Name: חומרי Biomimetic לאפיין אינטראקציות חיידקים-מארח (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 22 s
Description: למד לייצר חומרים ביומימטיים מחלבוני adhesins רקומביננטיים המצומדים לחלקיקי פוליסטירן לחקירת אינטראקציות חיידקים-מארח. שיטה זו מאפשרת ניתוח תרומת adhesins בודדים להידבקות ולציטוטוקסיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצים להודות לחברי קבוצת קרכלר על הקריאה הביקורתית של כתב היד. DHS, DV ו-AMK מומנו על ידי מועצת המחקר לביוטכנולוגיה ומדעי הביולוגיה (BB/L007916/1), FA מומן על ידי מלגת משרד ההשכלה הגבוהה והמחקר המדעי של הרפובליקה העיראקית ו-NPS מומן על ידי מלגת CONICYT.

<ol><li>Lim, J., Stones, D. H., Hawley, C. A., Watson, C. A., Krachler, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multivalent+Adhesion+Molecule+7+clusters+act+as+signaling+platform+for+host+cellular+GTPase+activation+and+facilitate+epithelial+barrier+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Multivalent Adhesion Molecule 7 clusters act as signaling platform for host cellular GTPase activation and facilitate epithelial barrier dysfunction.</a> PLoS Pathog. 10 (9), e1004421(2014).</li>
<li>Krachler, A. M., Ham, H., Orth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outer+membrane+adhesion+factor+multivalent+adhesion+molecule+7+initiates+host+cell+binding+during+infection+by+gram-negative+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Outer membrane adhesion factor multivalent adhesion molecule 7 initiates host cell binding during infection by gram-negative pathogens.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 108 (28), 11614-11619 (2011).</li>
<li>Krachler, A. M., Orth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+the+interaction+between+bacterial+adhesin+multivalent+adhesion+molecule+7+%28MAM7%29+protein+and+its+host+cell+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of the interaction between bacterial adhesin multivalent adhesion molecule 7 (MAM7) protein and its host cell ligands.</a> J Biol Chem. 286 (45), 38939-38947 (2011).</li>
<li>Joh, D., Speziale, P., Gurusiddappa, S., Manor, J., Hook, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+specificities+of+the+staphylococcal+and+streptococcal+fibronectin-binding+microbial+surface+components+recognizing+adhesive+matrix+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Multiple specificities of the staphylococcal and streptococcal fibronectin-binding microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules.</a> Eur J Biochem. 258 (2), 897-905 (1998).</li>
<li>Bingham, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structures+of+fibronectin-binding+sites+from+Staphylococcus+aureus+FnBPA+in+complex+with+fibronectin+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Crystal structures of fibronectin-binding sites from Staphylococcus aureus FnBPA in complex with fibronectin domains.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 105 (34), 12254-12258 (2008).</li>
<li>Ensenberger, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+interactions+between+F1+adhesin+of+Streptococcus+pyogenes+and+N-terminal+modules+of+fibronectin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Specific interactions between F1 adhesin of Streptococcus pyogenes and N-terminal modules of fibronectin.</a> J Biol Chem. 276 (38), 35606-35613 (2001).</li>
<li>Hawley, C. A., Watson, C. A., Orth, K., Krachler, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+MAM7+peptide-based+inhibitor+of+Staphylococcus+aureus+adhesion+does+not+interfere+with+in+vitro+host+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A MAM7 peptide-based inhibitor of Staphylococcus aureus adhesion does not interfere with in vitro host cell function.</a> PLoS One. 8 (11), e81216(2013).</li>
<li>Krachler, A. M., Ham, H., Orth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turnabout+is+fair+play%3A+use+of+the+bacterial+Multivalent+Adhesion+Molecule+7+as+an+antimicrobial+agent%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">Turnabout is fair play: use of the bacterial Multivalent Adhesion Molecule 7 as an antimicrobial agent.</a> Virulence. 3 (1), 68-71 (2012).</li>
<li>Krachler, A. M., Mende, K., Murray, C., Orth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+characterization+of+multivalent+adhesion+molecule+7-based+inhibition+of+multidrug-resistant+bacteria+isolated+from+wounded+military+personnel%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">In vitro characterization of multivalent adhesion molecule 7-based inhibition of multidrug-resistant bacteria isolated from wounded military personnel.</a> Virulence. 3 (4), 389-399 (2012).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

