Name: Microdissection לייזר לכידתו של אדם הערמונית האפיתל לניתוח RNA (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: למד מיקרוכירורגיה לייזר לבידוד RNA מאוכלוסיות טהורות של תאים אפיתליים בערמונית מרקמות קפואות הטרוגניות. שיטה זו מאפשרת ניתוח ביטוי גנים במחקר סרטן הערמונית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לד"ר ויקי מסיאס, אנג'לין ג'יאנגריקו ואוואני וישנב על הסיוע באופטימיזציה של מתודולוגיה זו לאורך השנים וליאנג ז'אנג וד"ר ג'יאן מא מאוניברסיטת אילינוי באורבנה-שמפיין על ניתוח רצף ה-RNA. עבודה זו נתמכה על ידי NIH/NCI R01 CA166588-01 (Nonn), חוקר מחקר של האגודה האמריקאית לסרטן 124264-RSG-13-012-01-CNE (Nonn), NIH/NCI R03 CA172827-01 (Nonn), DOD-CDMPR PRCP Health Disparities Idea Award PC121923 (Nonn) ומענק הקרן למניעת סרטן (Zhou).

<ol><li>Schauer, I. G., Rowley, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+role+of+reactive+stroma+in+benign+prostatic+hyperplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">The functional role of reactive stroma in benign prostatic hyperplasia.</a> Differentiation. 82, 200-210 (2011).</li>
<li>Peehl, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cell+cultures+as+models+of+prostate+cancer+development%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine-related+cancer%22%5BJournal%5D)">Primary cell cultures as models of prostate cancer development.</a> Endocrine-related cancer. 12, 19-47 (2005).</li>
<li>McNeal, J. E., Haillot, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+spread+of+adenocarcinoma+in+the+prostate+as+related+to+cancer+volume%5BTitle%5D)+AND+%22The+Prostate%22%5BJournal%5D)">Patterns of spread of adenocarcinoma in the prostate as related to cancer volume.</a> The Prostate. 49, 48-57 (2001).</li>
<li>Nonn, L., Vaishnav, A., Gallagher, L., Gann, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+and+micro-RNA+expression+analysis+in+laser-capture+microdissected+prostate+biopsies%3A+valuable+tool+for+risk+assessment+and+prevention+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+and+molecular+pathology%22%5BJournal%5D)">mRNA and micro-RNA expression analysis in laser-capture microdissected prostate biopsies: valuable tool for risk assessment and prevention trials.</a> Experimental and molecular pathology. 88, 45-51 (2010).</li>
<li>Long, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+transcriptome+analysis+of+formalin-fixed+prostate+cancer+specimens+identifies+biomarkers+of+disease+recurrence%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Global transcriptome analysis of formalin-fixed prostate cancer specimens identifies biomarkers of disease recurrence.</a> Cancer research. 74, 3228-3237 (2014).</li>
<li>Long, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-coding+and+microRNA+biomarkers+of+recurrence+of+prostate+cancer+following+radical+prostatectomy%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Protein-coding and microRNA biomarkers of recurrence of prostate cancer following radical prostatectomy.</a> The American journal of pathology. 179, 46-54 (2011).</li>
<li>Giangreco, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+and+regulation+of+vitamin+D+hydroxylases+and+inflammatory+genes+in+prostate+stroma+and+epithelium+by+1%2C25-dihydroxyvitamin+D+in+men+with+prostate+cancer+and+an+in+vitro.+model%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+steroid+biochemistry+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Differential expression and regulation of vitamin D hydroxylases and inflammatory genes in prostate stroma and epithelium by 1,25-dihydroxyvitamin D in men with prostate cancer and an in vitro. model.</a> The Journal of steroid biochemistry and molecular biology. , (2014).</li>
<li>Giangreco, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+suppressor+microRNAs%2C+miR-100+and+-125b%2C+are+regulated+by+1%2C25-dihydroxyvitamin+D+in+primary+prostate+cells+and+in+patient+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+prevention+research%22%5BJournal%5D)">Tumor suppressor microRNAs, miR-100 and -125b, are regulated by 1,25-dihydroxyvitamin D in primary prostate cells and in patient tissue.</a> Cancer prevention research. 6, 483-494 (2013).</li>
