Name: המים אמולסיות שמן: מערכת חדשה להרכבת חלבונים מסיסים במים כלורופיל מחייב עם פיגמנטים הידרופובי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: למדו שיטת הרכבת חלבונים מסיסים במים עם כלורופיל באמולסיות מים בשמן. טכניקה זו מאפשרת מחקר מעמיק של אינטראקציות כלורופיל-חלבון ללא צורך בתיוג חלבונים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

DN מודה תמיכה מן PEPDIODE פרויקטים FP7 האיחוד האירופי (GA 256,672) ו REGPOT-2012-2013-1 (GA 316,157), ומענק מחקר אישי (מס &#39;268/10) מן הקרן הלאומית למדע. אנו מודים פרופ &#39;שמואל רובינשטיין, מבית הספר להנדסה מדעים, אוניברסיטת הרווארד, קיימברידג&#39; מסצ&#39;וסטס, ארה&quot;ב שהקדשת תמונות מיקרוסקופיה confocal.

1. הכנת Chl פתרונות במלאי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב קריטי: בצע את כל השלבים של הכנת כלורופיל במנדף כימי, תחת אור ירוק (520 ננומטר) או בחושך כדי למזער נזקי. תמיד להוסיף חנקן או ארגון לפני ההקפאה הפיגמנטים לאחסון. ודא שכל ממיסים הם כיתה אנליטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוקל כ 5 מ&quot;ג של תאי platensis ספירולינה lyophilized או תאי cyanobacterium אחרים המכילים Chl רק ממברנות תילקואיד ולרסק אותו בעזרת מכתש ועלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען תאים התנפלו טור זכוכית ולשטוף עם על אצטון 50-100 מ&quot;ל של 100% על מנת להסיר קרוטנואידים. מחק את השבריר הכתום / ירוק eluted. הערה: אם השבר תפוז אינו eluted עם 100 מ&quot;ל של אצטון ממשיכים לשטוף את התאים עם אצטון עד שבריר ירוק מתחיל elute. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המרת אצטון עם 100% מתנול ולאסוף את החלק היחסי ירוק המכיל Chl א. היקף Fract elutedיון עשוי להשתנות בין 50-100 מ&quot;ל. בהתחלה השבר eluted יש צבע ירוק כהה, אשר משנה לתוך ירוק בהיר בסוף elution. כאשר הצבע של חלק eluted הופך ירוק בהיר לעצור את elution. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאדות את מתנול באמצעות מאייד רוטרי עד התמצית יבשה לחלוטין. אין ליישם חום לפתרון; ודא שהטמפרטורה באמבט מים של המאייד אינה עולה על 30 מעלות צלזיוס. שימו לב: בפעם של אידוי תלוי בנפח של שבריר מתנול להיות התאדו ועשויה להשתנות בין 10-60 דקות. חשוב לייבש את התמצית לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים את הפיגמנטים מהתמצית יבשים בנפח קטן של אתר diethyl (כ 5-10 מ&quot;ל), ולסנן דרך צמר גפן. ודא פיגמנטים מתמוססים לחלוטין ב אתר לפני הסינון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאדות את אתר diethyl עד פיגמנטים יבשים לחלוטין (10-30 דקות). הערה: פיגמנטים היבשים ניתן מטוהר עם ומשייך תחת חנקן או ארגון ב -20 ° C, בחושך עד לעיבוד נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים את הפיגמנטים יבש נפח קטן ככל האפשר של מתנול 100% (כ 1 מ&quot;ל), גם אם לא הכל מושעה לחלוטין. הוסף 4 מ&quot;ל של אצטון לפתרון, קפיצי הזכוכית בעדינות כדי לפזר את הפיגמנטים לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה פסטר, לטעון את המדגם בעדינות על טור של DEAE sepharose equilibrated אצטון 100%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קרוטנואידים Elute (להקה כתומה-צהוב) עם 100% אצטון. לאחר מכן, elute Chl A (להקה ירוקה) עם 3: 1 v / v אצטון / מתנול תערובת. הערה: היקף אצטון תערובת אצטון / מתנול הוא כ שווה לנפח של DEAE sepharose נטען על עמודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא Chl טוהר על ידי כרומטוגרפיה בשכבה דקה באמצעות 68: 25: 5: 2 dichloromethane / n-הקסאן / isopropanol / מתנול (v / v) תערובת כמו eluent 17. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתאדות הממס באמצעות המאייד רוטרי עד א Chl יבש לחלוטין (10-60 דק &#39;). הערה: יבש Chl ניתן מטוהר עם חנקן או ארגון ומאוחסנים תחת אווירה ארגון ב -20 ° C בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן Chl פתרון מניות על ידי מחדש המסת א Chl היבשה 2-4 מיליליטר של 100% אתנול. הערה: מקדם הכחדה של Chl ב 663 ננומטר הוא 74,400 -1 ס&quot;מ M -1 (83.3 ס&quot;מ -1 (מ&quot;ג / מ&quot;ל) -1) באתנול. פתרון המניות טיפוסי צריך OD של 1,860 המתאים לריכוז של 25 מ&quot;מ (23 מ&quot;ג / מ&quot;ל). הוספת 20 μl של המניה הזו כדי תחליב המכיל 5 מ&quot;ל של שלב אורגני, 1 מ&quot;ג של WSCP ב 1 מ&quot;ל של תוצאות השלב מימית בתערובת עם 10 עודף טוחנת קיפול של Chl א &#39;לעומת WSCP. </li></ol> 2. הכנת שלב אורגני של אמולסיה הערה: השלב האורגני של התחליב מורכב שמן מינרלי המכיל 4.5% (v / v) Span 80, ו -0.4% (v / v) Tween 80. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול בתוך g 50 מ&quot;ל צינור 0.2 TWeen 80, 1.8 גרם של Span 80, ו -38 גרם של שמן מינרלי. מערבבים היטב את כל המרכיבים להתקרר על הקרח. הערה: בשלב אורגני ניתן לאחסן 4 ° C עד שבוע. </li></ol> 3. הכנת מימית שלב של אמולסיה הערה: השלב המימי של התחליב יכול להיות מורכב משני WSCP המטוהר, או לחלץ גולמי של חיידקי overexpressing WSCP. