Name: תאי סרטן ספרואיד Assay להערכת פלישה בסביבת 3D (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 34 s
Description: חקור הערכת פלישת תאי סרטן מספרואידים לתוך מטריצה תלת-ממדית. שיטה זו מאפשרת לזהות תנאים המעודדים או מעכבים פלישה תאית בסביבה פיזיולוגית רלוונטית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

נתמך על ידי CA051008 P30 מענקי NIH וT32 CA009686 (ATR).

1. דור של Spheroids <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן השעיה תא בודד לתליית תרבויות ירידה בניתוק תרביות תאי הסרטן חסיד של ~ מפגש 70% באמצעות PBS לשטוף אחרי חשיפה ל0.05% פתרון טריפסין- EDTA. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנטרל את פתרון טריפסין עם תקשורת ותרבות תא ולספור את התאים באמצעות aliquot של ההשעיה התא. הערה: תקשורת תרבות תא הספציפית יהיה תלויה בשורת התאים נבדקות. עקוב המלצות תקשורת ATCC, שבו התקשורת ותרבות תא היא בדרך כלל DMEM + 10% FBS. ניתן למצוא מידע נוסף בלוח חומרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע דילול כדי לאפשר לזריעה של 500-1,000 תאים לכל 20 ירידת μl של תקשורת בתרבות התא. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש צלחת 10 סנטימטרים ולהוסיף 5 מיליליטר של PBS סטרילי לתחתית. הערה: שלב זה מגן על תליית טיפות מאידוי. עלות נמוכה יותר מנות &quot;בקטריולוגית כיתה&quot; ניתן להשתמש במקום של מנות כיתה תרבית תאים, תאים לא יהיו המשךלפעול משטח התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש pipet רב ערוצית להעביר 20 טיפות μl של ההשעיה התא המדולל למשטח הפנימי של המכסה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet 40 טיפות (5 שורות של טיפות 8) על המכסה של צלחת 10 סנטימטר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את המכסה ומניחים על גבי צלחת התרבות. דגירה תרבויות ירידה התלויה על 37 מעלות צלזיוס למשך 72 שעות כדי ליצור spheroids. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את המכסה באופן בטוח, עדיין בשליטה. הערה: היפוך המכסה מהר מדי או איטי מדי עלולה לגרום לטיפין להעביר. שורות תאים מסוימות עשויות ליצור spheroids ב 48 שעות או פחות, בעוד שאחרים עשויים לדרוש יותר מ -72 שעות כדי לייצר אגרגטים קומפקטיים. </li></ol></li></ol> 2. הטבעה של Spheroids לתוך 3D מטריקס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר aliquot של חומרי קרום צמיחה מופחת גורם מרתף על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה לפני הטבעת spheroids. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונלית: בארות שכבה עם ECM מראש כדי למנוע אינטראקציה אליפטית פוטנציאלית עם cultu הרקמהמחדש על פני שטח. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 200 μl Pipet של ECM לכל גם בצלחת 24 גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הטה את הצלחת על מנת להבטיח שECM מכסה את פני השטח היטב כולו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות ECM העודף עם pipet. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את הצלחת עד הבארות יבשות: 3 שעות בטמפרטורת חדר או הלילה ב 4 מעלות צלזיוס. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את spheroids על ידי הטיית המכסה של צלחת תרבית רקמה ואיגום התקשורת. העבר את התקשורת עם spheroids לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר 10 דקות לspheroids להתיישב בחלק התחתון של צינור microcentrifuge. Spheroids צריך להיות גלוי לפי העין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שילוב של חומרי קרום במרתף 100 μl עם של (4 ° C) הקר 100 μl להקליד אני קולגן בצינור מראש צונן נפרד. שמור את התערובת על 4 מעלות צלזיוס, כדי למנוע או ג&#39;ל לחיזוק בטרם עת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בעצות pipet מראש צונן אם העברת נפחים קטנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתת טיפול כאשרערבוב סוג חומרי קרום במרתף וקולגן אני למנוע היווצרות בועת אוויר. הערה: בועות אוויר עלולות לעכב הדמיה מאוחר יותר בפרוטוקול אם הם השתרשו בג&#39;ל. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב spheroids מהחלק התחתון 40 μl של צינור microcentrifuge, ולשלב עם חומרי קרום במרתף / הסוג אני קולגן תערובת. להיות זהיר כדי למנוע היווצרות בועת אוויר כאשר ערבוב. הערה: התמיסה המכילה חומרי קרום במרתף 100 μl, 100 סוג קולגן μl אני, ו -40 μl של spheroids ניצור מספיק חומר ל4 תרבויות 3D עצמאיות. זה יכול להיות מדורגים למעלה או למטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet 40 טיפות μl של התערובת צמיגה למרכזים של בארות בצלחת 24 גם. לשמור על רמת הצלחת כדי למנוע את התערובת מפועל לצד השני של הבאר. הערה: עמודה אחת על הצלחת 24 גם - 4 בארות - מומלצת לכל מצב להיבדק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצלחת intחממת OA 37 ° C ולהשאיר ללא הפרעה במשך 30 דקות. תרבות 3D תהיה פלמר בתקופה זו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט להטביע את תרבויות 3D ב 1 מיליליטר של תקשורת בתרבות התא. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שהמדיה היא חמה בעת הוספתו לבארות לקדם פילמור ג&#39;ל נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב קריטי: בעדינות להוסיף מדיה לתרבויות 3D. Pipetting התקשורת מהר מדי לתוך הבארות יכול להוביל לניתוק של תרבויות 3D ממשטח תרבית רקמה. </li></ol></li></ol> 3. ניטור וניתוח ספרואיד פלישה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלישת תמונה מspheroids לתוך מטריצת 3D מקיפה בנקודתי הזמן החליטו על ידי החוקר. לרכוש תמונות באמצעות מיקרוסקופ הפוכה עם העדשה האובייקטיבית 20x. הערה: נקודות זמן אידיאלית תהיה שונות בהתאם לקו התא נבדק. שורות תאים יותר פולשנית תתחיל יציאתם מspheroids זמן קצר לאחר ציפוי, ולכן, לקחת תמונה ראשוניתים בתוך כמה שעות לאחר ציפוי. בדרך כלל, תצלומים שצולמו בשעה 0 (לאחר ציפוי), 24 שעות, 48 שעות ו. פלישה בדרך כלל מסכמת 24 עד 48 שעות לאחר ציפוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת יכולת פולשנית באמצעות תוכנת ניתוח תמונה כמו התמונה ג &#39; <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח פלישה כמרחק תא מקצה אליפטית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בכלי לצייר ישר לסמן את הרדיוס ו / או מרחק מקסימאלי פולשנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;נתח&quot; בתפריט העליון, ולאחר מכן לחץ על &quot;מדוד&quot; כדי להציג את מדידת האורך. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח פלישה כאזור פולשנית הכולל מחוץ לאליפטית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בכלי ציור Freehand להתחקות הגבול של אליפטית ו / או האזור פולשנית כולל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;נתח&quot; בתפריט העליון, ולאחר מכן לחץ על &quot;מדוד&quot; כדי להציג את מדידת השטח. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתוסף כמו כלים מנהל ROI ליצור מדידות לערימה של תמונות. </li></ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastasis%3A+Dissemination+and+growth+of+cancer+cells+in+metastatic+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Metastasis: Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites.</a> Nat Rev. Cancer. 2 (8), (2002).</li>
<li>Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+tissue-specific+signaling+and+organ+function+in+three+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions.</a> J Cell Sci. 116 (12), 2377-2388 (2003).</li>
<li>Yamada, K. M., Cukierman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+tissue+morphogenesis+and+cancer+in+3D%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D.</a> Cell. 130 (4), (2007).</li>
<li>Foty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+hanging+drop+cell+culture+protocol+for+generation+of+3D+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids.</a> J Vis Exp. 51, (2011).</li>
<li>Del Duca,, Werbowetski, D., T,, Del Maestro,, F, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid+preparation+from+hanging+drops%3A+characterization+of+a+model+of+brain+tumor+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuro-Oncol%22%5BJournal%5D)">Spheroid preparation from hanging drops: characterization of a model of brain tumor invasion.</a> J Neuro-Oncol. 67 (3), (2004).</li>
<li>Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+cell+migration+and+invasion+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vitro cell migration and invasion assays.</a> J Vis Exp. 88, (2014).</li>
<li>Ramos-DeSimone, N., Hahn-Dantona, E., Sipley, J., Nagase, H., French, D. L., Quigley, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+matrix+metalloproteinase-9+%28MMP-9%29+via+a+converging+plasmin%2Fstromelysin-1+cascade+enhances+tumor+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bio+Chem%22%5BJournal%5D)">Activation of matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) via a converging plasmin/stromelysin-1 cascade enhances tumor cell invasion.</a> J Bio Chem. 274 (19), Forthcoming.</li>
<li>Friedl, P., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour-cell+invasion+and+migration%3A+diversity+and+escape+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms.</a> Nature Rev. Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).</li>