<li>Mihelich, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-183-96-182+cluster+is+overexpressed+in+prostate+tissue+and+regulates+zinc+homeostasis+in+prostate+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">miR-183-96-182 cluster is overexpressed in prostate tissue and regulates zinc homeostasis in prostate cells.</a> The Journal of biological chemistry. 286, 44503-44511 (2011).</li>
<li>Bevilacqua, C., Makhzami, S., Helbling, J. C., Defrenaix, P., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintaining+RNA+integrity+in+a+homogeneous+population+of+mammary+epithelial+cells+isolated+by+Laser+Capture+Microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Maintaining RNA integrity in a homogeneous population of mammary epithelial cells isolated by Laser Capture Microdissection.</a> BMC cell biology. 11, 95(2010).</li>
<li>Gregg, J. L., Brown, K. E., Mintz, E. M., Piontkivska, H., Fraizer, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+gene+expression+in+prostate+cancer+epithelial+and+interstitial+stromal+cells+using+laser+capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+cancer%22%5BJournal%5D)">Analysis of gene expression in prostate cancer epithelial and interstitial stromal cells using laser capture microdissection.</a> BMC cancer. 10, 165(2010).</li>
<li>Hart, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+microRNA+profiling+of+prostate+carcinomas+with+increasing+tumor+stage+by+deep+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cancer+research+%3A+MCR%22%5BJournal%5D)">Comparative microRNA profiling of prostate carcinomas with increasing tumor stage by deep sequencing.</a> Molecular cancer research : MCR. 12, 250-263 (2014).</li>
<li>Smalheiser, N. R., Lugli, G., Thimmapuram, J., Cook, E. H., Larson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+siRNAs+and+noncoding+RNA-derived+small+RNAs+are+expressed+in+adult+mouse+hippocampus+and+are+up-regulated+in+olfactory+discrimination+training%5BTitle%5D)+AND+%22Rna%22%5BJournal%5D)">Endogenous siRNAs and noncoding RNA-derived small RNAs are expressed in adult mouse hippocampus and are up-regulated in olfactory discrimination training.</a> Rna. 17, 166-181 (2011).</li>
<li>Song, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+profile+analysis+of+microRNAs+in+prostate+cancer+by+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22The+Prostate%22%5BJournal%5D)">Expression profile analysis of microRNAs in prostate cancer by next-generation sequencing.</a> The Prostate. 75, 500-516 (2015).</li>
<li>Deng, M. Y., Wang, H., Ward, G. B., Beckham, T. R., McKenna, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+six+RNA+extraction+methods+for+the+detection+of+classical+swine+fever+virus+by+real-time+and+conventional+reverse+transcription-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+veterinary+diagnostic+investigation+%3A+official+publication+of+the+American+Association+of+Veterinary+Laboratory+Diagnosticians%2C+Inc%22%5BJournal%5D)">Comparison of six RNA extraction methods for the detection of classical swine fever virus by real-time and conventional reverse transcription-PCR.</a> Journal of veterinary diagnostic investigation : official publication of the American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians, Inc. 17, 574-578 (2005).</li>
<li>Kong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+short+amplicons+in+FFPE-derived+long-chain+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of short amplicons in FFPE-derived long-chain RNA.</a> Scientific reports. 4, 7246(2014).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

ביטוי גני פרופיל מדגימות אנושיות יכול להיות מאתגר, לא רק לאיכות או כמות הרקמה זמינה, אלא גם לגופים היסטולוגית השונים קיימים בדגימת רקמה נתון. זה מאתגר במיוחד בערמונית שבו רקמות שפירות הן במידה רבה רקמות ואזורים של סרטן סטרומה הן נטולי סטרומה. LCM מאפשר הפרדה פיזית של סטרומה הערמונית ו- RNA האפיתל לחתימה מדויקת יותר של שני סוגי התאים השונים (איור 1 א). בהשוואה לmacrodissection או עיבוד רקמות שלם, LCM יכול להפריד תאי תאים ברקמות שפירות, אך באופן משמעותי יותר יקר ועב...