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת שלב מימייה המכיל WSCP המטוהר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול חיידקי E.coli BL21 המכילים WSCP פלסמיד 12 ב 1 ליטר של מדיום LB ב 37 ° C עד OD של 0.3-0.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשרות ביטוי החלבון על ידי הוספת IPTG 1 מ&quot;מ. לאחר אינדוקציה לגדול חיידקים על 30 מעלות צלזיוס במשך 12-16 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיידקי קציר על ידי צנטריפוגה ב 5000 XG במשך 10 דקות ב 4 °. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממס את הגלולה ב חיץ מחייב ו sonicate על קרח (30 שניות על, 15 שניות את, חמש פעמים). השתמש 10 מ&quot;ל של חיץ עבור גלולה המתקבל צנטריפוגה של 250 מ&quot;ל שלLB בינוני עם תאים overexpressing החלבון. הערה: בהתאם שיטת טיהור, למאגר מחייב יכול להיות מורכב 100 מ&quot;מ חיץ פוספט, pH 7.2 או 50 מ&quot;מ טריס, pH 7.5, 500 מ&quot;מ NaCl, 5 מ&quot;מ EDTA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה lysate התא XG ב 12,000 במשך 30 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר WSCP ידי כרומטוגרפיה זיקה. בהתאם התג התמזג WSCP, לטהר חלבונים רקומביננטיים באמצעות מערכת כרומטוגרפיה הזיקה המתאימה הזמינה מסחרי עבור טיהור חלבונים בהתאם להוראות יצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכנת תחליב, השתמש WSCP מטוהר 50 מ&quot;מ חיץ פוספט, pH 7.8. ודא שכמות החלבון הסופי המשמש הכינון מחדש הוא 0.5-1.0 מ&quot;ג לכל 1 מ&quot;ל של חיץ. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת שלב מימייה המכיל lysate חיידקים גולמי עם WSCP. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל תאים E.coli BL21 המכיל WSCP להביע פלסמיד ב 250 מ&quot;ל של מדיום LB ב 37 ° C עד OD 0.3-0.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשרות ביטוי חלבון עםIPTG 1 מ&quot;מ ולגדול חיידקים לילה בשעה 30 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים חיידקיים קציר על ידי צנטריפוגה ב 5000 XG במשך 10 דקות ב 4 °. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים את גלולה ב 1-2 מ&quot;ל של 50 מ&quot;מ חיץ פוספט נתרן pH 7.8, sonicate (30 שניות על, 15 שניות את, שלוש פעמים) ו צנטריפוגות ב XG 12,000 במשך 30 דקות ב 4 °. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכינים את השלב מימית של התחליב על ידי ערבוב 0.125 מ&quot;ל של supernatant עם 0.875 מ&quot;ל של pH חיץ פוספט נתרן 50 מ&quot;מ 7.8. </li></ol></li></ol> 4. האסיפה של WSCP עם Chl ב אמולסיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 5 מ&quot;ל של תערובת-פעילי שטח שמן לתוך בקבוקון זכוכית לקרר אותו על הקרח. לפני pipetting, לוודא שכל המרכיבים של השלב האורגני מעורבבים היטב ואין הפרדת פאזות בין פעילי שטח ושמן מינרלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל של שלב מימית קר כקרח מוכנים כמו בסעיף 3 עד 5 מ&quot;ל של השלב האורגני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים שני שלבים באמצעות homogenizer רקמה 2 דקות ב -9,500 סל&quot;ד על הקרח.</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב קריטי: משלב זה והלאה, לבצע את כל צעדים נוספים תחת אור ירוק (520 ננומטר) על מנת למזער נזקי. הוסף 20 μl של 25 מ&quot;מ Chl פתרון המניות (ראו סעיף 1.13) כדי התחליב. לפזר על ידי מצליף ו היפוך בקבוקון זכוכית. ודא כי Chl מופץ באופן שווה התחליב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה אמולסיה במשך 1-2 שעות על הקרח בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת לשבור את תחליב טיפות מים נפרד מהשלב אורגני להעביר את תחליב צינורות פלסטיק 1.5 מ&quot;ל ו צנטריפוגות ב 14,000 XG במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. הערה: אם האסיפה היא מוצלחת, בשלב מהימי התחתון צריך להיות בצבע ירוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלך את שלב שמן העליון ולהוסיף 1 מיליליטר של שמן מינרלים. מערבבים היטב את שמן מינרלי עם אמולסיה pelleted ידי מערבולת או על ידי מרפרף צינור ביסודיות. ספין למטה מדגם ב 14,000 XG במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. חזור על שלב זה עד המניסקוס ברור המפריד בין מימיים כוריםשלבי שמן אל, ללא כל אמולסיה ביניים מתקבלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע פעולה זו במנדף כימי. לאחר שלבי שמן מימייה ומינרלים מופרדים בבירור, להסיר שמן מינרלים ולהוסיף 1 מיליליטר של אתר diethyl-רווי מים. וורטקס ו ספין למטה מדגם ב 14,000 XG במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. חזור על פעולה זו פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר צנטריפוגה השני, להסיר את אתר diethyl ולהשאיר את הצינורות פתוחים עבור 5-20 דקות בתוך הכובע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף, טען את השלב מהימי המכיל את WSCP / Chl קומפלקס על טור desalting ו elute עם מאגר מתאים עבור ניסויים נוספים. הערה: החלבון יציב מאגרי phosphate- ו טריס במגוון רחב של pH (6.0-7.5). המדגם יכול להיות מאוחסן על 4 ° C מוגן מפני אור עד חודש. </li></ol>

