Microdissection לייזר לכידתו של אדם הערמונית האפיתל לניתוח RNA

המטרה הכוללת של פרוטוקול מיקרו דיסקציה זה ללכידת לייזר היא לבודד RNA כולל מאוכלוסיות טהורות של סוגי תאי אפיתל ערמונית מרקמות ערמונית קפואות הטרוגניות לצורך ניתוחי ביטוי גנים במורד הזרם. שיטה זו יכולה לסייע בניתוח דגימות חולים ולענות על שאלות מפתח בתחום המחקר של סרטן הערמונית, כגון כיצד ביטוי RNA שונה בדגימות רקמה תותבת שפירה ואפיתל מחלה, או בדגימות ניסויים קליניים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שמיקרו-דיסקציה של לכידת לייזר מאפשרת בידוד RNA של אוכלוסיות הומוגניות של תאי אפיתל או str מרקמת ערמונית קפואה.

בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו לרכוש RNA באיכות גבוהה מכיוון שהם אינם יודעים אילו צעדים קריטיים לשמירה על RNA. תנאים חופשיים התחל באיסוף כל הריאגנטים והכלים הדרושים להליך. לאחר שאפשרתם לרקמת הערמונית הקפואה להתייצב בתוך הקריוסטט למשך 30 דקות, התיזו את מדיום ההרכבה לתחתית הקסטה והרכיבו במהירות את הרקמה באמצעות מלקחיים צוננים.

הנח את הקסטה בצ'ילר של הקריוסטט למשך חמש דקות כדי לקבע את אמצעי ההרכבה. לאחר ההגדרה, השפריצו מדיום קפוא והרכבה על הצ'אק ולחצו לתוכו בזהירות את הרקמה המותקנת. הצד התחתון כלפי מעלה.

הניחו לתכשיר להתייצב במשך חמש דקות. לפני הכנסת הצ'אק למחזיק, נעל את הידית למקומה והכנס להב חדש על הקריוסטט. לאחר פתיחת הידית, קדם בזהירות את הדגימה עד להגעה לחשיפת הרקמות הרצויה.

כשהוא מוכן, כוונן את הקריוסטט לחמישה מיקרון וחתוך קטע אחד או שניים. הנח חלקים אלה על שקופית זכוכית טעונה לצביעה של המטין ואואין. מניחים מיד את השקופית לקר, 100% אתנול למשך שתי דקות.

לאחר זמן זה, הסר את השקופית ותן לה להתייבש בטמפרטורת החדר. השקופית המוכתמת h ו-d מספקת הדמיה טובה יותר של מרקמים גרעיניים וצריכה לשמש את הפתולוג כדי לסמן את אזורי העניין. לאחר מכן, הניחו מסגרת עט בטמפרטורת החדר.

החלק לתוך תומך מסגרת, כוונן את הקריוסטט ל-10 מיקרון וצור חלקים. ניתן למקם קטע אחד עד ארבעה חלקים על כל שקופית, בהתאם לגודל הרקמה. צללו מיד את השקופית לתוך אתנול 100% קר.

הסר את השקופית לאחר שתי דקות ואחסן במקפיא לניתוח מאוחר יותר. באותו יום של המיקרו-דיסקציה של לכידת הלייזר, אחזר את שקופיות מסגרת העט מהמקפיא העובד באזור נטול RNA. הרטיבו את השקופיות על ידי טבילה עדינה ב-90% אתנול למשך שתי דקות, ולאחר מכן 75% אתנול למשך שתי דקות.

לאחר הלחות, צבעו את רקמת הערמונית על ידי טבילה עדינה של השקופיות בכחול 0.5% טואין למשך חמש עד 30 שניות. עצרו את הטישו על ידי שטיפת המגלשות פעמיים במים עמוקים למשך 15 שניות, ולאחר מכן 75% אתנול למשך 30 שניות עד שלוש דקות. לבסוף, העבירו את שקופיות מסגרת העט למיכל יבש נטול RNA על קרח.