בלוטת הערמונית היא רקמה הטרוגנית מורכבת מאפיתל ההפרשה מסודר בacini בלוטות מוקפים stroma fibromuscular מורכב בעיקר של שריר חלק 1. תא אפיתל מורכב מחמישה סוגי תאים שונים, אך מאורגנים: תאי בסיס, תאי הפרשה, תאים נוירואנדוקריניים, תאי הגברת מעבר ותאי גזע 2. בסרטן הערמונית (PCA), הנובע מתאי אפיתל luminal, הצמיחה של אדנוקרצינומה גורמת ירידה הדרגתית מאליי של תא סטרומה 3. מסיבות אלה, יהיו דגימות רקמת הבדלים ברורים בשיעור של סטרומה וסוג תא אפיתל המבוסס על היקף PCA. הבדלים אלה יכולים להוביל להנחות מגמתיות של נתונים ביטוי גנים שנרכשו מכל רקמות ללא קשר לmicrodissection של סוג התא הרצוי. לכן, כדי להסיר הטיה זו היא חיוני על מנת להפריד בין סוגי תאים לפני מיצוי RNA וניתוח ביטוי גנים. Macrodissection או microdissection ניתן להשתמש כדי להפריד פיזי אזורי אפיתל מאופיינים היטב מסטרומה סביב 4 -6. Macrodissection נעשה בדרך כלל בסכין גילוח תחת מיקרוסקופ לנתח ועובד היטב להפרדת PCA הגדולה גושים מסטרומה, אבל הוא לא מסוגל להסיר אפיתל השפיר מסביב סטרומה (ראה דוגמא של היסטולוגיה ערמונית שפירה באיור 1). Microdissection עם לייזר (LCM) הוא באופן משמעותי יותר מאשר עבודה אינטנסיבי macrodissection, אבל מאוד מדויק יכול לנתח אפיתל השפיר 4. הפרסומים אחרונים מהמעבדה שלנו הראו כי RNA ניתן לחלץ בהצלחה על ידי LCM משתי ביופסיות-קבוע פורמלין מוטבע פרפין (FFPE) או רקמה קפוא 4,7-9. האתגרים המרכזיים בחילוץ LCM-רנ&quot;א הם 1) לנתח במדויק את האזורים הרצויים של הרקמה, ו- 2) לשמר Rשלמות NA במהלך 4,10 תהליך LCM והבידוד. RNA מבודד מאוכלוסיות תאים טהורות יכול לשמש לניתוח ביטוי גנים על ידי מספר שיטות כולל הפוך-שעתוק PCR כמותי (RT-qPCR) 7,8, microarray 11, ו-sequencing העמוק 12-14. המטרה של פרוטוקול זה היא לבודד RNA הכולל מהאפיתל של הערמונית LCM מהרקמה קפוא לביטוי גנים במורד הזרם מנתח.