<ol><li>Bryant, D. A., Frigaard, N. -U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prokaryotic+photosynthesis+and+phototrophy+illuminated%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Prokaryotic photosynthesis and phototrophy illuminated.</a> Trends Microbiol. 14, 488-496 (2006).</li>
<li>Tronrud, D. E., Wen, J. Z., Gay, L., Blankenship, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structural+basis+for+the+difference+in+absorbance+spectra+for+the+FMO+antenna+protein+from+various+green+sulfur+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Photosynth.+Res%22%5BJournal%5D)">The structural basis for the difference in absorbance spectra for the FMO antenna protein from various green sulfur bacteria.</a> Photosynth. Res. 100, 79-87 (2009).</li>
<li>Schulte, T., Johanning, S., Hofmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+native+and+refolded+peridinin-chlorophyll-proteins+from+dinoflagellates%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Structure and function of native and refolded peridinin-chlorophyll-proteins from dinoflagellates.</a> Eur. J. Cell Biol. 89, 990-997 (2010).</li>
<li>Renger, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Water+soluble+chlorophyll+binding+protein+of+higher+plants%3A+a+most+suitable+model+system+for+basic+analyses+of+pigment-pigment+and+pigment-protein+interactions+in+chlorophyll+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Water soluble chlorophyll binding protein of higher plants: a most suitable model system for basic analyses of pigment-pigment and pigment-protein interactions in chlorophyll protein complexes.</a> J. Plant Physiol. 168, 1462-1472 (2011).</li>
<li>Satoh, H., Uchida, A., Nakayama, K., Okada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Water-soluble+chlorophyll+protein+in+Brassicaceae+plants+is+a+stress-induced+chlorophyll-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Water-soluble chlorophyll protein in Brassicaceae plants is a stress-induced chlorophyll-binding protein.</a> Plant Cell Physiol. 42, 906-911 (2001).</li>
<li>Bektas, I., Fellenberg, C., Paulsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Water-soluble+chlorophyll+protein+%28WSCP%29+of+Arabidopsis+is+expressed+in+the+gynoecium+and+developing+silique%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Water-soluble chlorophyll protein (WSCP) of Arabidopsis is expressed in the gynoecium and developing silique.</a> Planta. 236, 251-259 (2012).</li>
<li>Damaraju, S., Schlede, S., Eckhardt, U., Lokstein, H., Grimm, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+of+the+water+soluble+chlorophyll-binding+protein+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Functions of the water soluble chlorophyll-binding protein in plants.</a> J. Plant Physiol. 168, 1444-1451 (2011).</li>
<li>Horigome, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+mechanism+and+photoprotective+function+of+water-soluble+chlorophyll-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Structural mechanism and photoprotective function of water-soluble chlorophyll-binding protein.</a> J. Biol. Chem. 282, 6525-6531 (2007).</li>
<li>Reinbothe, C., Satoh, H., Alcaraz, J. -P., Reinbothe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Role+of+Water-Soluble+Chlorophyll+Proteins+in+the+Transitory+Storage+of+Chorophyllide%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">A Novel Role of Water-Soluble Chlorophyll Proteins in the Transitory Storage of Chorophyllide.</a> Plant Physiol. 134, 1355-1365 (2004).</li>
<li>Satoh, H., Nakayama, K., Okada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+and+functional+expression+of+a+water-soluble+chlorophyll+protein%2C+a+putative+carrier+of+chlorophyll+molecules+in+cauliflower%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning and functional expression of a water-soluble chlorophyll protein, a putative carrier of chlorophyll molecules in cauliflower.</a> J. Biol. Chem. 273, 30568-30575 (1998).</li>
<li>Schmidt, K., Fufezan, C., Krieger-Liszkay, A., Satoh, H., Paulsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+water-soluble+chlorophyll+protein+from+Brassica+oleracea+var.+Botrys+binds+various+chlorophyll+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Recombinant water-soluble chlorophyll protein from Brassica oleracea var. Botrys binds various chlorophyll derivatives.</a> Biochemistry. 42, 7427-7433 (2003).</li>
<li>Takahashi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning%2C+characterization+and+analysis+of+the+intracellular+localization+of+a+water-soluble+Chl-binding+protein+from+Brussels+sprouts+%28Brassica+oleracea+var.+gemmifera%29%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning, characterization and analysis of the intracellular localization of a water-soluble Chl-binding protein from Brussels sprouts (Brassica oleracea var. gemmifera).</a> Plant Cell Physiol. 53, 879-891 (2012).</li>
<li>Takahashi, S., Ono, M., Uchida, A., Nakayama, K., Satoh, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+and+functional+expression+of+a+water-soluble+chlorophyll-binding+protein+from+Japanese+wild+radish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning and functional expression of a water-soluble chlorophyll-binding protein from Japanese wild radish.</a> J. Plant Physiol. 170, 406-412 (2013).</li>
<li>Boex-Fontvieille, E., Rustgi, S., von Wettstein, D., Reinbothe, S., Reinbothe, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Water-soluble+chlorophyll+protein+is+involved+in+herbivore+resistance+activation+during+greening+of+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Water-soluble chlorophyll protein is involved in herbivore resistance activation during greening of Arabidopsis thaliana.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, 7303-7308 (2015).</li>
<li>Hughes, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magneto-optic+spectroscopy+of+a+protein+tetramer+binding+two+exciton-coupled+chlorophylls%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Magneto-optic spectroscopy of a protein tetramer binding two exciton-coupled chlorophylls.</a> J. Am. Chem. Soc. 128, 3649-3658 (2006).</li>
<li>Bednarczyk, D., Takahashi, S., Satoh, H., Noy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+water-soluble+chlorophyll-binding+proteins+with+native+hydrophobic+chlorophylls+in+water-in-oil+emulsions%5BTitle%5D)+AND+%22BBA+-+Bioenergetics%22%5BJournal%5D)">Assembly of water-soluble chlorophyll-binding proteins with native hydrophobic chlorophylls in water-in-oil emulsions.</a> BBA - Bioenergetics. 1847, 307-313 (2015).</li>
<li>Fiedor, L., Rosenbach-Belkin, V., Scherz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stereospecific+interaction+between+chlorophylls+and+chlorophyllase.+Possible+implication+for+chlorophyll+biosynthesis+and+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The stereospecific interaction between chlorophylls and chlorophyllase. Possible implication for chlorophyll biosynthesis and degradation.</a> J. Biol. Chem. 267, 22043-22047 (1992).</li>
<li>Kamimura, Y., Mori, T., Yamasaki, T., Katoh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+properties+and+a+possible+function+of+a+water-soluble+chlorophyll+a%2Fb-protein+from+brussels+sprouts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Isolation, properties and a possible function of a water-soluble chlorophyll a/b-protein from brussels sprouts.</a> Plant Cell Physiol. 38, 133-138 (1997).</li>
<li>Murata, T., Itoh, R., Yakushiji, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallization+of+water-soluble+chlorophyll-proteins+from+Lepidium+virginicum%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Crystallization of water-soluble chlorophyll-proteins from Lepidium virginicum.</a> Biochim. Biophys. Acta. 593, 167-170 (1980).</li>
</ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