בזאת, אנו מתארים שני פרוטוקולים, אשר יכול לשמש לחלבונים המכיל תיאול זוג amine- או חרוזי פוליסטירן-שונה carboxylate, בהתאמה. בשל הקלות של ההליך, צימוד תיאול-אמין עדיף, אך בהתאם למפרט הרצוי חרוז (קוטר, תכונות הקרינה), שימוש בחרוזים פונקציונליות אמין לא יכולים להיות אפשריים ועל כן כללנו פרוטוקול שיהיה להמיר carboxylate - למחצית אמין לתת חוקר הגמישות הגדולה ביותר האפשרית בבחירה של פיגום. למרות ששני תיאול-אמין ועבודת צימוד תיאול-carboxyl לכל ציסטאין המכיל חלבון, צימוד כיוונית (כלומר, חוסר תנועה של החלבון לכל N-הסופית שלה, מחקה תצוגת משטח) דורש חלבון ללא שאריות ציסטאין, כי הוא מיוצר כהיתוך GST חלבון, או שמכיל שאריות ציסטאין מסוף יחידה שהוצגו על ידי אתר מכוון mutagenesis. אם cysteines תגובתי מרובה כלוליםבתוך החלבון, זה יוביל לחוסר תנועה אקראית שעלולות לעכב את תפקוד חלבון. adhesins חיידקים רב אינו מכיל cysteines באופן טבעי. עבור אחרים, אלה ניתן להסיר על ידי mutagenesis אתר מכוון, אם כי זה ידרוש מבחני נרחבים כדי להבטיח מבנה ותפקוד האם נשמרים במוטציה. לחלבונים היתוך GST, GST-תג מטוהר מצמידים את חרוזים יכול לשמש כביקורת שלילית מתאימה. שימוש בחרוזי נחק כביקורת יש להימנע, כמו אלה לעתים קרובות יש נטייה גבוהה יותר לגוש ביחד או לדבוק תאים שאינם ספציפי. גרסה פשוטה יותר של פרוטוקול 1.2., באמצעות EDC בלבד, יכולה לשמש לכמה חלבונים לחרוזי פולימרים פונקציונליות carboxyl, אולם במקרה זה צימוד מתרחש באמצעות אמינים ראשוניים בחלבון ולכן אינו מבטיח צימוד כיוונית. TCEP כסוכן צמצום לא חייב להיות מוחלף עם סוכנים אחרים זמינים מסחרית ונפוצים צמצום, כגון dithiothreitol (DTT) או 2-mercaptoethanol (BME), כthiols הכיל בתוכם יתחרה עם צימוד חלבון בשלב צימוד תיאול-maleimide. PBS עשוי להיות מוחלף עם מאגרים אחרים, אבל לשיקולים הבאים: חוצצים לא יכילו אמינים ראשוניים (כך מאגרי טריס המכילים אינם מתאימים). שימוש במאגרים המכילים ריכוזי מלח (&lt;10 מ&quot;מ) מאוד נמוכים מוביל לחרוז clumping ויש להימנע גם. טוהר חלבון הוא גם גורם חשוב לשקול במהלך הליך זה, וכדי להשיג נתונים באיכות גבוהה, יש להשתמש בחלבונים טהורים. אנחנו באופן שיגרתי לטהר חלבונים בשלבים מרובים, כוללים לפחות צעד טיהור זיקה וסינון ג&#39;ל, אך במקרים מסוימים יון כרומטוגרפיה חילופי נעשה כצעד שלישי. כתוצאה מכך טוהר של חלבונים המשמשים לצימוד הוא בדרך כלל 90% ומעלה, כפי שיישפט על ידי SDS-עמוד. מומלץ לקבוע ריכוזי חלבון הן בתערובת התגובה הראשונית, כמו גם של הsupernatant דואר לאחר השלמת תגובה. זה יעזור לקבוע את ריכוז חלבון לכאורה מצמידים חרוז של, ובכך צפיפות צימוד. נחישות של שני הערכים גם תאפשר חישוב של יעילות הצימוד. זה יכול להילקח בחשבון בעת ​​הכנת פתרון החלבון הראשוני בתגובות הבאות, כדי להשיג את צפיפות ריכוז וצימוד הסופית הרצויה. מגיב ברדפורד מתאים במיוחד לקביעת ריכוז חלבון לפני ואחרי תגובת הצימוד, כמו שאף אחד מהחומרים בתגובה מפריעה להיווצרות המורכבת הצבע בריכוזים בשימוש. אם ריכוזי חלבון נמוכים יותר לשימוש, שיטה זו עשויה להיות מוחלפת על ידי שיטת זיהוי רגישה יותר, עם זאת תשומת לב צריכה להיות משולמת לעובדה שזה צריך להיות תואם עם החומרים הכלולים בתוך תגובת הצימוד. כמו כן, מומלץ להשתמש בחומרים כימיים מוכנים טרי ולהתמודד עם ריאגנטים אבקה בזהירות (למשל, חנות<html> במכל אטום ולהשתמש חרוזים סיליקה, כדי למנוע את ריאגנטים ציור לחות) מאז האיכות של חומרים כימיים ישפיע על יעילות הצימוד. אם את יעילות הצימוד היא נמוכה מהצפוי, פתרונות אפשריים כוללים הגדלת ריכוזי חרוז וחלבון הראשוני. אם ריכוזים גבוהים יותר נמצאים בשימוש, הריכוז של חומרים כימיים צימוד יש להגדיל באופן יחסי על מנת להבטיח עודף טוחנת מספיק. שינוי ריכוזי חרוז / חלבון הוא בדרך כלל צעד טוב יותר לקראת אופטימיזציה במקום להגדיל את זמני תגובה. מאז הפרוטוקולים לצימוד חרוז הם ארוכים, אנחנו בדרך כלל להכין אצווה גדולים של חומר. Aliquots של ההשעיה ניתן snap-קפוא בחנקן נוזלי ומאוחסן ב -20 ° C למשך מספר חודשים. לא צריך להיות refrozen aliquots המופשר וצריך להיות כל הזמן על 4 מעלות צלזיוס ומשמש בתוך 1-2 ימים. עם זאת, זה ישתנה עם הטבע והיציבות של החלבון המשמש כצריך להיבדק על אצווה קטן בתחילה. s = &quot;jove_content&quot;&gt; adhesins מצמיד יד יכול לשמש ליישומים רבים, כמפורט