<li>Kleinman, H. K., Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrigel%3A+Basement+membrane+matrix+with+biological+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">Matrigel: Basement membrane matrix with biological activity.</a> Semin Cancer Biol. 15 (5), 378-386 (2005).</li>
<li>Shaw, L. M., Chao, C., Wewer, U. M., Mercurio, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+the+integrin+%CE%B16%CE%B21+in+metastatic+breast+carcinoma+cells+assessed+by+expression+of+a+dominant-negative+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Function of the integrin α6β1 in metastatic breast carcinoma cells assessed by expression of a dominant-negative receptor.</a> Cancer Res. 56 (5), 959-963 (1996).</li>
<li>Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrigel%3A+a+complex+protein+mixture+required+for+optimal+growth+of+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture.</a> Proteomics. 10 (9), (2010).</li>
<li>Rajan, N., Habermehl, J., Coté, M. -F., Doillon, C. J., Mantovani, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+ready-to-use%2C+storable+and+reconstituted+type+I+collagen+from+rat+tail+tendon+for+tissue+engineering+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications.</a> Nat Protoc. 1 (6), (2006).</li>
<li>Provenzano, P. P., Eliceiri, K. W., Campbell, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+reorganization+at+the+tumor-stromal+interface+facilitates+local+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Med%22%5BJournal%5D)">Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion.</a> BMC Med. 4 (1), (2006).</li>
<li>Timmins, N. E., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+multicellular+tumor+spheroids+by+the+hanging-drop+method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method.</a> Methods Mol Med. 140, 141-151 (2007).</li>
<li>Brenner, W., Groß, S., Steinbach, F., Horn, S., Hohenfellner, R., Thüroff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+inhibition+of+renal+cancer+cell+invasion+mediated+by+fibronectin%2C+collagen+IV+and+laminin%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Differential inhibition of renal cancer cell invasion mediated by fibronectin, collagen IV and laminin.</a> Cancer Lett. 155, 199-205 (2000).</li>
<li>Nieman, M. T., Prudoff, R. S., Johnson, K. R., Wheelock, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-cadherin+promotes+motility+in+human+breast+cancer+cells+regardless+of+their+E-cadherin+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">N-cadherin promotes motility in human breast cancer cells regardless of their E-cadherin expression.</a> J Cell Biol. 147 (3), Forthcoming.</li>
<li>Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+invasion+in+breast+cancer+requires+a+conserved+basal+epithelial+program%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program.</a> Cell. 155 (7), (2013).</li>
<li>Sodek, K. L., Brown, T. J., Ringuette, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+I+but+not+Matrigel+matrices+provide+an+MMP-dependent+barrier+to+ovarian+cancer+cell+penetration%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Collagen I but not Matrigel matrices provide an MMP-dependent barrier to ovarian cancer cell penetration.</a> BMC Cancer. 8 (1), 223-2210 (2008).</li>
<li>Nguyen-Ngoc, K. V., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammary+ductal+elongation+and+myoepithelial+migration+are+regulated+by+the+composition+of+the+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Mammary ductal elongation and myoepithelial migration are regulated by the composition of the extracellular matrix.</a> J Microsc. 251 (3), 212-223 (2013).</li>
<li>Glinskii, A. B., Smith, B. A., Jiang, P., Li, X., Yang, M., Hoffman, R. M., Glinsky, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viable+circulating+metastatic+cells+produced+in+orthotopic+but+not+ectopic+prostate+cancer+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Viable circulating metastatic cells produced in orthotopic but not ectopic prostate cancer models.</a> Cancer Res. 63 (14), 4239-4243 (2003).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