המטרה שלנו היתה לפתח מערכת חדשה כללית להרכבה של חלבונים מסיסים במים מחייב כלורופיל עם פיגמנטים הידרופובי. כאן זה מוצג שמערכת הכינון מחדש החדשה המבוססת על אמולסיה W / O היא גישה כללית הוכחה לעבוד להרכבת apoproteins WSCP מן כרוב ניצנים, כרובית, חזרת יפנית pepperweed וירג&#39;יניה הביעו recombinantly ב E. coli. הנה תוצאות מוצגות מ כינון מחדש של 1 מ&quot;ג של WSCP עם פי 10 עודף טוחן של Chl א. עם זאת אפשר גם להשתמש בריכוזים נמוכים של WSCP עבור reconstitutions ויחסי Ch...

פיגמנטים הידרופובי כגון כלורופיל (Chls), bacteriochlorophylls (BChls) וקרוטנואידים הם הקו-הפקטורים העיקריים במרכזי תגובה פוטוסינתטיים וחלבוני קצירת אור מבצעות העברת אלקטרונים, ללכוד את אנרגית אור והעברה. מרכזי התגובה ורוב מתחמי הקציר Chl מחייבים אור הם חלבונים הטרנסממברני. Fenna-מתיוס-אולסון (FMO) החלבון של חיידקי גופרית ירוקה פוטוסינתטיים הלא חמצנית 1,2, ואת חלבון peridinin-Chl (PCP) של dinoflagellates 3 ​​דוגמאות יוצאות דופן של חלבוני קצירת אור מסיסים במים. החלבונים מחייבים מסיסים במים כלורופיל (WSCPs) של המצליבים, ארכוביתיים, Chenopodiaceae ו ירבוזיים צמחים 4, 5 הם עוד דוגמא ייחודית, עדיין בניגוד FMO ו PCP, אלה אינם מעורבים בקצירת אור ולא בשום התגובה פוטוסינתטיים העיקרית , ו PHY המדויק שלהםפונקציות siological הן עדיין לא ברורות 5-8. הזיקה הגבוהה Chl המחייב שלהם הובילה פונקציה הציעה כנישאים חולפים של Chls ונגזר Chl 9,10. לחלופין, זה היה שיערו כי WSCP ממלא תפקיד הדחה Chls ב תאים פגומים ומגן מפני נזק photooxidative הנגרמת Chl 7,11-13. לאחרונה, הוצע כי פונקציות WSCP כמעכב פרוטאז וממלא תפקיד במהלך התנגדות אוכלי עשב כמו גם מסדיר מוות של תאים במהלך התפתחות הפרח 14. WSCPs נחלקים לשתי קבוצות עיקריות על פי מאפייני photophysical שלהם. המחזור הראשון (אני בכיתה, למשל. מן כף אווז לבנה) עשוי לעבור photoconversion על תאורה. Class II WSCPs מצמחים Brassica, שאינם עוברים photoconversion 5,10, מחולקים נוספת לכיתה IIa (למשל., מ oleracea Brassica, sativus Raphanus) ו IIb (למשל., מן שחליים virginicum </em&gt;). המבנה של הכיתה IIb WSCP מן שחליים virginicum נפתרה על ידי קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן על 2.0 ברזולוציה 8. הוא מגלה homotetramer סימטרי שבו יחידות משנת חלבון יוצרי ליבה הידרופובי. למקטע כל נקשר Chl אחת שתוצאתה הסדר הדוק של ארבעה Chls מקרוב ארוז בתוך core.This פשוט כל הסדר Chl עושה WSCPs מערכת מודל שימושי פוטנציאלי ללימוד מחייב והרכבה של מתחמי Chl-חלבון, ואת ההשפעות של השכנה Chls וסביבות חלבון על תכונות ספקטרליות ואלקטרוניקה של Chls הפרט. יתר על כן, היא עשויה לספק תבניות לבניית חלבונים מלאכותיים Chl מחייב כי ניתן להשתמש עבור מודולים אור-קציר בהתקנים המבצעים פוטוסינתזה מלאכותית. מחקרים קפדניים של WSCPs ילידי הארץ הם ​​לא ריאליים כי מתחמי מטוהרי מצמחים תמיד מכילים תערובת הטרוגנית של tetramers עם שילובים שונים של Chlו Chl ב 9. לפיכך, שיטה להרכבת WSCPs recombinantly הביע עם Chls במבחנה נדרשה. זה מוטל בספק על ידי המים המסיסים הזניחה של Chls מה שהופך את זה אי אפשר להרכיב את המורכבות במבחנה פשוט על ידי ערבוב apoproteins מסיס במים עם פיגמנטים בתמיסות מימיות. במבחנת הרכבה ידי ערבוב apoproteins עם ממברנות תילקואיד 15 הודגם, אבל שיטה זו מוגבלת בהווה Chls הילידים תילקואיד. שמידט ואח &#39;. דיווח על הרכבת כמה נגזרים Chl ו BChl עם WSCP מ כרובית (CaWSCP) על ידי recombinantly לבטא חלבון מתויג-היסטידין ב E. coli לשתק אותו על עמודה Ni-זיקה והחדרת נגזרים Chl solubilized ב דטרגנטים 11. כינון מחדש בהצלחה של WSCPs רקומביננטי מ א thaliana 6, וכרוב ניצנים (BoWSCP), צנון בר יפני (RshWSCP)ד וירג&#39;יניה pepperweed (LvWSCP) על ידי שיטה דומה גם דווח. כאן, אנו מציגים רומן, כללית, שיטה פשוטה להרכבת Chls עם WSCP שאינו דורש תיוג או לשתק את החלבונים. היא מסתמכת על הכנת אמולסיות מהפתרונים מהימיים שלהם של apoproteins מסיס במים בשמן מינרלים. החלבונים ובכך הם הגלום מים ב-שמן (W / O) microdroplets עם משטח גבוה מאוד יחס נפח 16. קו-פקטורים הידרופובי אז הם מומסים בשמן מוצגים בקלות לתוך טיפות משלב שמן. אנו מדווחים על השימוש בשיטה להרכבה של מספר הגירסות של apoproteins WSCP הביעו recombinantly ב E. coli עם Chl א. אנו מדגימים את ההרכבה מ lysate הגולמי של חיידקים ביתר-WSCP אשר עשוי לשמש כמערכת הקרנה לפיתוח חלבוני Chl מחייבים רומן.

