מדידת pH Phagosome ידי ratiometric מיקרוסקופ פלואורסצנטי

המטרה הכוללת של סדרת ניסויים זו היא למדוד pH פאקו סומלי בתאים חיים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מטרית יחסית. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של פגוציטים, כגון זיהוי מולקולות מפתח באינטראקציות עם פתוגנים או ההשפעה של שיבוש גנטי או תרופות על פגוציטוזיס. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שבניגוד לשיטות מבוססות אוכלוסייה כגון עובדות או השפעות ספקטרוסקופיה, כגון שינויים בנדידת קשירת חלקיקים, או בהטרוגניות של הפאגוזומים הבודדים.

ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על הטיפולים שלנו נגד אורגניזמים כימיים פתוגניים מכיוון שרבים מהמיקרואורגניזמים האלה יכולים לשנות את ה-pH של פרגוסו כדי למנוע הסחת דעת בתוך פגוזומים. כדי להתחיל בהליך זה, הוסף 20 מיליגרם של קסאן מיובש ל -10 מיליליטר מערבולת PBS סטרילית וחמם באמבט מים רותחים למשך 10 דקות. ואז מצננים וצנטריפוגה בחום של 2000 גרם למשך חמש דקות.

לאחר מכן, הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את ה-Xan במיליליטר אחד של PBS. סוניקציה למשך 10 דקות באמבט מים. לאחר מכן סוניקט מעביר 500 מיקרוליטר של ה-Xan המרחף לשני צינורות של 1.5 מיליליטר ומצנטריפוגה אותם ב-11,000 Gs למשך חמש דקות.

חזור על הכביסה עם 500 מיקרוליטר PBS. לאחר מכן שטפו את ה-Xan פעמיים ב-500 מיקרוליטר של תמיסת נתרן פחמתי טרייה של 0.1 מולרית ב-pH 9.3 והשעיה מחדש ב-490 מיקרוליטר של תמיסת נתרן פחמתי לאחר הכביסה הסופית. לאחר מכן, הוסף 10 מיקרוליטר של FZ מומס ב-DMSO ב-10 מיליגרם למיליליטר למערבולת Xan.

מכסים בנייר כסף ודוגרים בתסיסה במשך ארבע שעות בטמפרטורת החדר כדי להסיר את העין הלא קשורה יש לשטוף תחילה עם 0.5 מיליליטר DMSO בתוספת 150 מיקרוליטר PBS, כולל סוניקציה בין שלבי הכביסה. הכביסה הבאה עם 0.5 מיליליטר DMSO בתוספת 300 מיקרוליטר PBS, ואז שטיפה עם 0.5 מיליליטר DMSO בתוספת 450 מיקרוליטר PBS ואחריה PBS בלבד. לאחר מכן, הוסף מיקרוליטר אחד של Xan ל -500 מיקרוליטר PBS ומערבולת.

לאחר מכן הוסף 10 מיקרוליטר של חול xma מדולל לקצה תא הציטומטר ההמו שבו הוא פוגש את החלקת הכיסוי, הרכיב את ההמו ציטומטר על מיקרוסקופ שדה בהיר המצויד במטרה של פי 20. התמקדו בפינה השמאלית העליונה המכילה 16 ריבועים, וספרו את כל חלקיקי חול חג המולד באזור זה. בעזרת מונה ספירת ידיים, חזור על ההליך בפינה הימנית התחתונה.

לאחר מכן חשב את ריכוז ה-Xan באמצעות משוואה זו. לאחר מכן, הפעילו את ה-Xan המסומן עם נוגדן כלבת נגד Xan במערבולת דילול של 1 עד 100 ודגרו על הדגימה למשך שעה באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן ספרו את חול חג המולד באמצעות ציטומטר המו ואז מדולל ל -100 כפול 10 לחלקיקים השישיים למיליליטר.

לאחר בידוד הנויטרופילים העיקריים של העכבר, הוסף פעמיים פי 10 עד חמישית של נויטרופילים למרכז צלחת תחתית זכוכית של 35 מילימטר. לאחר מכן מורחים את הטיפה על ידי הוספת 50 מיקרוליטר של מדיום ומודגרים בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות כדי לאפשר לתאים להידבק. לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד של HBSS חם ל-37 מעלות צלזיוס המכיל מעכב מיאלו פרוקסידאז.

