חומרי Biomimetic לאפיין אינטראקציות חיידקים-מארח

המטרה הכוללת של הליך זה היא לייצר חומרים ביומימטיים המורכבים מהידבקויות רקומביננטיות טהורות, יחד עם חרוזי פוליסטירן, אשר לאחר מכן ניתן להשתמש בהם כדי לנתח את האינטראקציות הביוכימיות והתפקודיות בין הידבקויות חיידקים בודדות לקולטני תא מארח. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האינטראקציות של פתוגן מארח כגון מדידת ההשפעות על איתות תאי מארח ועיכוב ציטוטוקסיות מתווכת פתוגנים. היתרון העיקרי בטכניקה זו הוא שהידבקויות מטוהרות, AEAs מחוברות כיוונית וקוולנטית לחלקיקי פולימר הדומים בגודלם לחיידקים ובכך מחקים את תצוגת פני השטח של החיידקים.

מי שידגים איתי את ההליך יהיה דוקטורנט TU A-C-E-D-A מהמעבדה שלנו. צימוד כיווני של Thal אמין יודגם כאן. פרוטוקול זה מתאים לצימוד של חלבונים המכילים ציסטין לחרוזי פולימר פונקציונליים אמין באמצעות SUL succinyl עבור p meli phenyl butyrate, או SMPB כסוכן צולב, הכן את כל הריאגנטים הדרושים ממש לפני השימוש כמתואר בטקסט הפרוטוקול כדי להתחיל בהליך להפעלת חרוזים.

ערבב תרחיף חרוזים על ידי היפוך עדין ולאחר מכן העביר את הכמות הנדרשת של תרחיף חרוזים לצינור סטרילי של 1.5 מיליליטר. מכיל מיליליטר אחד של PBS סטרילי pH 7.0 פיפטה בעדינות למעלה ולמטה כדי לשטוף את החרוזים והגלולה על ידי צנטריפוגה במיקרו צנטריפוגה. ענק הסר בזהירות את החטף עם פיפטה וצלקת.

ריס תלה את כדור החרוזים במיליליטר אחד של PBS סטרילי טרי וחזור על שלב הכביסה. השעו מחדש את כדור החרוזים. ב-0.8 מיליליטר PBS מוסיפים 200 מיקרוליטר של 10 מילי-מולרי SFO SMPB טרי.

כדי לתת ריכוז סופי של שתי מילימולר, דגרו את מתלה החרוזים למשך שעה ב-25 מעלות צלזיוס על גלגל מסתובב בזמן שהחרוזים מודגרים. הכן את החלבון לשלב הצימוד הבא כך שניתן יהיה להוסיף אותו מיד לחרוזים המופעלים. בדוק את ריכוז החלבון והתאם אותו לריכוז הסופי הנדרש לתגובת הצימוד. שש.

מיקרוטולר של חלבון ו-PBS ונפח של מיליליטר אחד משמשים בדרך כלל להפחתת חלבון. הוסף תמיסת מלאי TEP כדי לתת ריכוז סופי של חמש מילימול טוחנות. דגרו את התמיסה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, שמרו כמה מיקרוליטרים מתמיסת החלבון לקביעת ריכוז החלבון הראשוני וחישוב יעילות הצימוד.

התחל את הליך צימוד החלבון על ידי כדור החרוזים המופעלים ושטיפת הגלולה. פעם במיליליטר אחד של PBS טרי וסטרילי, השעו מחדש את הגלולה בתמיסת החלבון המוכנה כדי לתת את ריכוז החלבון הרצוי. דגירה של תרחיף חרוזי החלבון למשך שעתיים ב-25 מעלות צלזיוס על גלגל מסתובב לאחר שעתיים, השבת את הקבוצות המופעלות הנותרות על החרוזים על ידי הוספת תמיסת מלאי סיסטינית לריכוז סופי של 50 מילימולר ודגירה לתלייה למשך 30 דקות ב-25 מעלות צלזיוס על גלגל מסתובב.

החזיק את החרוזים בצנטריפוגה. שמור את ה-snat לקביעת ריכוז החלבון וחישוב יעילות הצימוד. שטפו את כדור החרוז פעמיים עם מיליליטר אחד של PBS ו-Resus bend ו-1 מיליליטר של PBS טרי כדי לתת את המוצר הסופי יום לפני התחרות זרע כל באר של צלחת 24 בארות עם מיליליטר אחד של תאי הלה בריכוז של 150,000 תאים למיליליטר.

זה יאפשר לתאים להגיע לכ-80% שטף לפני תחילת הניסוי. חסנו תרבית LB ימית של חמישה מיליליטר עם מושבה טרייה של V para hemolytic וגידלו בן לילה בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס עם טלטול. הכן מספיק מולקולת הידבקות רב-ערכית מצומדת חרוזים כפי שהודגם קודם לכן.

אפשר 100 מיקרוליטר של 10 x מלאי חרוזים לבאר או ריכוז סופי של 500 חלבון ננו-מולרי ביום בדיקת התחרות. מדוד את ה-OD 600 של תרבית החיידקים. הכן אמצעי זיהום על ידי דילול תרביות חיידקים ל-DMM חסר צבע ללא תוספים.