להלן. פרוטוקול זה מתואר assay שמשמש בדרך כלל למדידת עיכוב של cytotoxicity המחייב ותיווך פתוגן חיידקים על תאי מארח. Assay מבוצע בדרך כלל כדי למדוד את היכולת של MAMs מצמידים חרוז לעכב תחרותי זיהום של תאי האפיתל הלה עם parahaemolyticus Vibrio הפתוגן נשא פרותי הים, או באמצעות ירידה בקובץ מצורף חיידקים לארח תאים או מופחת רעיל כמו קריאה מתוך . בשני המקרים, מבחני הכנה ומעקב תחרות באותו הפרוטוקול. בהתאם את ההודעה, זנים שונים של V. parahaemolyticus נמצא בשימוש: המתח ציטוטוקסיות POR1 משמש למדידות רעילות, ואילו המתח שאינו רעיל לתאי POR2 משמש למדידת הידבקות חיידקים, מאז המוות של תאים וניתוק תא פוגעים בהליך לכימות חיידקים מצורפים. בתחילה, compeניסויי tition הוקמו כפרוטוקול צעד חכם, שבו תאי מארח היו הראשונים מראש מודגרות-עם חרוזים לפני התוספת של חיידקים. לV. parahaemolyticus ומפרטי חרוז משמשים (2 מיקרומטר חרוזים מצמידים MAM7), ניתן להוסיף שני חרוזים וחיידקים באותו הזמן ללא שינויים ברעילים וכתוצאה מכך. כלומר, בהגדרת ניסוי זה, חרוזים לגבור חיידקים לתא מארח מחייב. בהתאם לגאומטרית המינים וחרוז חיידקים משמשת, ייתכנו סיבות טובות לשמירה על הידבקות חרוז וזיהום חיידקים כשני שלבים נפרדים. לדוגמה, כדי להדביק תאים עם חיידקים שאינם ניע, צלחות centrifuged נפוצות לאחר תוספת של תקשורת הזיהום. עם זאת, יש להימנע צנטריפוגה של צלחות המכילות השעיות חרוז, שכן זה מוביל לחלוקה לא שווה ביותר של חרוזים על שכבת התאים. אם גודל חלקיקים קטן יותר נמצא בשימוש, חרוזים ייקחו יותר זמן להתיישב על פני התא, במקרה שsuזמן fficient יש לאפשר לקובץ מצורף חרוז לפני הזיהום. כאשר הידבקות חיידקים משמשת כהקריא, יש לקחת דגימות בנקודות זמן שבו תאי מארח לא נפגעו באופן משמעותי על ידי מתח ההדבקה, כמו ניתוק תא ותמוגה יכולה להתפשר כימות של חיידקים מצורפים. במקום ספירת הידבקות חיידקים על ידי ציפוי דילול, דגימות יכולות לחלופין להיות מעובד להדמיה (איור 5). במקרה זה, צריכים להיות נזרעו תאים בתרבית רקמה על תלושי כיסוי זכוכית, ולא ישירות לתוך בארות. בנוסף, ניתן להשתמש בחרוזי ניאון וחיידקים להביע חלבון פלואורסצנטי, יחד עם סמני תא מארח זיהום ספציפי. לדוגמא, ניסויי תחרות בדרך הדמיה באמצעות rhodamine-phalloidin האדום ניאון להכתים cytoskeleton אקטין תאי המארח ולהעריך שינויים מורפולוגיים הנובעים מזיהום, יחד עם חרוזים כחולים ניאון וניאוןירוק (GFP להביע או SYTO18 מוכתם) חיידקים. מגוון של adhesins מצמידים חרוז, כוללים Staphylococcus aureus FnBPA, Streptococcus pyogenes F1 FUD וMAM parahaemolyticus Vibrio, היה בשימוש כחומרי biomimetic ללמוד הידבקות, עיכוב הידבקות והתרומה של הידבקות לתיווך פתוגן רעיל 1, 7, 8. אחד היתרונות של שימוש בגישה זו היא הקלות של הדמיה של אירועי קובץ מצורף, מאז חרוזים פולימרים המשמשים כפיגומים זמינים במגוון רחב של צבעים (למשל, אדום כחול, ניאון, כחול, כתום, ירוק). לפיכך, תיוג חלבון ישיר, שעלול להפריע לתפקוד, ניתן להימנע. בנוסף, המשטח מחקה צימוד תצוגת multivalent של adhesins על פני השטח החיידקים, ובכך משקף יותר רלוונטי מבחינה פיזיולוגית קונפורמציה בהשוואה לחלבונים מסיסים. בהשוואה למחקרים שהשתמש בחיידקים או bacteri שלמיםמוטציות אל, גישת חרוז עוקפת בעיות הקשורות להתפתחות חיידקים. לדוגמא, לטווח ארוך יותר (לדוגמא, O / N) מחקרים של הידבקות חיידקים לארח תאים באמצעות חיידקים שלמים לעתים קרובות נפגעו על ידי תופעות נלוות התפתחות חיידקים - החמצה של דלדול מדיום גידול והמזין להשפיע לרעה על תאי מארח, ושכפול חיידקי סופו של דבר פוגע ב איכות הדמיה. לאחרונה, השימוש בadhesins מצמידים חרוז הורחב לכלול את השימוש בם ככלים לpurifications זיקה של גורמי מארח סלולארי המעורבים בתהליכי איתות במורד הזרם של קובץ מצורף חיידקים. V. parahaemolyticus MAM7, באמצעות קשירה לחומצות phosphatidic בקרום התא המארח, מפעיל הפעלת RhoA וארגון מחדש יקטין 1, 3. חרוזים בשילוב MAM נמצאים בשימוש כדי לטהר ולזהות חלבונים מעורבים בפלטפורמות האיתות התאספו כתוצאה מתא MAM-מארח כְּרִיכָה. מאז חרוזים יכוליםבקלות להיות מופרד מsupernatant על ידי צעד צנטריפוגה קצר, והחלבון של עניין הוא בשילוב קוולנטית, זה הוא שיטה טובה להשגת הפרדה מחלבונים מזהמים ולהעשיר קומפלקסי חלבונים רלוונטיים, אשר יכול לשמש ליישומים במורד כגון פרוטאומיקה או מערבי סופג.