<table><tbody><tr><td>שמן מינרלי</td><td>Sigma</td><td>M5904</td><td></td></tr><tr><td>Span80</td><td>Sigma</td><td>85548</td><td></td></tr><tr><td>Tween80</td><td>Sigma</td><td>P8074</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Scale Mini Profinity eXact Cartridges</td><td>Bio Rad</td><td>10011164</td><td>כרומטוגרפיה של זיקה לטיהור WSCP עם רצף מקורי.</td></tr><tr><td>הטור שלו Trap HF</td><td>GE Healthcare Life Science</td><td>17-5248-02</td><td>כרומטוגרפיה של זיקה לטיהור WSCP עם His-tag</td></tr><tr><td>DEAE Sepharose Fast Flow GE</td><td>Healthcare Life Science</td><td>17-0709-01</td><td>מדיום כרומטוגרפיה לטיהור כלורופיל</td></tr></tbody></table>

המים אמולסיות שמן: מערכת חדשה להרכבת חלבונים מסיסים במים כלורופיל מחייב עם פיגמנטים הידרופובי

Water in Oil Emulsions: A New System for Assembling Water-soluble Chlorophyll-binding Proteins with Hydrophobic Pigments

כלורופיל (Chls) ו bacteriochlorophylls (BChls) הוא הקו-הפקטורים העיקריים המבצעות קציר פוטוסינתטיים אור העברת אלקטרונים. הפונקציונליות שלהם תלויה באופן קריטי לארגון הספציפי שלהם בתוך קומפלקסי חלבונים הטרנסממברני multisubunit גדולות ומסועפים. על מנת להבין ברמה המולקולרית איך קומפלקסים אלה להקל המרת אנרגית שמש, זה הכרחי כדי להבין חלבון-פיגמנט, ואינטראקציות פיגמנט-פיגמנט, והשפיע על דינמיקה נרגשת. אחת דרכים להשיג הבנה כזו היא על ידי בנייה ולומד קומפלקסים של Chls עם חלבונים רקומביננטיים מסיסים במים פשוטים. עם זאת, המשלב בתוכו את Chls ו BChls lipophilic לחלבונים מסיסים במים קשה. יתר על כן, אין שיטה כללית, אשר יכול לשמש להרכבת חלבונים מסיסים במים עם פיגמנטים הידרופובי. הנה, אנחנו מדגימים מערכת תפוקה פשוט גבוהה המבוססת על אמולסיות מים-in-שמן, המאפשרת את תחתembly של חלבונים מסיסים במים עם Chls הידרופובי. השיטה החדשה קיבלה תוקף על ידי הרכבת גרסאות רקומביננטי של חלבון מסיס במים כלורופיל מחייב של צמחים מצליבים (WSCP) עם Chl א. אנו מדגימים את ההרכבה המוצלחת של Chl lysates גולמי באמצעות של WSCP להביע E. תא קולי, אשר עשוי לשמש לפיתוח מערכת מסך גנטי חלבונים מסיסים במים הרומן Chl מחייב, וכן לבדיקות של אינטראקציות Chl בחלבונים תהליכי ההרכבה.