הרכיבו את הצלחת על מיקרוסקופ פלואורסצנטי בשדה רחב, מצויד במערכת חימום של 37 מעלות צלזיוס ומטרת שמן פי 40. דגרו על התאים ללא הדמיה למשך 10 דקות כדי לאפשר לתאים ולציוד להתאזן. לאחר מכן, התאם את הגדרות המיקרוסקופ כדי לקבל תמונת שידור שדה בהיר עם עירור של 440 ננומטר או 490 ננומטר ופליטה של 535 ננומטר כל 30 שניות.

לאחר שתי דקות מוסיפים 10 כפול 10 לחול הפיטזי זי שש למרכז המנה, וממשיכים בהדמיה למשך 30 דקות. לאחר 30 דקות, הפסק את רכישת קיטועי הזמן והפעל טיימר. הזז את הבמה וצלם 10 תמונות או יותר בשדות ראייה שונים כדי לדמות אזורי וואגה אחרים תוך חמש דקות.

בהליך זה יש להפשיר את תמיסות הכיול ולחמם ל -37 מעלות צלזיוס באמבט מים. בדוק את ה- pH עם מד pH ורשום אותו. לאחר מכן, התקן משאבה פריסטלטית על צלחת הזכוכית התחתונה לפני רכישת התמונה.

לאחר מכן בצע מיקרוסקופ וידאו חי בתום תקופת הרכישה של 30 דקות. הפעל את המשאבה כדי להסיר את התמיסה בכלי. לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד מתמיסת הכיול הראשונה ועצור את המשאבה.

המתן חמש דקות עד שהאות יתייצב. חזור על ההליך עם כל פתרון כיול. כדי לנתח את סרטי דולג הזמן ותצלומי הפגוזום, פתח את התמונות עם תמונה J.הפחת את הרקע בערוץ 490 על ידי ציור החזר ROI מרובע קטן באזור ללא תאים.

שימוש בכלי בחירת מצולע מרובע ולחיצה על תוספים. ואז חיסור BG לאחר מכן. העלה את אותו החזר ROI בערוץ 440 על ידי לחיצה על ערוך.

לאחר מכן הבחירה ואחריה שחזור הבחירה וחזור על הליך חיסור הרקע. צרו תמונה עם יחס של 32 סיביות של ערוץ 490 חלקי ערוץ 440 בתהליך הלחיצה הראשונה. ואז מחשבון תמונה.

לאחר מכן, בחר את התמונות המתאימות בתפריטים הנפתחים תמונה אחת ותמונה שתיים. בחר חלוקה בתפריט הנפתח של הפעולה וסמן את תיבת הסימון תוצאה של 32 סיביות. לאחר מכן, שנה את טבלת החיפוש של קידוד הצבעים לקידוד צבע תואם יחס על ידי לחיצה על תמונה ולאחר מכן למעלה טבלאות.

ואז קשת RGB. קבעו סף לתמונת יחסי הגודל כדי לבטל אפס ואינסוף פיקסלים בלחיצה על התמונה. לאחר מכן התאם ואחריו סף.

כוונן את פסי הגלילה כך שה-Xan יופיע באדום ולחץ על החל, וודא שתיבת הסימון הגדר פיקסלים ברקע ל-nan נבחרה. אם ערכי אות רקע ואות Xan מייצרים ערכי יחס דומים מאוד וכתוצאה מכך תמונה עם יחס רעש, הוסף בחזרה כמות קטנה של רקע לערוץ 440 על ידי לחיצה על תהליך. ואז מתמטיקה.

לאחר מכן הוסף ולאחר מכן צור מחדש את תמונת היחס כדי לקבל תוצאה נקייה יותר. לחלופין, השמיט את חיסור הרקע של 440 ערוצים. לאחר מכן, שלבו ערימת יחסי גודל זו עם ערוץ שדה בהיר לתוך קומפוזיציה רב-ערוצית בלחיצה על צבע תמונה.

לאחר מכן מיזוג ערוצים. בחר את תמונת השדה הבהיר בתפריט הנפתח של הערוץ האפור ואת תמונת היחס בתפריט הנפתח של הערוץ הירוק. לאחר מכן בחר בתיבת הסימון שמור תמונות מקור.