<table><tbody><tr><td>RNase-AWAY&nbsp;</td><td>MBP</td><td>7005-11</td><td></td></tr><tr><td>PEN-ממברנה 4.0 מ"מ שקופיות&nbsp;</td><td>Leica</td><td>11600289</td><td></td></tr><tr><td>זכוכית שקופיות, Superfrost Plus</td><td>FisherBrand</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>אתנול 200 הוכחה</td><td>מעבדות דקון.</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>DEPC (דיאתיל פירוקרבונט)</td><td>Sigma</td><td>D-5758</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM3050</td><td></td></tr><tr><td>קופלינס (צנצנת צביעה)</td><td>IHCWORLD</td><td>M900-12</td><td></td></tr><tr><td>קופלינס (מתלה צביעה)</td><td>IHCWORLD</td><td>M905-12</td><td></td></tr><tr><td>Aperio ScanScope</td><td>Aperio (Leica)</td><td>ScanScope&reg; </td><td></td>CS</tr><tr><td>Toluidine Blue</td><td>Fluka</td><td>89640-5G</td><td></td></tr><tr><td>מערכת מיקרו-דיסקציה לייזר</td><td>Leica</td><td>LMD7000</td><td></td></tr><tr><td>0.5 מ"ל צינורות בעלי קירות דקים עבור LCM</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-0350</td><td></td></tr><tr><td>RNAqueous&reg;-Micro Total RNA בידוד ערכת Ambion</td><td></td><td>AM1931</td><td>Thermo Fisher Scientific מותג</td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0 Fluorometer</td><td>Life Technologies</td><td>Q32866</td><td>Thermo Fisher Scientific מותג</td></tr> ערכת <tr><td>שעתוק הפוך cDNA בקיבולת גבוהה Applied</td><td>Biosystems</td><td>4368814</td><td>Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Brand ערכת סינתזה cDNA אוניברסלית II, 8-64 rxns</td><td>Exiqon</td><td>203301</td><td></td></tr><tr><td>ערכת TaqMan microRNA RT Applied</td><td>Biosystems</td><td>4366597</td><td>Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>מותג כתם המטוקסילין&nbsp;</td><td>חברת ריקה כימיקלים</td><td>3536-16</td><td></td></tr><tr><td>Eosin-Y</td><td>ריצ'רד אלן סיינטיפיק&nbsp;</td><td>7111</td><td></td></tr></tbody></table>

microdissection לייזר לכידתו של אדם הערמונית האפיתל לניתוח rna

Laser-capture Microdissection of Human Prostatic Epithelium for RNA Analysis

בלוטת הערמונית מכילה סביבה הטרוגנית של סוגי תאים סטרומליים, אפיתליים, נוירואנדוקריניים וחיסוניים. ערמונית בריאה מורכבת מסטרומה פיברו-שרירית המקיפה לומנים מפרישים בדידים מרופדים באפיתל ואוכלוסייה קטנה מאוד של תאים חיסוניים ונוירואנדוקריניים. לעומת זאת, באזורים של סרטן הערמונית יש אפיתל לומינלי דיספלסטי מוגבר עם אוכלוסיית סטרומה מופחתת מאוד או נעדרת. בהתחשב בהבדל העמוק בין סוגי תאי סטרומה ואפיתל, חובה להפריד בין סוגי התאים לכל סוג של ניתוח מולקולרי במורד הזרם. למרות ידע זה, עיקר מחקרי ביטוי הגנים משווים ערמונית שפירה לסרטן ללא מיקרו-דיסקציה, מה שמוביל להטיית סטרומה בדגימות השפירות. מיקרו-דיסקציה לכידת לייזר (LCM) היא שיטה יעילה להפרדה פיזית בין סוגי תאים שונים מקטע דגימה. מטרת פרוטוקול זה היא להראות שניתן לבודד בהצלחה RNA מאפיתל ערמונית אנושי שנאסף על ידי LCM ולהשתמש בו למחקרי ביטוי גנים במורד הזרם כגון RT-qPCR ו-RNAseq.

במחקר קודם שהראינו את השימוש של LCM לאסוף רקמות אפיתל וסטרומה להשוות פרופיל ביטוי על ידי RT-qPCR של mRNA ומייקרו RNA מרקמות ערמונית קפוא וFFPE מאותו החולה 4. LCM זמן רב, במיוחד אם כמות גדולה של RNA היא שתיגבה עבור ניתוח רצף של הדור הבא. לכן, חשוב לשמור על מרחב העבודה והכלים RNase חופשיים. מומלץ לבחון בקרות איכות ותא-סגוליות בRNA שנאסף (דן בפירוט רב יותר בסעיף הבא). איור 1 מציג קטע ערמונית מוכתם בשקופית PEN-מסגרת מתחת למיקרוסקופ לפני ואחרי אפיתל השפיר לכ...