מחקר זה העריך את הביצועים של פנל של שורות תאי הסרטן בassay אליפטית פלישה (טבלה 1). בדרך כלל, אנו מוצאים כי היווצרות אליפטית מוגברת בשורות התאים יותר למראה אפיתל, שבו נוכחותו של צמתים תאי תאים מקדמת את הקמתה של ארכיטקטורה כמו-אליפטית. קווים ידועים תא שעברו מעבר אפיתל- mesenchymal, כמו מד&quot;א MB-231 תאים לא יוצרים spheroids בתרבות הירידה התלויה ככל הנראה בשל הביטוי האלקטרוני, N-, ו- P-cadherin המופחת שלהם 16. <p class="jove_content" style=";text-al...

הוא קבע כי תנועתיות של תאים הסרטניים היא חזויה של פוטנציאל גרורתי, בהתחשב בעובדה שהתנהגות כזו מאפשרת פלישה דרך הקרום במרתף והכניסה למערכת דם 1. רוב המחקר על תנועתיות התמקד בדרך בה התאים מתנהגים בסביבה דו-ממדית (2D), אם כי זה הופך להיות מוכר באופן נרחב שהתנועה של תאים במטריצה ​​תלת-ממדי (3D) הוא נציג נוסף של איך אותם תאים יהיו ממש להתנהג בvivo 2. מערכות תרבות 3D משמשות יותר ויותר ללמוד התנהגויות סלולריות הנעות בין מורפולוגיה תא, לקינטיקה צמיחה ורגישות לסמים 3. הרצון לפקח על פלישת תאים סרטנית בהקשר של סביבת 3D הוביל לסינתזה של טכניקות הוקמו בעבר מעורב הדור של אגרגטים 3D תא (spheroids) באמצעות שיטת הטיפה התלויה תרבות 4, ואחרי הטבעת spheroids אלה לתאיים 3D מטריקס (ECM) מורכב מחומרי קולגן וקרום במרתף 5. שיטה זו נועדה לשפר את ביצועי טכניקות הוקמו בעבר אלה על ידי מתן גישה יעילה שיכול להיות מנוצלת בקלות להשוות פלישה תחת מגוון רחב של תנאי ניסוי. דרכים מסורתיות יותר להעריך תנועתיות תא במבחנה הן assay-פצע השריטה וassay transwell 6. Assay לשעבר מתאר תנועתיות תא בהגדרת 2D, ולכן אינו תלוי של מגוון רחב של תכונות קריטיות לפלישת in vivo, למשל פעילות פרוטאז 7. Assay transwell יכול פלישת תא מודל טוב יותר כאשר מוסיף גם הם מצופים עם מצעי ECM אבל, רק פרמטר אחד, כלומר את המראה של תאים על פני השטח הקרום ההפוך נמדד, וניואנסים רבים של פלישת תא לכן אינם ניתנים לצפייה בקלות. בניגוד לשיטות אלה, assay פלישת אליפטית תאים הסרטניים (איור 1 &lt;/ Strong&gt;) מאפשר לניטור בזמן אמת של פלישת תא בהגדרה שהיא לא רק מבחינה פיזיולוגית רלוונטי, אלא גם מאפשר תכונות חשובות תא קו ספציפי להיות דמיינו, כגון תא בודד מול קולקטיבי הגירה 8. שיטה זו גם מאפשרת יתרונות על פני מבחני צמיחת תרבות 3D סטנדרטיים. הדור של אגרגטים סלולריים באמצעות שיטת הטיפה התלויה בתחילה מגביל תנועת תא, כך שתאים יהיו תמריצים