בקרה בתיווך RNAi של aflatoxins בבוטנים: שיטה לניתוח ייצור mycotoxin וביטוי transgene בבוטנים /

המטרה הכוללת של עבודה זו היא לספק שיטה אמינה, מדויקת, זולה ומהירה לבדיקת היעילות של השתקה בתיווך RNAi של גנים לסינתזה של אספרגילוס בבוטנים טרנסגניים תוך שימוש במספר מינימלי של זרעים, בדרך כלל נדרשים מאות גרם זרעים כדי לכמת ביעילות אפלטוקסינים בדגימות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא משתמשת בפחות מחמישה זרעים לבדיקת טיפול מסוים 10 ימים לפני הכנת הזרעים, הקימה תרבית של אספרגילוס פלבוס חיובי לאפלטוקסין NR RL 3 3 5 7 במדיום מקדחה ZAP Pex. גדל את התרבות הזו ב-25 מעלות צלזיוס.

הוא ישמש לחיסון זרעים. לאחר הכנת הצמחים הטרנסגניים המבטאים את ה-RNAI, המפורט בפרוטוקול הטקסט, המשיכו בקטיף הזרעים שלהם. ראשית, הסר את קרפיון הפריק באמצעות שחיקה ממכונת שטיפה בלחץ המכוונת לנמוך, או גרד את קרפיון הפריק ביד.

לאחר הסרת קרפיון הפרי, זהה את צבע קרפיון המזו על ידי הנחת התרמילים על לוח בגרות לקבוצות המתאימות. כעת הסר את החורים ועבד את הזרעים הצהובים והחומים בנפרד. חשב את מספר הזרעים הדרושים לניסוי לפחות שלוש חתיכות זרעים, כלומר יש צורך בשלושה חצאי עופרת לכל קו בוטנים שנדגם.

מכסים את תחתית הכוס הסטרילית בשכבת זרעים, ואז פשוט מכסים את הזרעים בנפח מדוד של 75% אתנול. ואז תכפיל את הנפח הזה. הניחו לזרעים לדגור בתמיסה למשך 30 שניות, ולאחר מכן שטפו אותם במים מזוקקים מעוקרים.

לאחר מכן, טפל בזרעים בנפח של 2% היפוכלוריט כפי שנעשה עם אתנול F. תן לדגירה זו להימשך חמש דקות. לאחר מכן השתמש בשלוש שטיפות בנפחים של פי חמישה של מים מזוקקים מעוקרים.

כדי להסיר את ההיפוכלוריט, זה קריטי שכל תמיסת ההיפוכלוריט תישטף בשלב זה. הזרעים עוברים כעת עיקור פני השטח. לאחר מכן, הרטיבו את הזרעים על ידי טבילתם במים מזוקקים מעוקרים למשך שעתיים מוכנים להניח את הזרעים המיוברים על צלחת פטרי סטרילית.

יש לעקר את כל החומרים בשלב זה. הסר את שכבות הזרעים בעזרת מלקחיים, ואז הפרד את הקוהיין. לבסוף, הסר את העוברים בעזרת אזמל.

ניתן להשליך את העוברים או להשתמש בהם לחידוש צמחים חדשים. לאחר מכן, חותכים את האולאין לשניים בעזרת אזמל וטובלים את החצאים ומים מזוקקים מעוקרים עד שהם מוכנים לחיסון. לאחר מכן, כתם עודפי מים מחצי עופרת על מגבות נייר סטריליות והניח חתיכות זרעים בצלחות מקדחה נפרדות של 1.5% עם שקעים בגודל זרעים ותוחב לתוכם את הזרעים כשהצדדים החתוכים כלפי מעלה כדי לחסן את חצאי העופרת המשותפת.

הוסף למשטחים החתוכים שני מיקרוליטר של נבגי אספרגילוס של 10,000 לכל תרחיף מיקרוליטר. אל תתנו למתלה לזרום בצידי חציית הזרע. לבסוף, הניחו את הכלים באינקובטור חשוך בחום של 30 מעלות צלזיוס למשך יום עד ארבעה ימים עד שהם נבדקים.

לאחר יום אחד, לאחר יומיים, ולאחר שלושה או ארבעה ימים דגמו את הזרעים הסירו בעדינות חצאים מחוסנים שנבחרו באקראי לפי הצורך. השתמש בטישו כדי לנגב עודפי נבגים ומקדחה והנח את הדגימה לתוך בקבוקון מכסה בורג מזכוכית. העבר דגימות לא מחוסנות לשני צינורות מיליליטר לניתוח R-T-P-C-R.