מטרת פרוטוקול זה היא להשתמש במיקרו-דיסקציה של לכידת לייזר כשיטה יעילה לבידוד אוכלוסיות טהורות של סוגי תאים מרקמות ערמונית הטרוגניות לצורך ניתוח RNA במורד הזרם.

Microdissection לייזר לכידתו של אדם הערמונית האפיתל לניתוח RNA

The prostate gland contains a heterogeneous milieu of stromal, epithelial, neuroendocrine and immune cell types.  Healthy prostate is comprised of ...

המטרה הכללית של פרוטוקול מיקרו-דיסקציה בשבירת לייזר (Laser Capture Microdissection) זה היא לבודד RNA כולל מאוכלוסיות טהורות של סוגי תאי אפיתל פרוסטטיים מרקמות פרוסטטה קפואות והטרוגניות, לצורך ניתוחים להמשך של ביטוי גנים. שיטה זו יכולה לסייע בניתוח דגימות של מטופלים ובמענה על שאלות מפתח בתחום המחקר של סרטן הפרוסטטה, כגון כיצד נבדל ביטוי ה-RNA בדגימות רקמת אפיתל פרוסטטית שפירה לעומת רקמה חולה, או בדגימות מניסויים קליניים. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שמיקרו-דיסקציה בשבירת לייזר מאפשרת בידוד RNA של אוכלוסיות הומוגניות של תאי אפיתל או תאי סטרומה מרקמת פרוסטטה קפואה.בדרך כלל, אנשים שאינם בקיאים בשיטה זו יתקשו להשיג RNA באיכות גבוהה, כיוון שאינם יודעים אילו שלבים הם קריטיים לשמירה על ה-RNAs. תנאים נטולים RNase. התחילו באיסוף כל הרכיבים והכלים הדרושים לפרוצדורה. לאחר שהמתנתם לרקמת ערמונית קפואה להגיע לשיווי משקל בתוך הקריוסטט במשך 30 דקות, התיזו תווך עיגון לתחתית הקסטה והעבירו במהירות את הרקמה באמצעות פינצטה מקוררת.הניחו את הקסטה במקרר של הקריוסטט למשך חמש דקות כדי לקבע את מדיום הקיבוע. לאחר שהמדיום התקשב, התיזו מדיום קיבוע קפוא על הצ'אק והצמידו בזהירות את הרקמה המקובעת לתוכו. הצד התחתון פונה כלפי מעלה.המתינו חמש דקות להתייצבות התכשיר. לפני השמת הצ'אק (chuck) לתוך התומך, נעלו את הידית למקומה והכניסו להב חדש לקריוסטט. לאחר שחרור הידית, הזיזו בזהירות את הדגימה עד להגעה לחשיפה הרצויה של הרקמה.כאשר המכשיר מוכן, כוון את הקריוסטט לחמישה מיקרון וגזור פרוסה אחת או שתיים. הנח פרוסות אלו על שקופית זכוכית טעונה לצביעה ב-hematin and eoin. העבר מיד את השקופית לאתנול 100% קר למשך שתי דקות.לאחר זמן זה, הוציאו את השקופית והניחו לה להתייבש בטמפרטורת החדר. השקופית שנצבעה ב-h ו-d מספקת ויזואליזציה טובה יותר של מרקמים גרעיניים ויש להשתמש בה על ידי הפתולוג כדי לסמן את האזורים הרלוונטיים. לאחר מכן, הניחו מסגרת עט בטמפרטורת החדר.החליקו את הדגימה אל תוך תומך מסגרת, כוון את הקריוסטט ל-10 מיקרונים והכינו חתכים. ניתן להניח בין חתך אחד לארבעה על כל שקופית, בהתאם לגודל הרקמה. טבלו מיד את השקופית ב-100% ethanol קר.הוציאו את השקופית לאחר שתי דקות ואחסנו אותה במקפיא לניתוח מאוחר יותר. באותו יום שבו תבוצע המיקרו-דיסקציה בלייזר (laser capture microdissection), הוציאו את שקופיות מסגרת העט מהמקפיא בעבודה באזור נקי מ-RNA. הידרו את השקופיות על ידי טבילה עדינה ב-90%ethanol למשך שתי דקות, ולאחר מכן ב-75%ethanol למשך שתי דקות.לאחר ההידרציה, צבעו את רקמת הערמונית על ידי טבילה עדינה של השקופיות ב-0.5% тоine blue למשך חמישה עד 30 שניות. הסירו את הצבע מהרקמה על ידי שטיפת השקופיות פעמיים במים מזוקקים למשך 15 שניות, ולאחר מכן ב-75% ethanol למשך 30 שניות עד שלוש דקות. לבסוף, העבירו את השקופיות למכל ייבוש נקי מ-RNA על קרח.