לפלוש לאחר אילוץ זה יוסר. יתר על כן, ברגע שהאילוץ שהרים, היציאה תא תמשיך בכיוון אחיד, כי אז יכול להיות ונרשמת בנוחות. חומרי ECM הפופולריים ביותר המשמשים למבחני spheroids תא סרטני הם Matrigel וסוג אני קולגן, שבו כל אחד ממרכיבים אלה יש תפקידים חשובים ומובהק בהשפעה על התנהגות גרורתי. Matrigel הוא תערובת של חלבונים מופרשים מיוצרים על ידי תאי סרקומה Engelbreth-הולם נחיל עכבר, והוא מועשר בbasemeחלבוני קרום NT כגון laminin, entactin, וקולגן IV סוג 9. מסיבה זו Matrigel נקרא מעתה ואילך ל&quot; חומרי קרום במרתף. &quot;חומרי קרום במרתף אלה מספקים ligands החיוני נחוץ לintegrin הידבקות במהלך פלישת תאים סרטני 10 בנוסף לחלבונים רבים אחרים שמפעילים מגוון רחב של השפעות על התנהגות תא 11. לשם השוואה, הסוג אני קולגן, מוכן בדרך כלל ממעכלים חומצה של גידים ומבני collagenous צפופים אחרים 12, הוא חומר מטריצה ​​הרבה יותר פשוט, המשמש כמרכיב מבני עיקרי של רקמות חיבור רקמות וסטרומה תמיכה ואיברי הגוף. הוכח שהמאפיינים הפיזיים של קולגן יכולים לווסת מספר התכונות של תנועתיות תא; לדוגמא, את היישור של סיבי קולגן בממשק הגידול-סטרומה מאפשר לתאי סרטן להגר לאחר מכן לאורך סיבים שבהם פולשים לתוך סטרומה 13. בassay שהוצג כאן, שניהם הסוג אני קולגן וחומרי קרום במרתף משמשים ככלים ללמוד אינטראקציות התא-סטרומה סרטן 3D. ההשפעה של עיכוב או גירוי של מסלולים השולטים פלישה ניתן לנטר אחרי התאים כבר מוטבעים במטריצת 3D. ניתן pretreated תאים במהלך צמיחה בטיפי התלייה או על העברה לתרבות 3D, תלוי אם יידרש טיפול ממושך לווסת פלישה. לטיפולים קצרים יותר, מומלץ כי התרופה להיות מעורבבת עם ההשעיה אליפטית לאחר איסוף, כמו גם התקשורת שמקיפה את תרבויות 3D, כדי להקל על חשיפה לסמים נאותה לתאים. לאחר מכן, ניתן ונכללו תאי סטרומה רגילים או גידולים הקשורים עם חומר המטריצה ​​להעריך את תפקידם בויסות פלישת תאים סרטניים, או כדי לקבוע כיצד השפעות איתות התנהגות תא אוטוקריני וautocrine. רעיון זה הוצג במחקר שבו coculture של colעל סרטן ותאי האנדותל בטיפות תלויות הוביל לרשת כלי דם בתוך spheroids 14. לבסוף, ניתן גם לשנות את מרכיבי ECM, כמו הפלישה של תאי הסרטן מושפעת מצעים שונים 15. כך השיטה המובאת להלן תספק מסגרת להערכת פלישת תאים סרטניים תחת מגוון רחב של תנאים. באופן כללי נמצא כי לא כל שורות התאים ייצרו spheroids בטיפין התלויות ושורות תאי אפיתל מראה בדרך כלל יוצרות כדורים רגילים.