<html> Apoproteins WSCP רקומביננטי הורכב עם Chl תחליבי W / O על פי הפרוטוקול המתואר בסעיף הקודם. הפרוטוקול יושם באמצעות שלבי מימייה המכילים גם WSCPs הטהור, או lysates תאי E.coli overexpressing WSCP (איור 1). הפרוטוקול הוא פשוט, מהיר ואינו דורש שום ציוד מיוחד מלבד homogenizer רקמות. ספיגת ו- CD ספקטרום של Chl קו...

כתב יד זה מתאר שיטה פשוטה תפוקה גבוהה להרכבת חלבונים מסיסים במים עם פיגמנטים הידרופובי אשר מבוססים על אמולסיות מים-in-שמן. אנו מדגימים את היעילות של השיטה באסיפה של כלורופיל ילידים עם ארבע וריאציות של מסיס-מים כלורופיל רקומביננטי מחייבים חלבונים (WSCPs) של צמחי Brassica לידי ביטוי E. coli.

Chlorophylls (Chls) and bacteriochlorophylls (BChls) are the primary cofactors that carry out photosynthetic light harvesting and electron transport. ...

המטרה הכוללת של טכניקה זו היא לאפשר שילוב של כלורופילים שאינם מסיסים במים בתוך אתרי הקשירה של חלבונים מסיסים במים. שיטה זו מאפשרת הרכבה של כלורופילים עם חלבונים רקומביננטיים, מה שמאפשר מחקרים מעמיקים של אינטראקציות בין כלורופיל לחלבון ופותחת אפשרויות חדשות לבניית קומפלקסים חדשניים של כלורופיל-חלבון. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא אינה דורשת סימון (tagging) או קיבוע של החלבונים.לפיכך, הוא מתאים היטב לבדיקות סריקה. את הפרוצדורה תדגים Dominica Bednarczyk, פוסט-דוקטורנטית בקבוצת המחקר שלי. בעת הכנת תמיסות המלאי הבאות, בצעו את כל שלבי הכנת הכלורופיל תחת מנדף כימי תחת אור ירוק או בחושך כדי לצמצם נזקי פוטו-אוקסידציה.יש להוסיף תמיד חנקן או ארגון לפני הקפאת הפיגמנטים לאחסון, ולוודא שכל הממסים הם בדרגת ניתוח (analytical grade). לתחילת התהליך, שקלו כחמישה גרמים של תאי Spirulina platensis ליופיליזיים או תאי ציאנובקטריה אחרים המכילים chlorophyll a בלבד או chlorophyll-a בממברנות של תילקואידים, ורסקו אותם באמצעות מכתש ועלי. השלב הקריטי במהלך מיצוי הכלורופיל הוא לוודא שתאי הציאנובקטריה עברו ליופיליזציה יסודית, ולהבטיח הסרה מלאה של מים מה-DEAE-Sepharose באמצעות מספר שטיפות באצטון.העמסו את התאים המרוסקים על עמודת זכוכית ושטפו את הרקמה באמצעות כ-50-100 מיליליטר של 100% acetone כדי להסיר את הקרוטנואידים. לאחר השטיפה, השליכו את הפראקציה הכתומים-ירוקה שאלוטה. הצבע בפועל עשוי להשתנות מכתום-ירוק לירוק, בהתאם לתרבית הציאנובקטריה ולתנאי הגידול.החליפו את האצטון ב-100% methanol ואספו את הפракציה הירוקה המכילה chlorophyll a. כאשר צבע הפракציה שנשטפה משתנה מירוק כהה לירוק בהיר, הפסיקו את השטיפה. לאחר מכן, באמצעות מאיד סיבובי עם אמבט מים שאינו עולה על 30 °C, אידו את ה-methanol עד שהתמצית תהיה יבשה לחלוטין, ולאחר מכן השתמשו בנפח קטן של diethyl ether כדי להמיס לחלוטין את הפיגמנטים מהתמציות המיובשות וסננו את התמיסה דרך צמר גפן, תוך שימוש בנפח קטן נוסף של ether כדי לשטוף את הפיגמנטים מצמר הגפן.יש לאדות את הדיאתיל אתר עד שהפיגמנטים יתייבשו לחלוטין. אם עוצרים בשלב זה, יש לשמור את הפיגמנטים היבשים תחת חנקן או ארגון בטמפרטורה של 20 °C בחושך עד להמשך העיבוד. כדי להמשיך בהכנת כלורופיל a, יש להמיס חלקית את הפיגמנטים היבשים בנפח הקטן ביותר האפשרי של 100% acetone, ולאחר מכן להוסיף 4 milliliters של acetone לתמיחה ולסובב את הבקבוק כדי להמיס את הפיגמנטים לחלוטין.הטענו בעדינות את הדגימה על עמודת DEAE-Sepharose שהושרתה ב-100% acetone באמצעות פיפט פסטור, ואלוטו את הקרוטנואידים באמצעות 100% acetone. לאחר מכן, השתמשו בתערובת acetone-methanol ביחס נפחי של 3:1 כדי לאלוט את הכלורופיל a. ניתן להשתמש בפנס כדי להאיר לזמן קצר את העמודה במהלך האלוציה על מנת להבחין בצבעי הפיגמנטים בפועל.באמצעות כרומטוגרפיה בשכבה דקה, ודאו את טוהר ה-chlorophyll a באמצעות יחס נפחי של 68:25:5:2 של dichloromethane ו-hexane, isopropanol ו-methanol כדי להעביר את הדגימה. לאחר מכן, באמצעות מאייד סיבובי (rotary evaporator), אידו את הממס עד שה-chlorophyll a יבש לחלוטין. להכנת תמיסת סטוק של chlorophyll a, המיסו מחדש את ה-chlorophyll a היבש ב-2-4 milliliters של 100% methanol.להכנת הפאזה האורגנית של האמולסיה, שקלו למבחנה של 50 milliliter כ-0.2 grams של Tween 80, כ-1.8 grams של Span 80 ו-38 grams של שמן מינרלי. ערבבו היטב את הרכיבים והניחו את התמיסה על קרח לקירור. להכנת פאזה מימית המכילה חלבון קושר כלורופיל מנוקה מסיס במים, או WSCP, גדלו חיידקי E.coli BL21 המכילים את הגן WSCP בליטר אחד של מצע LB בטמפרטורה של 37 degrees Celsius עד להגעה ל-OD600 של 0.3 עד 0.6.הוסיפו 1 millimolar IPTG כדי להשרות ביטוי של החלבון וגדלו את החיידקים ב-30 degrees Celsius למשך 12-16 שעות, ולאחר מכן אספו את החיידקים באמצעות סרכוז ב-5000 G וב-4 degrees Celsius למשך 10 דקות. המיסו את המשקע באמצעות באפר המתאים לכרומטוגרפיית זיקה, העבירו את תרחיף החיידקים למבחנות קטנות יותר ובצעו סוניקציה על קרח. לאחר סרכוז של הליזט, טהרו את חלבוני ה-WSCP הרקומיננטיים המסומנים באמצעות מערכת כרומטוגרפיית זיקה מתאימה הזמינה מסחרית לטיהור חלבונים, בהתאם להוראות היצרן.