לפני תחילת הפרוצדורה, הניחו שקופית לייבוש על מחמם שקופיות למשך 15 דקות. ייבשו רק את השקופית שעליה תבוצע העבודה ואת השאר אחסנו על קרח עד לשימוש. הפעילו את רכיבי ה-LCM לפי הסדר הבא.ספק כוח למיקרוסקופ, מפתח הלייזר, מתג הלייזר, ולאחר מכן את המחשב. כעת, הפעל את תוכנת המיקרודיסקציה הלייזרית באמצעות התוכנה. הנחה את המיקרוסקופ לטעון את השקופיות ואת מבחנות האיסוף.לחצו על unload sample holder והניחו את השקף על תומך השקפים כאשר הרקמה פונה כלפי מטה. הכניסו את תומך השקפים לחריץ המתאים במיקרוסקופ ולחצו על continue. לאחר מכן, לחצו על unload collection tubes.סמנו והעמיסו את המבחנות על מעמד המבחנות והכניסו אותן לחריץ המתאים. סגרו את המכסים היטב והוסיפו 35 µL של תמיסת ליזיס, תוך הקפדה להימנע מהיווצרות בועות.לאחר טעינת מכסי האיסוף, לחץ על אישור. השתמש בתוכנה כדי לבחור את מיקום השקופית במחזיק, ולאחר מכן בחר את מכסה האיסוף כדי לאסוף את הדגימה. בצע ויזואליזציה וכוונון פוקוס של השקופית דרך המחשב בהגדלה של 10x.השתמש בתוכנה כדי לכלול את הלייזר על ידי בחירה ב-laser. לאחר מכן בצע כיול (calibrate), כוון את העוצמה (power), המפתח (aperture) ומהירות הלייזר על ידי בחירה ב-laser ולאחר מכן ב-control. המשך לבצע התאמות עד שהלייזר יחתוך את הרקמה באופן מלא.חיוני להגדיר את האזורים הרלוונטיים, פעולה המבוצעת בדרך כלל על ידי פתולוג מוסמך, כדי להוציא במדויק את האזורים הרצויים מהרקמה העוברת LCM, תוך שימוש בסימון הפתולוג של צביעת H&E בגודל 8x11 כמדריך ויזואלי. השתמש בכלי ציור הצורות בתוכנה כדי להקיף את אזורי האפיתל הרצויים בתצוגה ולהימנע מאיסוף סטרומה. לחץ על cut כדי להפעיל את הלייזר.אם אזור מסוים לא נחתך לחלוטין, השתמש בכלי ההזזה והחיתוך כדי לעבור עליו ידנית. המשך להזיז את העדשה לעמודי תצפית חדשים וחזור על חיתוך הלייזר עד שהשקופית תהיה מנותחת לחלוטין או עד שייאסף כמות הרקמה הרצויה. עם הסתיים התהליך, הוצא בזהירות את המבחנות ממעמד האיסוף וסגור את הפקקים, תוך תשומת לב לנוזל הליזיס, לבופר ולרקמה שנמצאים על הפקקים.בקצרה, סובבו בצנטריפוגה למשך 30 שניות כדי לרכז את הנוזל והרקמה בתחתית הפרוטובולה. דגרו את הדגימות בטמפרטורה של 42 °C למשך 30 דקות ואחסנו בטמפרטורה של 80- °C עד לביצוע בידוד ה-RNA. דוגמאות אלו מציגות חתכי ערמונית נבחרים הצבועים ב-toluidine blue על גבי שקופית עם מסגרת עט, לפני ואחרי לכידה בלייזר של בקרות ספציפיות לסוג תאי אפיתל שפיר.אששו את הספציפיות של האזור שנלכד בלייזר מהרקמה. אפיתל וסטרומה שפירים. אינם מבטאים את הגן הספציפי לסרטן הערמונית, A-M-A-C-R.הסטרומה לא ביטאה את הגן הספציפי לאפיתל ואת KX 3.1. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לעבוד בסביבה נקייה מ-RNA כדי למנוע פירוק של ה-RNA. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה של אופן בידוד RNA מאוכלוסיות הומוגניות של תאי אפיתל או תאי סטרומה מרקמה קפואה עבור טכניקות רבות של אנליזות המשך.אל תשכחו כי עבודה עם קריוסטט עלולה להיות מסוכנת ביותר; יש לנקוט באמצעי זהירות, כגון הכשרה נאותה ותשומת לב גבוהה מאוד ללהב, בעת ביצוע פרוצדורה זו.