ניתוח האינטראקציות בין הידבקויות חיידקיות לקולטני פני השטח של המארח בממשק המארח-פתוגן הוא צעד חיוני לקראת הבנתנו את המנגנונים הבסיסיים המניעים הידבקות חיידקית. בסופו של דבר, זה יעזור לנו לזהות אסטרטגיות להפרעה לתהליכים האלה במהלך זיהומים. בביצוע מחקרים כאלה, אנו עומדים לא פעם בפני דילמה: ניתוח ביוכימי וביופיזיקלי של המנגנונים המולקולריים של קשירת הדבקות מחייב את הפרדתם ממרכיבי דופן התא האחרים, מה שעלול להפריע לאירועי הידבקות. מצד שני, השימוש בחלבונים מסיסים רקומביננטיים מפשט יתר על המידה את אירוע ההדבקה, על ידי התעלמות מעיגון החלבון בדופן התא החיידקי והרב-ערכיות של הקישור המושגת באמצעות תצוגת פני השטח של החיידקים. באותה מידה, מנקודת המבט של התא המארח, למפגש ולקשירה למולקולות דבק בודדות לא תמיד יש את אותה השפעה מבחינת ארגון קרום הפלזמה, נזילות הממברנה ואשכולות הקולטנים1 וזה, בסופו של דבר, מקשה על הערכת השפעת ההדבקה על האיתות התאי המארח ועל התוצאה של אינטראקציות חיידקים-מארחים. 
לאחרונה הומצאה שיטה, לפיה דבקים מטוהרים רקומביננטיים או שברי דבקים מחוברים באופן כיווני וקולנטי לחלקיקי פולימר הדומים בגודלם לחיידקים, ובכך מחקים את תצוגת פני השטח של חיידקים. גישה זו שימשה במגוון של הידבקויות שונות, החל ממולקולות הידבקות רב-ערכיות גראם שליליות (MAMs)2, 3, ועד הידבקויות גרם חיוביות כולל חלבון קושר סטפילוקוקוס אוראוס פיברונקטין (FnBPA)4, 5 וסטרפטוקוקוס פיוגנס F1 6, 7. שיטה זו אפשרה דיסקציה של שברי הדבקות החשובים לקשירת תא מארח, זיהוי קולטנים על פני השטח של המארח וקביעת התנהגותם על פני התא המארח, תוך התחשבות הן בזיקה ובלהט של קשירה 1, 8. בנוסף, גישה זו שימשה כדי לחקור את היעילות של הידבקויות ונגזרות משותקות כמעכבים אינטראקציות מארח-פתוגן 8, 9. הוכח כי ניתן להשתמש בנגזרות מצומדות פני השטח של מולקולת ההדבקה הרב-ערכית Vibrio parahaemolyticus (MAM) 7 כדי להחליש מגוון זיהומים חיידקיים במבחנה, כולל אלה הנגרמים על ידי פתוגנים עמידים לתרופות מרובות כגון Acinetobacter baumannii ו- S. aureus עמיד למתיצילין (MRSA) 7, 9. 
כאן, אנו מתארים כימיות שונות שניתן להשתמש בהן כדי לשתק דבקים לחלקיקי פוליסטירן פונקציונליים זמינים מסחרית. בשל המגוון הרחב של פונקציות פני השטח הזמינות, תוויות וגדלי חלקיקים, אלה מהווים פיגום שימושי לייצור חומרים בקטריומימטיים לחקירת אינטראקציות דבק-מארח. אנו מתארים עוד שיטות לאפיון ראשוני של תגובת הצימוד, ולחישוב תכונות חשובות של החומרים המתקבלים. לבסוף, השימוש בהידבקויות מצומדות חרוזים כמעכבים תחרותיים של זיהומים חיידקיים במבחנה נדון כדוגמה ליישומם, כמו גם ההיקף והמגבלות העתידיות של גישה זו.