הכינו את הפאזה המימית של האמולסיה על ידי החלפת הבאפר לבאפר פוספט 50 millimolar ב-pH 7.8 והתאמת ריכוז ה-WSCP המנוקה ל-0.5 עד 1 milligram per milliliter. כדי להכין פאזה מימית המכילה ליזט חיידקי גולמי עם WSCP, גדלו תאי E.coli BL21 המכילים פלסמיד המבטא WSCP ב-250 milliliters של LB ב-37 degrees Celsius עד לשלב הלוגריתמי (log phase). הוסיפו 1 millimolar IPTG כדי להשרות את ביטוי החלבון וגדלו את החיידקים ב-30 degrees Celsius למשך לילה.ביום למחרת, לאחר קציר תאי החיידקים, השתמש ב-1-2 milliliters של sodium phosphate buffer בריכוז 50 millimolar ב-pH 7.8 כדי להמיס את המשקע. לאחר מכן, לאחר ביצוע סוניקציה, סבב את הליזט בצנטריפוגה ב-12,000 G ובטמפרטורה של 4 degrees Celsius למשך 30 דקות. הכן את הפאזה המימית של האמולסיה על ידי ערבוב של 0.125 milliliters של על-נוזל עם 0.875 milliliters של sodium phosphate buffer בריכוז 50 millimolar ב-pH 7.8.כדי להרכיב WSCP עם chlorophyll a באמולסיה, העבירו 5 milliliters של תערובת שמן-סורפקטנט מעורבבת היטב לבקבוק זכוכית וקררו על קרח. הוסיפו 1 milliliter של פאזה מימית קרה שהוכנה זה עתה, והשתמשו בהומוגנייזר רקמות ב-9, 500 RPM על קרח למשך שתי דקות כדי לערבב את שתי הפאזות. מרגע זה ואילך, תוך ביצוע כל השלבים תחת אור ירוק כדי למזער נזק פוטוכימי, הוסיפו 20 microliters של תמיסת סטוק של chlorophyll a בריכוז 25 millimolar לאמולסיה.פזרו את התוכן באמצעות נקישה והפיכה של מבחנת הזכוכית כדי להבטיח שה-chlorophyll a מפוזר באופן שווה באמולסיה, ולאחר מכן הדגירו על קרח בחושך למשך 1-2 שעות. השלב הקריטי במהלך הכנת האמולסיה הוא קירור הן של הפאזה המימית והן של הפאזה האורגנית לפני הערבוב. לאחר מכן, כדי לפרק את האמולסיה ולהפריד את טיפות המים מהפאזה האורגנית, העבירו את האמולסיה למבחנות פלסטיק בנפח 1.5-milliliter וסבבבו בצנטריפוגה ב-14,000 G בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות.יש להסיר את פאזת השמן העליונה ולהוסיף 1 milliliter של שמן מינרלי לפאזה התחתונה, ולאחר מכן לערבב היטב באמצעות וורטקס או על ידי הפיכת המבחנה. לאחר סבב צנטריפוגה של הדגימה, הסר את פאזת השמן העליונה וחזור על הוספת השמן המינרלי והצנטריפוגה עד להשגת מניסקוס ברור המפריד בין הפאזה המימית לפאזת השמן המינרלי ללא אמולסיה ביניהן. כעת, הוסף לפאזה המימית 1 milliliter של diethyl ether רווי במים.לאחר מכן, לאחר ערבוב הדגימה ב-vortex, סובבו אותה בצנטריפוגה ב-14,000 G למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הצנטריפוגה השלישית, בתוך מנדף כימיים, הסירו את ה-diethyl ether והשאירו את המבחנות פתוחות למשך 5-20 דקות. לבסוף, העמיסו את הפאזה המימית המכילה את קומפלקס ה-WSCP-chlorophyll a על עמודת הסמכת מלחים (desalting column) ובצעו אלוציה באמצעות באפר המתאים לניסויים עתידיים.יש לאחסן את הדגימה בטמפרטורה של 4 degrees Celsius הרחק מאור למשך עד חודש אחד. באמצעות הפרוטוקול המתואר בסרטון זה, א protein-apoproteins רקומביננטיים של WSCP הורכבו עם chlorophyll a באמולסיות של מים ושמן. מוצגים כאן הבליעות וספקטרום ה-CD של קומפלקסים של chlorophyll a עם ארבעה וריאנטים רקומביננטיים של WSCP.התוצאות דומות במיקום הסרט של קצה הספקטרום לספקטרומים שדווחו בעבר עבור הקומפלקסים הטבעיים המתאימים. איור זה מראה הרכבה חיובית של WSCP עם כלורופיל a בליזאטים מתאי המבטאים WSCP, כפי שניכר מהצבע הירוק של הפאזה המימית. תוצאה זו מדגימה את הפוטנציאל של אמולסיות מים ושמן כמערכת סינון מהירה להרכבה חיובית של WSCPs עם כלורופילים.כפי שהודגם כאן, טיפות של ליזטים המכילים WSCP מציגות פלואורסצנציה מובחנת של כלורופיל a בתמונות מיקרוסקופ קונפוקלי. מכך עולה כי ניתן לזהות הרכבה מוצלחת של קומפלקס WSCP-כלורופיל ישירות בטיפות המים, וכי הדבר עשוי להוות בסיס למערכות סריקה מבוססות אמולסיית מים ושמן. ברגע שהטכניקה נשלטת, ניתן לבצעה במשך חמש שעות אם היא מבוצעת כראוי.במהלך ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור כי יש לעבוד עם כלורופילים במהירות, ללא חשיפה של הכלורופיל לאור ולחמצן. לאחר פיתוחה, טכניקה זו אפשרה לנו להכין מגוון רחב של חלבוני קשירת כלורופיל מסיסי מים, המשמשים לבחינת השפעת הסביבה החלבונית על התכונות האלקטרוליטיות והספקטרליות של כלורופילים. לאחר צפייה בסרטון זה, תגמירו להבנה טובה של אופן המיצוי והטהרה של כלורופילים מציאנובקטריה והרכבתם בחלבונים מסיסי מים באמצעות אמולסיות של מים ושמן.אל תשכחו כי עבודה עם ממסים אורגניים, כגון אתר, מתנול או אצטון, עלולה להיות מסוכנת, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון עבודה תחת מנדף כימיים, בעת ביצוע הליך זה.