laser-capture-microdissection-human-prostatic-epithelium-for-rna

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

פולימראז כמותי זמן אמת תגובת שרשרת (QPCR) היא שיטה מהירה רגישה כדי לחקור את רמות הביטוי של microRNA שונים (מירנה) מולקולות דגימות הגידול. שימוש בביטוי זה השיטה של ​​מאות מולקולות שונות מירנה יכול להיות מוגבר, לכמת אותה ולנתח אותה מהתבנית cDNA אותו.

MicroRNA איתור גידולים הערמונית ב כמותי בזמן אמת PCR (QPCR)

רטרווירוסים אנושיים אנדוגני (HERV), אשר תופסים 8% של הגנום האנושי, לשמור על יכולות קידוד נדירות אבל מאה אלף חזרות ארוכות מסוף (LTRs). Microarray Affymetrix מותאם אישית תוכנן כדי לזהות ביטוי לוקוס HERV הבודד והיה בשימוש ברקמות סרטן ערמונית כהוכחה של מושג למחקרים קליניים בעתיד.

זיהוי מבוסס microarray של פרט HERV לוקוסים ביטוי: בקשה לגילוי סמן ביולוגי בסרטן הערמונית

ניתוח ביטוי גנים של תת-קבוצה של תאים ברקמה ספציפית מהווה אתגר גדול. מאמר זה מתאר כיצד לבודד RNA הכולל באיכות גבוהה מאוכלוסיית תאים ספציפית על ידי שילוב של שיטת immunolabeling מהירה עם microdissection ללכוד לייזר.

בידוד RNA מן אוכלוסיות תאים ספציפיות באמצעות Microdissection לייזר ללכוד בשילוב עם ראפיד immunolabeling

כאן אנו מתארים פרוטוקול פשוט לניתוחי ביטוי microRNA (miRNA) ברקמות קליניות של סרטן ערמונית קפוא (FFPE) או סרטן ערמונית קפוא טרי (PCa) המשתמשות ב-PCR כמותי בזמן אמת (RT-PCR) והכלאה באתרה (ISH).

ניתוח ביטוי מירנה ברקמות קליניות בסרטן הערמונית

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עבור microdissection לכידה לייזר לשחזור (LCM) לבידוד meshwork trabecular (TM) לניתוח RNA במורד הזרם. היכולת לנתח שינויים בביטוי הגנים ב ה-TM יעזור להבין את המנגנונים המולקולריים שבבסיס של מחלות עינית הקשורות TM.