<table><tbody><tr><td>ריאגנטים</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)</td><td>Sigma</td><td>646547</td><td>Danger; ניתן לקנות קורוזיבי כתמיסה או</td></tr> טרי <tr><td>Sulfosuccinimidyl 4-(p-maleimidophenyl)butyrate (Sulfo-SMPB)</td><td>Fisher</td><td>PN22317</td><td>Danger;</td></tr><tr><td>L-ציסטאין</td><td>רעיל Sigma</td><td>30089</td><td>Danger; רעיל</td></tr><tr><td>חרוזי לטקס, פוליסטירן שעבר שינוי אמין, כחול ניאון - תרחיף מימי, 2.0&nbsp; &mu; m גודל חלקיקים ממוצע</td><td>Sigma</td><td>L0280</td><td>מזיק; מגוון גדלים וצבעים חלופיים של חלקיקים זמין</td></tr><tr><td>1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC)</td> <td>Thermo scientific</td><td>22980</td><td></td></tr><tr><td>N-hydroxysuccinimide (NHS)</td> <td>Thermo scientific</td><td>24500</td><td></td></tr><tr><td>חרוזי פוליסטירן שעברו שינוי קרבוקסילט</td><td>Sigma</td><td>CLB9</td><td>מזיקים; מגוון גדלים וצבעים חלופיים של חלקיקים זמין</td></tr><tr><td>Ethylenediamine</td><td>Sigma</td><td>E26266</td><td>Danger; אלבומין סרום בקר דליק, קורוזיבי, רעיל, רגיש</td></tr><tr><td>(BSA)</td><td>Promega</td><td>W3841</td><td></td></tr><tr><td>מגיב ברדפורד</td><td>סיגמא</td><td>B6916</td><td>סכנה; קורוזיבי ורעיל</td></tr><tr><td>דולבקו s Modified Eagle' s בינוני - גלוקוז גבוה - עם 4,500 מ"ג/ליטר גלוקוז וסודיום ביקרבונט, ללא&nbsp; L-גלוטמין, נתרן פירובט ופנול אדום, נוזלי, מסונן סטרילי, מתאים לתרבית תאים</td><td>Sigma</td><td>D1145</td><td>לניסויי זיהום</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D6429</td><td>לתחזוקת תאי מארח מתורבתים</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי,</td> תוסף <td>Sigma</td><td>F9665</td> מומת <td>בחום למדיום</td></tr> <tr><td>תרבית רקמותתמיסת פניצילין-סטרפטומיצין - מיוצבת, עם 10,000 יחידות פניצילין ו-10&nbsp; מ"ג סטרפטומיצין/מ"ל, מסונן סטרילי, BioReagent, מתאים לתרבית תאים</td><td>תוסף Sigma</td><td>F9665</td><td>למדיום תרבית רקמות</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>LDH ערכת זיהוי ציטוטוקסיות</td><td>Takara</td><td>MK401</td><td></td></tr><tr><td>מאגרי ריאגנטים</td><td></td><td></td> לכלי פלסטיק (25 מ"ל) SLS F267660 <td></td></tr><tr><td></td> צלחות 24 בארות <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>גריינר</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>צלחות 96 בארות</td><td>גריינר</td><td>655182</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ציוד</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>המוציטומטר</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרו-צנטריפוגה</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>קורא</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>צלחות מתקני</td><td></td><td></td> <td>תרבית רקמות</td></tr><tr><td>פיפטה</td><td></td><td></td><td></td> רב ערוצית</tr></tbody></table>