דגימות חינם בחנקן נוזלי ואחסנו דגימות קפואות במקפיא עד לעיבודן. לניתוח האפלטוקסין, קבל את חצי מיטת התינוק המחוסן מובילין בבקבוקון מכסה בורג זכוכית של ארבעה מיליליטר במידת הצורך. הדגימה תהיה יציבה במשך חודשים רבים במינוס 80 מעלות צלזיוס.

כאשר הזרעים בטמפרטורת החדר, חלץ את הדגימה על ידי הוספת ארבעה נפחים של מתנול ולתת לצינורות לדגור למשך הלילה בחושך בטמפרטורת החדר ללא תסיסה. למחרת, בצע תחילה את ה- UPLC, הכין עמוד מיני פרופילן בנפח 1.5 מיליליטר עם פריט תואם. לאחר מכן מוסיפים 200 מיליגרם תחמוצת אלומיניום.

ואחר כך, הכניסו פריט נוסף. המיקום הבא, בקבוקון דגימה אוטומטי A-U-P-L-C מתחת ובמגע עם עמודת המיני כדי למזער את האידוי. כעת הוסף 0.5 מיליליטר תמצית מתנול מהדגימה לכוס חד פעמית שתיים לא פלסטיק.

לאחר מכן הוסיפו 0.5 מיליליטר אצטו ניטריל לצינור וערבבו את התמיסות עם פיפטה. כעת מרחו 0.5 מיליליטר מהתערובת על עמודת המיני המוכנה ואספו את ה- EIT באמצעות כוח הכבידה בלבד. לאחר איסוף ה- EIT במהירות חבר מכסה ספיגה לבקבוקון האיסוף לשימוש ב- UPLC.

הנח את הבקבוקונים ב-A-U-P-L-C שכבר הוכן עם שלב נייד של ניסוי מים, מתנול ואצדוניט. לאחר מכן כמת את תכולת האפלטוקסין ב- EITs. עיין בפרוטוקול הטקסט לפרטים נוספים יחד עם ניתוח UPLC.

הגדר את חתיכות הזרעים המשמשות למיצוי בבקבוקוני זכוכית בודדים. לאחר מכן ליופיליזציה של הבקבוקונים למשך הלילה ומדידת המשקל היבש של דגימת הרקמה בבוקר כך שריכוזי האפלטוקסין יוכלו להתבטא בננוגרם לגרם דגימה. לאחר מכן מוציאים את הדגימות מהמקפיא ומוסיפים טריול וטוחנים את הרקמות הקפואות עם הומוגנייזר טחנת חרוזים ב -3, 100 סל"ד למשך 40 שניות וממשיכים למיצוי RNA וקטור RNAI הנושא שברים קטנים של חמישה גנים לסינתזה של אפלטוקסין מפלביס שימש לשינוי צמחי בוטנים.

מספרי הזיהוי תואמים את מספרי הערות הגנום של המכון הרחב מ-99 TRANSFORMANTS מחודשים, שבעה קווים חיוביים ל-PCR שוכפלו ונבדקו כמתואר. כל השבעה הראו הצטברות של 60 עד 100% פחות אפלטוקסין בהשוואה לקווי הביקורת. מוצגות תוצאות משניים מתוך שבע הקווים.

שני קווי RN AI אלה הראו את נוכחותו של שני הסמנים הניתנים לבחירה של NPT. על פי תוצאות S-T-N-P-C-R, הבקרה השלילית ששימשה הייתה קו PCR שלילי שעבר את תהליך הטרנספורמציה כדי לבדוק את קווי ה-RNAi ליכולתם להתנגד לאפלטוקסינים שנקטפו טריים של אפלטוקסין חיובי. קו פלביס NRRL 3 3 5 7 הוחל על עופרת חצי עריסה חסרת עובר ואשך לאחר הדגירה עד 96 שעות.

הרקמות המחוסנות עובדו באמצעות UPLC כדי למדוד את רמות האפלטוקסין שלהן כמתואר. תוצאות אלו אושרו עוד יותר על ידי ספקטרומטריית מסה של כרומטוגרפיה נוזלית. בסך הכל, RNAi 2 88 72 הראה ירידה של 94 עד 100% באפלטוקסין B 2 והפחתה של 90 עד 100% באפלטוקסין B 1 בהשוואה לביקורת.

ואילו RNAi 2 88 74 הראה ירידה של 60 עד 100% בשני האפלטוקסינים. בעקבות הליך זה, ניתן להשתמש באותן תמציות זרעים כדי לנתח פיטו שין על מנת להבין טוב יותר את תגובת הזרעים לפלישה פטרייתית. שיטה זו תספק גם כלי ייחודי שיסייע בפיתוח טכנולוגיית RNAI לבקרת מיקוטוקסינים.