<table><tbody><tr><td>גורם גדילה Matrigel מופחת</td><td>קורנינג</td><td>CB-40234</td><td></td></tr><tr><td>קולגן סוג I, זנב חולדה, 100 מ"ג</td><td>Millipore</td><td>08-115</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 בינוני&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי,</td><td>Omega Scientific</td><td>FB-12</td><td></td></tr><tr><td>100 מ"מ כלים מטופלים</td><td>TC קורנינג משולב</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>24 בארות צלחות מטופלות TC</td><td>NEST ביוטכניקה</td><td>702001</td><td></td></tr><tr><td>אולימפוס IX-71 קווי תאים של מיקרוסקופ</td><td></td><td></td><td></td>הפוך</tr><tr><td>נשמרו ב-DMEM + 10% FBS, עם ציפייה לתאי BT-474 ו-LNCaP, שהיו מוכנים ב-RPMI + 10% FBS.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

תאי סרטן ספרואיד assay להערכת פלישה בסביבת 3d

A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting

האופי הפולשני של קווי תאים סרטניים נחשב כמתאם עם הפוטנציאל הגרורתי שלהם. עם זאת, רוב הבדיקות המסורתיות אינן בוחנות את התכונות הפולשניות הללו בסביבה תלת מימדית והנתונים המתקבלים סובלים מיישום ביולוגי מופחת. כאן מוצגת גישה להמחשת היכולת הפולשנית של קווי תאים בסביבה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית. בדיקת פלישת הספרואידים של תאי הסרטן משתמשת תחילה בכוח הכבידה כדי ליצור ספרואידים בתוך טיפות מדיה התלויות מהמכסה של צלחת תרבית תאים. לאחר מכן, ספרואידים אלה משובצים במטריצה תלת מימדית המורכבת מתערובת של חומרי ממברנת מרתף וקולגן מסוג I. לאחר מכן מנוטרת הוצאת תאי סרטן מהספרואידים למטריצה שמסביב לאורך זמן. ניתן לשנות את השיטה המתוארת כאן כדי לבחון פלישה לאחר קוקולטורציה של סוגי תאים שונים, הכללת תרופות/מעכבים, או שינויים במרכיבי מטריצה חוץ-תאית (ECM).

באמצעות assay פלישת אליפטית (איור 1), בהרכב של שורות תאי סרטן נבדק ליכולת שלהם ליצור spheroids, כמו גם לסכום של יציאה תא הציג לאחר השתלה במטריצת 3D המורכב מחומרי מרתף קרום והסוג אני קולגן (טבלה 1). תוצאות אלו מראות כי לא שורת תאי סרטן בכל תיצור spheroids הבנוי היטב, שבו שורות תאים בעלי מורפולוגיה אפיתל במבחנה נטו לייצר אגרגטים רגילים וחלק. היכולת של שורות תאים שונות לפלוש בassay הייתה גם משתנה. שורות תאים שהוקמו כפולשנית כמו 4T1, E0771, ו...

שיטה זו מעריכה פלישת תאי סרטן מספרואידים למטריצה תלת מימדית מסביב. ספרואידים נוצרים בשיטת תרבית טיפה תלויה ולאחר מכן מוטמעים במטריצה המורכבת מחומרי ממברנת הבסיס וקולגן מסוג I. פלישת הספרואידים מנוטרת לאחר מכן.

תאי סרטן ספרואיד Assay להערכת פלישה בסביבת 3D

The invasive nature of cancer cell lines is thought to correlate with their metastatic potential.  Most traditional assays, however, do not examine these ...