חומרי biomimetic לאפיין אינטראקציות חיידקים-מארח

Biomimetic Materials to Characterize Bacteria-host Interactions

התקשרות חיידקית לתאים מארחים היא אחד האירועים המוקדמים ביותר במהלך קולוניזציה של חיידקים ברקמות המארח ולכן צעד מפתח במהלך זיהום. האפיון הביוכימי והתפקודי של הידבקויות המתווכות את האינטראקציות הראשוניות הללו בין חיידקים למארח נפגע לעתים קרובות על ידי נוכחותם של גורמים חיידקיים אחרים, כגון רכיבי דופן התא או מולקולות מופרשות, המפריעים לניתוח. פרוטוקול זה מתאר את הייצור והשימוש בחומרים ביומימטיים, המורכבים מהידבקויות רקומביננטיות טהורות המחוברים כימית לחרוזי פוליסטירן פונקציונליים זמינים מסחרית, אשר שימשו בהצלחה לניתוח האינטראקציות הביוכימיות והתפקודיות בין הידבקויות חיידקיות בודדות לקולטני תאים מארחים. נדונים גם פרוטוקולים לכימיה של צימוד שונים, המאפשרים קיבוע כיווני של הידבקויות רקומביננטיות על פיגומי פולימר, ולהערכת יעילות הצימוד של החומרים ה"בקטריומימטיים" המתקבלים. אנו מתארים עוד כיצד חומרים אלה יכולים לשמש ככלי לעיכוב ציטוטוקסיות מתווכת פתוגן ודנים בהיקף, מגבלות ויישומים נוספים של גישה זו בחקר אינטראקציות חיידקים ומארחים.

V. parahaemolyticus adhesin MAM7 מכיל תחומים שבעה טנדם כניסת תאים יונקים (MCE) המעורבים בהכרה של קולטני משטח מארח. אנו משמשים חרוזי פוליסטירן מצמידים רקומביננטי, שברים מטוהרים הכוללים גם את כל תחומי MCE שבעה טנדם (MAM7) או רק תחום MCE הראשון (MAM1) כדי לבחון את היכולת של חומרים אלה כדי להתחרות עם V. parahaemolyticus לתא מארח המחייבים והיעילות של חומרים אלו כמעכבי הידבקות כתוצאה. תאי הלה היו נגועים בV. זן parahaemolyticus POR1, ורעיל כתוצאה מזיהום במבחנה הוערך לאחר 4 שעות (איור 3). טיפול בתאי הלה עם 0.1% Triton X-100 (שליטת תמוגה חיובית) הביאו תמוגה תא שלמה, תאים נגוע מוצגים רמות נמוכות מאוד של רעיל. זיהום במבחנה של תאים שלא טופלו עם POR1 הביא רמות גבוהות מאוד של תמוגה תא, וזה היה מעוכב על ידי MAM7-שיתוףupled חרוזים אבל לא מצמיד MAM1 או חרוזים שליטת מצמידים GST (איור 3). <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53400/53400fig3.jpg" /> איור 3. אפיון של parahaemolyticus Vibrio מושרה רעיל בתאי אפיתל במבחני תחרות. תאים שטופלו עם V. parahaemolyticus (סמנכ&quot;ל), הצביע עם (+), או לא חיידקים (-) בנוכחות של גופים מתחרים שונים (. comp) כפי שצוינו. אלה כללו גם לא comp. (-), חרוזים MAM7 (MAM7), חרוזים MAM1 (MAM1) או חרוזים שליטת GST (GST). כפקדים, טופלו תאים או עם טריטון X-100 (טריטון, שליטת תמוגה), או שמאלה נגוע (uninf). שחרור LDH לאחר 4 שעות נמדד כאמור בסעיף 3, ותוצאות מנורמלות לבקרות טריטון (100%) ואת החסר (0%) כפי שתואר לעיל. תוצאות הן אמצעי ± SEM מניסויים בשלושה עותקים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53400/53400fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> ספירת V. parahaemolyticus מצורף או תאים שלא טופלו הלה, או תאים הודגרו עם MAM7-, MAM1-, או חרוזים שליטת GST, גילה כי MAM7-חרוזים אבל לא MAM1- או חרוזים שליטת GST- לגבור V. parahaemolyticus לקובץ מצורף לארח קולטני תא שטח (איור 4). <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/53400/53400fig4.jpg" /> אפיון איור 4. התקשרות חיידקים במהלך ניסויי תחרות. תאי הלה היו נגועים בV. parahaemolyticus POR2 (סמנכ&quot;ל +), בהעדר (-) או נוכחות של גופים מתחרים כדלקמן: חרוזים MAM7 (MAM7), חרוזים MAM1 (MAM1) או חרוזים שליטת GST (GST) (comp.). הידבקות חיידקים נמדדה לאחר שעה 1, כ<html> מתואר בסעיף 3. תוצאות הם אמצעי ± SEM מניסויים בשלושה עותקים. אמצעי (fltr בCFU / ml) הם 2.3010 6, 5 1.5310, 2.0510 6, 6 2.1210. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53400/53400fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> Adhesins מצמידים את חרוזים fluorophore שכותרתו לגרום לדור של חומרים המחקים הידבקות חיידקים לארח תאים והם כלים רבי עוצמה להדמיה סלולרית (איור 5). שימוש בחרוזים כחולים ניאון בשילוב-MAM7, אנחנו אפיינו את תהליך ההתקשרות בתיווך MAM7 לתאי האפיתל. קובץ מצורף של MAM7 לארח תאים הביא יקטין ארגון מחדש והיווצרות סיבי מתח, שהיו באמצעות rhodamine-phalloidin להכתים לF- אקטין (איור 5) דמיין-שיתוף. _upload / 53,400 / 53400fig5.jpg &quot;/&gt; קובץ מצורף איור הכנה 5. ושימוש בfluorophore שכותרת חרוזים biomimetic למטרות הדמיה. () השעיה של חרוזים biomimetic כחולים ניאון (צינור תקין, 10x מלאי) וחיץ שליטה (צינור שמאלי). (ב) לחרוזים בשילוב-MAM7 להלה תוצאות תאים בארגון מחדש אקטין והיווצרות מתח סיב. סיבי קובץ מצורף של חרוזים כחולים ניאון ויקטינו מתח וכתוצאה מכך (אדומים, מוכתמים בrhodamine-phalloidin) היו צילמו על ידי מיקרוסקופ. בר, 10 מיקרומטר. תמונות בלוח ב &#39;הותאמו מים et al. 1 ולשכפל תחת רישיון Creative Commons ייחוס. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53400/53400fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