לאחר מכן, סרוק את סרטי ה-Time-lapse או התמונות המשווים את ערוצי השדה הבהיר והיחס כדי לקבוע אילו פגוזומים יש לנתח, צייר החזר ROI סביב הפאגוזומים באמצעות כלי בחירת המצולע הסגלגל והוסף אותם למנהל ה-ROI על ידי לחיצה על כלי ניתוח. לאחר מכן מנהל החזר ROI, ואחריו הוסף לאחר מכן מדוד את יחס עוצמת ה-Xan שלהם על ידי לחיצה על עוד רב מדידה ובטל את הבחירה בתיבת הסימון שורה אחת לכל פרוסה. לסרטים בהילוך מהיר.

עקוב אחר אזורי ה-FGA בזה אחר זה על ידי ציור בקרה מסוג ROI M כדי למדוד כל נקודת זמן ולהזיז את ההחזר על ההשקעה בעת הצורך כדי לעקוב אחר ערכי העוצמה לאורך זמן. לאחר מכן העתק את המדידות מחלון התוצאות לגיליון אלקטרוני כדי להמיר פלואורסצנטיות לערכי pH. לאחר מדידת היחס של 490 עד 440 עבור פגוזומים בסרטוני הכיול בהילוך מהיר בגיליון אלקטרוני, שרטטו את ערכי היחס לאורך זמן.

לאחר מכן חשב את ערכי היחס הממוצעים עבור כל הפאגוזומים בשדה הראייה בחמש נקודות זמן באמצע פרק הזמן המתאים לכל תמיסת כיול pH. שרטט את ערכי היחס הממוצעים הללו של 490 עד 440 מול ה-pH הנמדד בפועל על ידי שילוב של לפחות שלושה כיולים עצמאיים לגרף יחיד. לאחר מכן בצע ניתוח רגרסיה לא ליניארית על מנת לקבל משוואה להפיכת ערכי היחס ל-pH.

איור זה מראה כיצד מבחינים בין הפאגוזומים לבין הקסאן שנבלע. הפאנל השמאלי מציג תמונת שדה בהיר ממוזגת ויחס של 490 עד 440 פיץ זי. ואילו הפאנל הימני מציג את תמונת השדה הבהיר בלבד.

ניתן להבחין בין פגוזומים לבין החלקיקים החיצוניים שאינם מתמקמים עם תאים או שהפלואורסצנטיות שלהם אינה תואמת למרכז כהה המוקף בטבעת בהירה יותר האופיינית לפאגוזומים בתמונת השדה הבהיר המוצגת. להלן מסלולי הזמן האופייניים לסוג פראי ו- HV CN נוקאאוט אחד נוקאאוט נוטרופילים FGA אומל pH בנויטרופילים מסוג בר, ה- pH הנייטרלי או מעט אלקליין בנקודות זמן מוקדמות לאחר הבליעה, הפאגוזומים של נויטרופילים HV CN one knockout יכולים להיות הידור אלקליין או חומצי. תמונות שצולמו 30 עד 35 דקות לאחר הוספת המטרות מאפשרות לחשב את ה-pH הממוצע של האוכלוסייה ממספר רב של פגוזומים בהיסטוגרמות של יחסי Fitz Xan המוצגים כאן.

יכולנו לראות את ההבדלים ב-pH הקטן בין סוג פרא ל-HVCN נויטרופילים נוקאאוט אחד לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שש שעות. החל משלב האופטימיזציה בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור למטב את תנאי ההדמיה. ראשית, אופטימיזציה של ריכוז הנוגדנים לשלב האופטימיזציה יכולה גם להועיל כדי להבטיח פגוציטוזיס חזק בעקבות הליך זה.

ניתן לבצע שיטות אחרות כמו מדידת ייצור רוס או מדידת הרג חיידקים על מנת לענות על שאלות נוספות כמו האם רוס קטן או יכולתו של הפגוזום להרוג חיידקים משתנה יחד עם ה-pH לאחר התפתחותו. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה של פגוציטים לחקור אילו גורמים משפיעים על יכולתם של תאים פגוציטים להרוג או לעבד את החומרים הנבלעים כדי לעורר תגובות חיסוניות נוספות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע מיקרוסקופיה פלואורסצנטית גיאומטרית על מנת למדוד פרמטרים פיזיולוגיים של פגוזומים בזמן אמת בתאים חיים.

אל תשכח שעבודה עם מעכבי UNIFOR ותאים חיים עלולה להיות מסוכנת ביותר, ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון לבישת כפפות בעת ביצוע הליך זה.