מחממים מראש ל -37 מעלות צלזיוס המכילים 10% נפח לנפח מכה מתלה. כדי לתת MOI של 10, הכינו מיליליטר אחד לבאר ו-10 עד 20% נפח עודף לדגימה. מוציאים את המדיום הישן מהבארות ושוטפים את התרבות.

רפאו את התאים על ידי הוספת מיליליטר אחד של PBS סטרילי לכל באר ל-37 מעלות צלזיוס. הסר את ה-PBS והוסף מיליליטר אחד של מדיום זיהום לכל באר. הוסף תמיסות המכילות חרוזי בקרה וחיידקים כבקרות חיוביות וחרוזי הידבקות וללא חיידקים כשליליים. פקדים.

הוסף DMM המכיל 0.1% TRITTON X 100 כבקרות ליזה. הגדר כל תנאי ניסוי, כולל הפקדים משולשים. דגרו את הצלחת בחממת תרבית רקמות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הזמן הרצוי.

ציטוטוקסיות מוערכת. ארבע שעות לאחר ההדבקה. מוציאים 200 מיקרוליטר מכל באר המשמשת בצלחת 24 בארות ומעבירים לצלחת חדשה של 96 בארות.

סובבו את צלחת 96 הבאר בחום של 1,500 גרם למשך חמש דקות והעבירו 100 מיקרוליטר מכל באר לצלחת טרייה של 96 בארות. הוסף 100 מיקרוליטר של המדיה ששימשה במהלך ניסויי ההדבקה לשלוש בארות טריות של צלחת 96 הבארות שישמשו כריקים. בצע את בדיקת שחרור הלקטט דהידרוגנאז באמצעות ערכת זיהוי ציטוטוקסיות LDH וביצוע הוראות היצרן.

ראשית, חשב את כמות המגיב הדרושה במרווחים של 25. לדוגמא, עבור 100 דגימות. מערבבים 11.25 מיליליטר מגיב A עם 250 מיקרוליטר מגיב B הפוך כדי למנוע קצף אל תתערבולת.

לאחר מכן, הכניסו את התערובת למאגר. לאחר מכן מוסיפים 100 מיקרוליטר מתערובת המגיב לכל דגימה ומדגרים את הצלחת בטמפרטורת החדר ב -10, 20 ו -30 דקות. קרא את הספיגה ב-490 ננומטר בקורא צלחות.

לאחר מכן, חישוב אחוז הציטוטוקסיות כמתואר בכתב היד, מדידות של הידבקות חיידקים נעשות שעה לאחר ההדבקה. הסר את המדיה משכבת התא ושטוף היטב את שכבת התא עם PBS סטרילי חם מראש כדי להסיר תאים לא מחוברים. שטפו לפחות שלוש עד ארבע פעמים עם מיליליטר אחד של PBS בכל פעם ליסה לתאים מארחים על ידי הוספת מיליליטר אחד של תמיסת טריטון X 100 סטרילית לנפח של 1% ב-PBS דגרו על הצלחת ב-37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.

פיפטה כל דגימה למעלה ולמטה מספר פעמים לפני העברת התוכן של כל באר כל אחת להפרדה. צינורות 1.5 מיליליטר. הכן דילול סדרתי פי עשרה של הדגימות לצלחת PBS סטרילית, 100 מיקרוליטר מכל דגימה על אגר LB ימי ופזר באמצעות מפזר תאים מייעל את הדילול לצלחת בהתאם לזני החיידקים ונקודת הזמן למערך ניסיוני זה.

דילול של 10 עד החמישי או 10 עד הקיפול השישי ייתן מספר מתאים של CFUs. דגרו את הלוחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בלילה למחרת, וספרו חיידקים לפי ספירת מושבות. במבחני תחרות, תאי הילה נדבקו בזן V para hemolytic.

מסכן אחד שצוין כחיובי או נותר לא נגוע בנוכחות ישויות מתחרות שונות. זיהום במבחנה עם אחד גרוע הביא לרמות גבוהות מאוד של ליזיס תאים אשר עוכב על ידי MAM שבעה חרוזים מצומדים, אך לא MA'AM אחד מצומד או חרוזים מצומדים GST. ספירה של שיתוק v המחובר לתאי HELOC לא מטופלים או לתאים שהודגרו עם MAM.

שבעה חרוזי בקרת MAM אחד או GST גילו כי MAM. שבעה חרוזים אבל לא MAM אחד או חרוזי בקרת GST. גבר על v para hemolytic על התקשרות לקולטני פני השטח של התא המארח.

הידבקויות בשילוב עם פלואורו. ארבעה חרוזים מסומנים יכולים לחקות הידבקות חיידקים לתאים מארחים ומהווים כלים רבי עוצמה להדמיה תאית. הצינור מימין מכיל תרחיף של חרוזים ביומימטיים כחולים פלואורסצנטיים. אמא.

שבעה חרוזים כחולים פלואורסצנטיים מצומדים שימשו לאפיון תהליך ההתקשרות המתווכת של MAM לתאי אפיתל. הצמדת MAM 7 לתאי המארח הביאה לסידור מחדש של אקטין ויצירת סיבי מתח אשר הודגמו במשותף באמצעות רומין פין כדי לצבוע עבור f אקטין. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו טיהור זיקה יחד עם פרוטאומיקה או כתם מערבי על מנת לענות על שאלות נוספות כגון אילו גורמים תאיים מארחים מעורבים בתהליכי איתות במורד הזרם של התקשרות חיידקית.