התקשרות חיידקית לתאי מארח היא שלב מפתח במהלך קולוניזציה וזיהום של המארח. פרוטוקול זה מתאר את הייצור של הידבקויות רקומביננטיות מצומדות פולימר כחומרים ביומימטיים המאפשרים ניתוח של תרומתם של הידבקויות בודדות לתהליכים אלה, ללא תלות בגורמים חיידקיים אחרים.

חומרי Biomimetic לאפיין אינטראקציות חיידקים-מארח

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The ...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לייצר חומרים ביו-מימטיים המורכבים מאדהזיות רקומביננטיות טהורות, המצומדות לחרוזי פוליסטירן, אשר ניתן להשתמש בהם כדי לנתח את האינטראקציות הביוכימיות והפונקציונליות בין אדהזיות חיידקיות בודדות לבין רספטורים של תאי מאכסן. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום האינטראקציות בין מאכסן לפתוגן, כגון מדידת ההשפעות על איתות בתאי המאכסן ועיכוב של ציטוטוקסיות המתווכת על ידי פתוגן. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שאדהזיות מטוהרות, AEAs, מצומדות באופן כווני וקוולנטי לחלקיקים פולימריים שגודלם דומה לזה של חיידקים, ובכך הן מחקות את התצוגה על פני השטח של החיידק.את הפרוצדורה ידגים עבורי תלמיד דוקטורט מהמעבדה שלנו. כאן יודגם צימוד מכוון של אמין. פרוטוקול זה מתאים לצימוד של חלבונים המכילים ציסטאין לחרוזי פולימר פונקציונליים עם אמין, תוך שימוש ב-SMPB (succinimidyl p-methylphenylbutyrate) כסוכן לקשירה צולבת. הכינו את כל הריאגנטים הדרושים רגע לפני השימוש כפי שמתואר בטקסט הפרוטוקול, כדי להתחיל בתהליך הפעלת החרוזים.ערבבו את תרחיף החרו지를 על ידי היפוך עדין, ולאחר מכן העבירו את הכמות הנדרשת של תרחיף החרוזים לשפופרת סטרילית של 1.5 milliliter. בתוך שפופרת המכילה one milliliter של PBS סטרילי pH 7.0, בצעו פיפוט עדין למעלה ולמטה כדי לשטוף את החרוזים, ולאחר מכן השקיעו אותם באמצעות סריפוגציה במיקרו-סריפוגה. הסירו בזהירות את הנוזל העליון באמצעות פיפטה.יש להשעות את משקע החרו지를 ב-1 milliliter של PBS סטרילי טרי ולחזור על שלב השטיפה. השע את משקע החרו지를. ל-0.8 milliliters של PBS הוסף 200 microliters של SFO SMPB בריכוז 10 millimolar שהוכן טרי.כדי להגיע לריכוז סופי של 2 mM, דגרו את תרחיף החרו지를 למשך שעה אחת בטמפרטורה של 25 °C על גלגל סיבוב בזמן דגירת החרוזים. הכינו את החלבון לשלב הצימוד הבא כדי שניתן יהיה להוסיפו מיד לחרוזים המופעלים. בדקו את ריכוז החלבון והתאימו אותו לריכוז הסופי הנדרש לתגובת הצימוד. שישה.לצורך חיזור חלבון משתמשים בדרך כלל בריכוז מיקרומולרי של חלבון ב-PBS ובנפח של מיליליטר אחד. הוסף תמיסת סטוק של TEP כדי להגיע לריכוז סופי של 5 millimolars. הדגר את התמיסה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר; שמור מספר מיקרוליטרים מתמיסת החלבון לצורך קביעת ריכוז החלבון ההתחלתי וחישוב יעילות הצימוד.התחילו את הליך צימוד החלבון על ידי הצמדת החרוזים המופעלים למשקע ושטיפת המשקע. לאחר העברה ל-1 ml של PBS סטרילי וטרי, השעיקו את המשקע בתמיסת החלבון שהוכנה כדי להגיע לריכוז החלבון הרצוי. דגרו את תגלייית החלבון והחרוזים במשך שעתיים ב-25 °C על גלגל סיבוב. לאחר שעתיים, בטלו את הפעלת הקבוצות שנותרו על החרוזים על ידי הוספת תמיסת מלאי של Sistine לריכוז סופי של 50 mM ודגירה של התגלייה למשך 30 דקות ב-25 °C על גלגל סיבוב.הפרידו את החרוזים באמצעות סרכזגיה. שמרו את הנוזל העליון (supernatant) לקביעת ריכוז החלבון ולחישוב יעילות הצימוד. שטפו את משקע החרוזים פעמיים עם 1 ml של PBS, השאיבו מחדש וערבבו עם 1 ml של PBS טרי. יום אחד לפני בדיקת התחרות, זרעו בכל באער של פלטת 24 באערים 1 ml של תאי HeLa בריכוז של 150,000 תאים ל-ml.דבר זה יאפשר לתאים להגיע לצפיפות של כ-80% לפני תחילת הניסוי. זרע תרבית של 5 mL של מצע LB ימי עם מושבה רעננה של V para hemolytic והגדל אותה למשך לילה בטמפרטורה של 30 °C עם ניעור. הכן כמות מספקת של מולקולת היצמדות רב-ערכית המחוברת לחרוזים כפי שהודגם קודם לכן.הקצה 100 µL של תמיסת סטימולציה של חרוצים בריכוז 10x לכל באר, או ריכוז סופי של 500 nM חלבון ביום ביצוע בדיקת התחרות. מדוד את ה-OD 600 של תרבית החיידקים. הכן מצע הדבקה על ידי דילול תרביות חיידקים ב-DMM חסר צבע ללא תוספים.חממו מראש ל-37 °C תרחיף תאים בנפח של 10% נפח לנפח. כדי להגיע ל-MOI של 10, הכינו מיליליטר אחד לבאר ונפח עודף של 10% עד 20% לכל דגימה. הסירו את המצע הישן מהבארות ושטפו את התרבית.יש להחלים את התאים על ידי הוספה של מיליליטר אחד של PBS סטרילי שחומם מראש ל-37 °C לכל באר. יש להסיר את ה-PBS ולהוסיף מיליליטר אחד של מצע הדבקה לכל באר. יש להוסיף תמיסות המכילות חרוזי בקרה וחיידקים כביקורות חיוביות, וחרוזי הידבקות ללא חיידקים כביקורות שליליות.הוסיפו DMM המכיל 0.1% TRITTON X 100 כביקורות ליזיס. הגדירו כל תנאי ניסוי, כולל הביקורות, בשלוש חזרות. דגרו את הפלטה באינקובטור לתרביות רקמה בטמפרטורה של 37 °C למשך הזמן הרצוי.בוצעת הערכת ציטוטוקסיות. ארבע שעות לאחר ההדבקה, יש להוציא 200 microliters מכל באער ששימשה בלוחית 24 הבארים ולהעביר ללוחית 96 בארים חדשה.סובב את פלטת 96 הבארים ב-1,500 G למשך חמש דקות והעבר 100 µL מכל באר לפלטת 96 בארים חדשה. הוסף 100 µL מהתווך ששימש במהלך ניסויי ההדבקה לשלוש בארים חדשות בפלטת 96 הבארים, שישמשו כביקורות ריק (blanks). בצע את בדיקת שחרור ה-lactate dehydrogenase באמצעות ערכה לזיהוי ציטוטוקסיות של LDH ובהתאם להוראות היצרן.ראשית, חשבו את כמות הריאגנט הדרושה במרווחים של 25. לדוגמה, עבור 100 דגימות. ערבבו 11.25 milliliters של ריאגנט A עם 250 microliters של ריאגנט B; הפכו את המבחנה כדי למנוע היווצרות קצף, אין להשתמש בוורטקס.בשלב הבא, העבירו את התערובת למאגר. לאחר מכן, הוסיפו 100 µL מתערובת הריאגנטים לכל דגימה והדגירו את הפלטה בטמפרטורת החדר למשך 10, 20 ו-30 דקות. מדדו את הבליעה באורך גל של 490 nm באמצעות קורא פלטות.לאחר מכן, חשבו את אחוז הציטוטוקסיות כפי שמתואר בכתב היד; מדידות של היצמדות חיידקים מבוצעות שעה אחת לאחר ההדבקה. הסירו את המצע משכבת התאים ושטפו ביסודיות את שכבת התאים ב-PBS סטרילי שחומם מראש כדי להסיר תאים שאינם תפוסים. שטפו לפחות שלוש עד ארבע פעמים, עם 1 mL של PBS בכל פעם. פטרו את תאי המאכסן על ידי הוספה לכל באר של 1 mL של תמיסת Triton X 100 סטרילית בריכוז 1% (נפח לנפח) ב-PBS; דגרו את הפלטה בטמפרטורה של 37 °C למשך חמש דקות.בצעו פיפטור של כל דגימה למעלה ולמטה מספר פעמים לפני העברת התוכן של כל באר לשפופרות נפרדות של 1.5 milliliter. הכינו דילולות סדרתיות פי עשרה של הדגימות ב-PBS סטרילי, והעבירו 100 microliters מכל דגימה לצלחות אגר LB עם מלח (marine LB agar), והפזות באמצעות מפזר תאים. יש לבחור את הדילול האופטימלי למריחה על הצלחת בהתאם לזנים החיידקיים ולנקודת הזמן עבור מערך ניסויי זה.דילול של 10 בחזקת 5 או 10 בחזקת 6 יניב מספר מתאים של CFU. דגרו את הצלחות הפטריה ב-37 °C למשך לילה, וביום למחרת, ספרו את החיידקים באמצעות ספירת מושבות. בבדיקות תחרות, תאי heela הודבקו במין V para hemolytic.דגימה דלה סומנה כחיובית או נותרה ללא זיהום בנוכחות ישויות מתחרות שונות. זיהום in vitro באמצעות דגימה דלה הביא לרמות גבוהות מאוד של ליזיס תאי, אשר נבלם על ידי חרוזי MAM seven מצומדים, אך לא על ידי חרוזי MA'AM one מצומדים או חרוזי GST מצומדים. ספירה של v paralytic המחובר לתאי HELOC לא מטופלים או לתאים שהודגרו עם MAM.שבעה חרוזי MAM.1 או חרוזי בקרה GST חשפו כי חרוזי MAM.7, אך לא חרוזי MAM.1 או חרוזי בקרה GST, תחרים את ה-parahemolytic בהיצמדותו לקולטנים על פני השטח של תאי המארח.הידבקויות המצומדות לפלואורסצנציה. חרו지를 סימון ארבעה יכולים לדמות הידבקות חיידקית לתאי מאחס ומהווים כלים עוצמתיים לדימות תאי. המבחנה מימין מכילה תרחיף של חרוזים ביו-מימטיים בצבע כחול פלואורסצנטי.MAM.שבעה חרוזי כחול פלואורסצנטיים מצומדים שימשו לאפיון תהליך ההיחברות של MAM seven לתאים אפיתליאליים. היחברות של MAM seven לתאי המאכסן הובילה לארגון מחדש של אקטין ולהיווצרות סיבי מאמץ, אשר הודגמו בו-ויזואליזציה באמצעות Rumine Phin לצביעת f actin. לאחר הליך זה, ניתן לבצע שיטות נוספות כגון טיהור באמצעות זיקה (affinity purification) בשילוב עם פרוטאומיקה או western blot, על מנת לענות על שאלות נוספות, כגון אילו גורמים תאיים של המאכסן מעורבים בתהליכי איתות במורד הזרם של ההיחברות הבקטריאלית.

biomimetic-materials-to-characterize-bacteria-host-interactions

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

מקור: Stones, D. H., et al. חומרים ביומימטיים לאפיון אינטראקציות חיידקים-מארחים. J. Vis. Exp. (2015)סרטון זה מדגים את השימוש בחרוזים בקטריומימטיים כדי לכמת הידבקות חיידקים לתאי אפיתל מארחים בתנאים תחרותיים. הוא מתאר את השלבים הכרוכים בטיפול בתאים, ליזה שלהם וציפוי דילולים סדרתיים למדידת יחידות יוצרות מושבה.

