברה נגד יתושים וקטור מחלת בשטח

אומדן מדויק של המדד לאזור העלה (LAI) הוא חיוני עבור דגמים רבים של פלקסים חומר ואנרגיה בתוך מערכות אקולוגיות ובין מערכת אקולוגית ושכבת גבול אטמוספרית. לכן, שלוש שיטות (מלכודות המלטה, טכניקה מחט, ו PCA) לקיחת מדידות LAI מדויק היו בפרוטוקול המוצג.

שערוך אינדקס אזור העלה באמצעות שלוש שיטות נפרדות בדוכנים נשירים טהור

למד שיטה לניתוח ייצור aflatoxins בבוטנים תוך שימוש ב-RNAi נגד Aspergillus flavus. השיטה מאפשרת כימות יעיל עם פחות מחמישה זרעים במקום מאות גרמים, ומפחיתה 60-100% מהרעלן.

בקרה בתיווך RNAi של aflatoxins בבוטנים: שיטה לניתוח ייצור mycotoxin וביטוי transgene בבוטנים /

גלה סרטונים נוספים