לפני תחילת ההליך, הנח שקופית לייבוש על מחמם שקופיות למשך 15 דקות. יבש רק את השקופית שתעובד ואחסן את השאר על קרח עד הצורך. הפעל את רכיבי LCM בסדר הבא.

כוח המיקרוסקופ, מפתח הלייזר, מתג הלייזר ולאחר מכן המחשב. לאחר מכן, הפעל את תוכנת המיקרו-דיסקציה בלייזר באמצעות התוכנה. בקש מהמיקרוסקופ לטעון את השקופיות וצינורות האיסוף.

לחץ על פרק את מחזיק המדגם וטען את השקופית על מחזיק השקופיות כשהטישו פונה כלפי מטה. הכנס את מחזיק השקופית לחריץ המתאים במיקרוסקופ ולחץ על המשך. לאחר מכן, לחץ על פריקה של צינורות איסוף.

תווית וטען צינורות על מחזיק הצינור והכנס לחריץ המתאים. אבטח את המכסים והוסף 35 מיקרוליטר של מאגר ליזה. הקפדה על הימנעות מבועות.

לאחר טעינת מכסות האוסף, לחץ על אישור. השתמש בתוכנה כדי לבחור את מיקום השקופית במחזיק, ולאחר מכן בחר את מכסה האיסוף כדי לאסוף את הדגימה. הצג באופן חזותי וממקד את השקופית דרך המחשב בהגדלה של פי 10.

השתמש בתוכנה כדי לכייל את הלייזר על ידי בחירת לייזר. לאחר מכן כיול, כוונן את צמצם הכוח והמהירות של הלייזר על ידי בחירת לייזר ולאחר מכן שליטה. המשך לבצע התאמות עד שהלייזר חותך לחלוטין את הרקמה.

חיוני לתאר את תחומי העניין שנעשים בדרך כלל על ידי פתולוג מוסמך על מנת לנתח במדויק את אזורי הרצון של הרקמה הנתונים ל- LCM באמצעות סימון הפתולוג של שמונה על 11 שעות ו- e כמדריך חזותי. השתמש בכלי ציור צורת בתוכנה כדי לתחום את אזורי האפיתל הרצויים בתצוגה ולהימנע מאיסוף סטרומה. לחץ על גזירה כדי להפעיל את הלייזר.

אם אזור לא נחתך לחלוטין, השתמש בכלי ההזזה והחיתוך כדי לעבור עליו ידנית. המשך להעביר את המטרה לתצוגות חדשות וחזור על חיתוך לייזר עד לניתוח מלא של השקופית או איסוף כמות הרקמה הרצויה. בסיום, הסר בזהירות את הצינורות ממחזיק האיסוף וסגור את המכסים תוך התחשבות בליזה, המאגר והרקמה במכסים.

בקצרה, צנטריפוגה למשך 30 שניות כדי לאסוף את הנוזל והרקמות בתחתית הצינור. דגרו את הדגימות בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ואחסנו במינוס 80 מעלות צלזיוס עד שהן מוכנות לבידוד RNA. דוגמאות אלה מציגות קטעי ערמונית מוכתמים בכחול טולואידין על שקופית מסגרת עט לפני ואחרי לכידת לייזר בקרות ספציפיות לסוג תאי אפיתל שפירים.

אשר את הספציפיות של האזור שנלכד בלייזר ברקמה. אפיתל שפיר וסטרומה. אין לבטא את הגן הספציפי לסרטן הערמונית, A-M-A-C-R.

הסטרומה לא ביטאה את הגן הספציפי לאפיתל ו-KX 3.1 בזמן ניסיון הליך זה. חשוב לזכור לעבוד בסביבה נטולת RNA כדי למנוע פירוק RNA. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד RNA מאוכלוסיות הומוגניות של תאי אפיתל או סערה מרקמה קפואה עבור טכניקות ניתוח רבות במורד הזרם.

אל תשכח שעבודה עם קריוסטט עלולה להיות מסוכנת ביותר באמצעי זהירות, כגון הכשרה טובה ותשומת לב טובה במיוחד ללהב יש לנקוט תמיד בעת ביצוע הליך זה.