לייזר Microdissection לכידה של מאוד טהור Meshwork Trabecular מעיני העכבר עבור ניתוח ביטוי גנטי

המטרה של פרוטוקול זה היא להשיג דגימות RNA גבוהה-שלמות של הגרעינים המעית מבודד מבולבל, resected טריים מעיים רקמה אנושית באמצעות לייזר לכידת microdissection (LCM). פרוטוקול זה כולל הכנת קפואה דגימות של רקמות אנושיות מעיים, cryosectioning, ethanolic מכתים, התייבשות, הפונקציה LCM, והפקת RNA.

אופטימיזציה של לכידת לייזר Microdissection עבור בידודו של הגרעינים המעית מרקמות אנושיות מוקפאות

פרוטוקול לכידת מיקרודיסקציה (LCM) לכידה פותחה כדי להשיג כמות מספקת של RNA באיכות גבוהה עבור ניתוח ביטוי גנים בתאי עצם. המחקר הנוכחי מתמקד על מקטעי עצם הירך העכבר. עם זאת, פרוטוקול LCM דווח כאן ניתן להשתמש כדי ללמוד ביטוי גנים בתאים של כל רקמה קשה.

לכידת לייזר פרוטוקול מיקרודיסקציה התשואות באיכות גבוהה RNA מ-העכבר קפואים טרי-קפוא

פרוטוקול זה מתאר מיקרוניתוח לכידת לייזר עבור הבידוד של סחוס ועצם מחלקים קפואים טריים של העובר העכבר. סחוס ועצם יכול להיות דמיינו במהירות על ידי cresyl סגול כתמים ונאסף בדיוק כדי להניב RNA באיכות גבוהה עבור ניתוח transcript.

לכידת לייזר מיקרו חיתוך של העכבר סחוס ועצם עבור ניתוח ביטוי גנים

התנגדות תרפיה מתפתחת לעתים קרובות בחולים עם סרטן הערמונית מתקדם, ובמקרים מסוימים, סרטן מתקדם לסוג קטלני שנקרא סרטן הערמונית נוירואנדוקריניים. הערכת קטן ללא קידוד RNA-תיווך שינויים מולקולריים המאפשרים מעבר זה יאפשר מחלות טוב יותר ריבוד וזיהוי של מנגנונים סיבתי המובילים לפיתוח של סרטן הערמונית נוירואנדוקריניים.

רצפי RNA קטן ללא קידוד מתוך פורמאלין-רקמות קבועות וסרום-אקסוזומים נגזרות מחולי סרטן הערמונית עמידים סירוס

אנו מתארים פרוטוקול למיקרו-דיסקציה בלייזר של תת-מקטעים של הכליה האנושית, כולל הגלומרולוס, צינורית פרוקסימלית, איבר עולה עבה, צינור איסוף ואינטרסטיציום. לאחר מכן, ה- RNA מבודד מהתאים המתקבלים ורצף ה- RNA מתבצע כדי לקבוע שינויים בחתימה התמלולומית בתוך כל מקטע משנה.

יישום של מיקרו-דיסקציה בלייזר לחשיפת תעתיקים אזוריים ברקמת הכליה האנושית

פרוטוקול זה מתאר שיטה לבידוד RNA מאזורים היסטולוגיים מוגדרים של רקמת כבד עכבר, המוטמעת בטמפרטורת חיתוך אופטימלית בטמפרטורת חיתוך אופטימלית באמצעות מיקרודיסקציה ללכידת לייזר, המאפשרת ניתוח ביטוי גנים ממוקד במורד הזרם.

מיקרודיסקציה בלייזר של רקמת כבד עכבר מקובעת בפרפורמלדהיד לניתוח RNA

למד מיקרוכירורגיה לייזר לבידוד RNA מאוכלוסיות טהורות של תאים אפיתליים בערמונית מרקמות קפואות הטרוגניות. שיטה זו מאפשרת ניתוח ביטוי גנים במחקר סרטן הערמונית.

Microdissection לייזר לכידתו של אדם הערמונית האפיתל לניתוח RNA

גלה סרטונים נוספים