הערכת אינטראקציות בין חיידקים לתאים מארחים באמצעות חרוזים ביומימטיים

סרטון זה מדגים טכניקה להערכת היכולת של Porphyromonas gingivalis, חיידק פתוגני אנאירובי, להיצמד ולפלוש לתאי אנדותל של ורידים טבוריים אנושיים (HUVECs). לאחר הדבקת תאי המאכסן בחיידק, התאים המארחים עוברים ליזה כדי לשחרר חיידקים דבוקים ומופנמים. כאשר הליזט מצופה בתווך מתאים, נוכחות מושבות מעידה על אינטראקציות מוצלחות בין חיידקים לתאים מארחים.

בדיקת זיהום חיידקי לחקר אינטראקציות אנאירוביות בין חיידקים לתאים מארחים

מאמר זה מציג שני פרוטוקולים: האחד למדידת חיידקים אנאירוביים שיכולים לפלוש ולשרוד בהצלחה בתוך המארח, והשני לדמיין חיידקים אנאירוביים מקיימים אינטראקציה עם תאים מארחים. ניתן ליישם מחקר זה על כל אנאירובי הניתן לעיבוד וכל סוג תא אוקריוטי.

gingivalis Porphyromonas כאורגניזם מודל להערכת אינטראקציה של חיידקים אנאירוביים עם תאי מארח

האינטראקציה עם התרבות המשותף המוצגת בפרוטוקול זה היא זולה, תפוקה גבוהה ופשוטה. ניתן להשתמש בתנאים אלה כדי להתבונן באינטראקציות מיקרוביאלית בתרבות המשותף, לזהות דפוסי אינטראקציה, ולאפיין את הפוטנציאל המעונה של מאמץ מחיידקים של התעניינות במחלות אנושיות וסביבתיות.

התפוקה הגבוהה-שיתוף תרבות החברה לחקירת אינטראקציות מחיידקים

פרוטוקול הדמיה זה של תאים חיידקיים חיים מאפשר הדמיה של אינטראקציות בין מינים חיידקיים מרובים ברמת תא יחיד לאורך זמן. הדמיה של זמן-לשגות מאפשרת להתבוננות של כל מין חיידקי במונוקולטורה או coculture לחקור אינטראקציות בין מינים בקהילות חיידקים מרובי מינים, כולל תנוענות תאים בודדים וכדאיות.

הדמיה קינטית של אינטראקציות חיידקים בין-מינים חד-תאיים

פרוטוקול יעיל זה מפרט זרימת עבודה לזיהוי ותמונה של חיידקים בדגימות רקמות מורכבות, החל מתיקון הרקמה ועד להכתמת חיידקים עם פלואורסצנטיות בהכלאה במקום .

הדמיה של אינטראקציות מארחות מיקרוביוטה במעיים באמצעות פלואורסצנטיות בהכלאה במקום , כתמי לטין והדמיה

זיהוי של אינטראקציות פתוגן מארח-חיידקי המבוסס על דבקות פנוטיפית באמצעות הדמיית תיוג פלואורסצנטית בעלת תפוקה גבוהה יחד עם שיטות ניתוח סטטיסטיות אוטומטיות מאפשר הערכה מהירה של אינטראקציות חיידקיות פוטנציאליות עם תאים מארחים.

זיהוי אוטומטי בעל תפוקה גבוהה של דבקות חיידקית בתאים מארחים

שיטת הכנת דגימות חדשנית מודגמת לניתוח של מקרוקולוניות חיידקים מבוססות אגר באמצעות ספקטרומטריית מסה של הדמיית ספיחה / יינון בלייזר בסיוע מטריצה.

חקירת שיתוף פעולה מיקרוביאלי באמצעות ניתוח ספקטרומטריית מסות הדמיה של מושבות חיידקים הגדלות על אגר וברקמות במהלך זיהום

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את היישום של מודלים של רקמות אורגנוטיפיות לחקירת אינטראקציות מארח-פתוגן במבחנה. באופן ספציפי, מערכת המודל המתוארת משתמשת באפיתל אוראלי רב שכבתי החשוף למיקרואורגניזמים הקשורים לביופילמים (רובד שיניים) בהקשר של בריאות הפה לעומת מחלות.

מערכות מודל רקמות אורגנוטיפיות לחקירת אינטראקציות מארח-פתוגן במבחנה

אפיון של T-cell epitopes של פתוגנים הגורמים לזיהומים מקומיים, כגון נגיף הפפילומה האנושי, מהווה אתגר בשל מספרם המוגבל של תאי T במחזור הדם. בשיטה המתוארת, תאי T נדירים בודדו ואופיינו החל ממספר קטן מאוד של תאים.

השימוש באינטרפרון-γ Assay האנזים המקושר Immunospot לאפיין רומן T-cell אפיטופים של וירוס הפפילומה האנושי

למד לייצר חומרים ביומימטיים מחלבוני adhesins רקומביננטיים המצומדים לחלקיקי פוליסטירן לחקירת אינטראקציות חיידקים-מארח. שיטה זו מאפשרת ניתוח תרומת adhesins בודדים להידבקות ולציטוטוקסיות.

חומרי Biomimetic לאפיין אינטראקציות חיידקים-מארח

גלה סרטונים נוספים