המטרה הכללית של בדיקה זו לפלישת תאי סרטן באמצעות סטרואידים היא לאפשר ניטור של פלישת תאי סרטן אל מחוץ לגוש תאים (cellular bolus) ותוך כדי חדירה למטריצה תלת-ממדית סביבה. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בביולוגיה של הסרטן, כגון זיהוי תנאים המקדמים או מעכבים פלישת תאים. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן להעריך את הניואנסים השונים של אופן פלישת התאים במסגרת in vitro הרלוונטית יותר מבחינה פיזיולוגית.לעתחילתו, הוצא מהאינקובטור צלחת תרבית המכילה תאי סרטן נצמדים. שטוף את התאים פעם אחת ב-PBS והוסף 1.5 milliliters של 0.05%tripsin EDTA. לאחר מכן, הדגר את התאים למשך שלוש דקות ב-37 degrees Celsius.לאחר שהתאים התנתקו, העבירו את התאים שעובדו בטריפסין דרך פיפט של 5 milliliters כדי ליצור תמיסת תאים בודדים, ולאחר מכן הוסיפו לבקבוק 8.5 milliliters של מצע גידול תאים. ספרו את תמיסת התאים באמצעות סופר תאים. דללו את תמיסת התאים לריכוז של 500 עד 1000 תאים ל-20 microliters.בתוך תווך גידול, השתמש בפיפט רב-ערוצי כדי ליצור טיפות של 20 microliter על פני השטח הפנימיים של מכסה של צלחת 10 centimeter. בפיפט רב-ערוצי, צור חמש שורות של שמונה טיפות, לסה"כ 40 טיפות. לאחר מכן, טפטף חמישה milliliters של PBS סטרילי לתחתית צלחת ה-10 centimeter. הפוך בזהירות את המכסה והנח אותו על צלחת ה-10 centimeter.לאחר מכן

a-cancer-cell-spheroid-assay-to-assess-invasion-in-a-3d-setting

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

Assay כדי למדוד כמותית הפיכת גורם הגדילה (TGF)-β-Induced הפלישה ב 3 מימדי ג'ל קולגן מתואר. Assay זו מנצלת את הסדרה MCF10A של שורות תאים, המייצגים שלבים שונים של התפתחות סרטן השד. שיטה זו יכולה להיות מאומץ לשימוש עם שורות תאים אחרים עשוי לשמש כדי לחקור activators פוטנציאליים אחרים או מעכבי הפלישה.

Assay Spheroid למדוד TGF-β-Induced Invasion

סרטון זה מדגים שיטה לביסוס ספרואיד גידול תלת ממדי ותרבית משותפת של תאי T. אגרוז יצוק עם microwells המכילים spheroids הגידול מוכן, ואחריו תוספת של תאי T. לאחר הדגירה, מערך זה מאפשר לחקור את האינטראקציה של תאי T עם ספרואידים סרטניים בסביבה תלת ממדית מבוקרת.

מודל תלת מימדי של תרבית משותפת של חדירת תאי T לספרואידים סרטניים

מקור: Guyon, J., et al. מודל ספרואיד תלת מימדי לגליובלסטומה. J. Vis. Exp. (2020)הסרטון מדגים את היצירה של מודל ספרואיד תלת מימדי של פלישת תאי גידול. ספרואידים נוצרים מתאי גידול מוח אנושיים ומוטמעים במטריצת קולגן. תאי הגידול בפריפריה הספרואידית מאמצים פנוטיפ פולשני, מפרישים פרוטאזות כדי לפרק את הקולגן ומתקדמים לפלוש למטריצה שמסביב.

יצירת מודל ספרואיד תלת מימדי של פלישת תאי גידול

פלישה לרקמות נורמליות שמסביב היא מאפיין מגדיר של גידולים ממאירים. אנו מספקים כאן מבחן מיקרו-צלחת פשוט ואוטומטי למחצה של פלישה לביומטריצה תלת מימדית טבעית שהודגמה במספר מודלים של סרטן אנושי מתקדם.

Assay (3D) תלת ממדי גידול ספרואיד הפלישה

מיקרוסביבה הגידול הוא חלק חיוני של גידול בסרטן ופלישה. כדי לחקות התקדמות קרצינומה, צריך מטריצה אנושית רלוונטית ביולוגית. פרוטוקול זה מציג שיפור לגבי שיטת החדירה החיצונית התלת-ממדית של שלושה מימדים על-ידי החלת מטריצה אנושית המבוססת על מייומה. הפרוטוקול גם מציג ניתוח הפלישה לתא מבוסס-מחשב.

מטריקס מבוסס על גידול אדם במלואו באופן שלוש מימדי הפלישה ספרואיד שיטת

המטרה של פרוטוקול זה היא להקים מודל 3D בתחום החוץ כדי ללמוד את הבידול של סרטן הקשורות בגידולים סרטניים (CAFs) בסביבה בצובר כמו גידול, אשר ניתן לטפל במערכות ניתוח שונות, כגון immunofluorescence ההמרה ניתוח והדמיה של תאי החיים.

3D מודל ספרואיד כמו מערכת פיזיולוגית יותר עבור סרטן הקשורים בידול פיברותקיעות והפלישה ללימודי חוץ גופית

הגישה המוצגת בו זמנית מעריך פלישה לתאים סרטניים באסה 3D spheroid ו cytotoxicity T-cell. ספרואידים נוצרים בהצללת אגרוז מרובת מיקרווול ללא פיגומים. תרבות וטביעה בסוג אני מטריצת קולגן מבוצעים בתוך אותו מכשיר המאפשר לפקח על פלישת תאים סרטניים וcytotoxicity בתיווך T-cell.

ניטור פלישת תאים סרטניים וcytotoxicity T-Cell בתרבות 3D

מוצג כאן הוא פרוטוקול לייצור של מכשיר הדמיה ספרואידי. מכשיר זה מאפשר הדמיה פלואורסצנטית דינמית או אורך של ספירואידים תאים סרטניים. הפרוטוקול מציע גם הליך עיבוד תמונה פשוט לניתוח פלישת תאים סרטן.

הדמיית פלואורסצנטיות שנפתרה בזמן וניתוח של פלישת תאים סרטן במודל ספרואיד 3D

פלישה היא תופעה ביולוגית מרכזית בהתפתחות והתקדמות סרטן. תהליך זה מושפע מתאים שאינם ניאופלסטיים ומרכיבי המיקרו-סביבה של הגידול. מטרת מחקר זה היא לתאר שיטה חלופית לניתוח פלישת תאי גידול במבחנה באמצעות תרביות תלת ממדיות (3D).

אסטרטגיה חלופית לניתוח פלישת תאי מבחנה לתרביות תלת ממדיות

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לחקירת האינטראקציה של מקרופאגים ראשוניים שמקורם במונוציטים אנושיים עם ספרואיד גידול במטריצת קולגן I תלת מימדית (תלת מימדית), עם אפשרות להשוות את ההשפעה של תכונות מסיסות ופיזיקליות של המיקרו-סביבה על פלישת התאים.

בדיקת פלישה משותפת של מקרופאגים-גידול ספרואידים

יש צורך קריטי במודלים תלת מימדיים של סרטן הלוכדים הצלבה הטרו-תאית כדי לחקור גרורות סרטניות. המחקר שלנו מציג את הדור של הטרו-אפיתל סטרומלטי-תאי בסביבה נטולת פיגומים ופיגומים שניתן להשתמש בהם לחקר פלישה והתפלגות מרחבית תאית.

תאי סטרומה הטרו-תאיים בתרביות תלת מימד ללא פיגומים של תאי סרטן אפיתל כדי להניע פלישה

חקור הערכת פלישת תאי סרטן מספרואידים לתוך מטריצה תלת-ממדית. שיטה זו מאפשרת לזהות תנאים המעודדים או מעכבים פלישה תאית בסביבה פיזיולוגית רלוונטית.

תאי סרטן ספרואיד Assay להערכת פלישה בסביבת 3D

גלה סרטונים נוספים