water-oil-emulsions-new-system-for-assembling-water-soluble

Research

JoVE Journal

Chemistry

כימיה

פרוטוקול זה מפרט את הבנייה מחדש של קומפלקסים לקצירת אור במבחנה. חלבוני הממברנה האינטגרליים הללו מתאמים כלורופיל וקרוטנואידים ואחראים לקצירת אור בצמחים גבוהים יותר ובאצות ירוקות.

במבחנת כינונה מחדש של מכלולי אור קציר של צמחים ואצות ירוקות

מולקולות צבע אורגניות וננו-חלקיקים הממירים חומצה אולאית אינם מסיסים במים. פרוטוקול זה מתאר שיטת 'הכנס והפעל' המאפשרת העברה של מולקולות צבע אורגניות והמרת חלקיקים מהממס ההידרופובי הראשוני שלהם למים.

שיטה &#39;הכנס והפעל&#39; ליצירת Nanoassemblies מים מסיסות המכיל פולימר amphiphilic, צבעים אורגניים וupconverting חלקיקים

מאמר זה מדווח על שיטות מעשיות להכנת הידרוג'לים בסרטים עצמאיים ובממברנות ספוגות ולאפיון תכונותיהם הפיזיקליות, כולל תכונות הובלת מים.

סינתזה של הידרוג עם מאפייני Antifouling ופלטות לטיהור מים

פרוטוקול זה מתאר אמצעי ישים קלינית המסת תרכובות הידרופוביות סביבה מימית באמצעות שילובים של הרכבה עצמית פפטיד ופתרונות חומצת אמינו. השיטה שלנו פותר מגבלה עיקרית של הרפוי הידרופוביות, שחסרה אמצעי בטוחה ויעילה, המסיסות ושיטות משלוח לתוך הגדרות קליניים.

מסיסות של תרכובות הידרופוביות בתמיסה המימית באמצעות שילובים של הרכבה עצמית פפטיד ושל חומצות אמינו

כאן אנו מציגים שני פרוטוקולים מרביים הכינון של קרום חלבונים לתוך fusogenic proteoliposomes, פיוז'ן של proteoliposomes כזה עם היעד bilayers השומנים למסירה ללא אבקת החלבונים האלה ממברנה לתוך bilayer postfusion. השילוב של גישות אלה מאפשר הרכבה מהירה וקלה לשליטה של מערכות ממברנה רב רכיבים מורכבים.

ללא דטרגנט מרביים להתחדשות ומבנה של קרום חלבונים לתוך השומנים Bilayers באמצעות Fusogenic משלימים טעונה Proteoliposomes.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבודד fucoxanthin כלורופיל a/c מחייב חלבונים (FCP) מ- diatoms ועד לשלב אותם בתוך ליפוזומים עם יצירות השומנים טבעית ללמוד עירור העברת אנרגיה על שינויים בהרכב יון.

בידוד, שילוב אנטנות קציר-אור של צורניות Cyclotella Meneghiniana בתוך ליפוזומים עם שומנים תילקואיד

בממשק של ממיסים אורגניים ומימית, מותאם המותאם לאלסטין וחלבונים בעלי מבנה מולקולרי מורכבים כגון שלפוחיות, סיבים ומדבקות מופעלות על ידי פרמטרים סביבתיים. פרוטוקולי ההרכבה המתוארים מניבים תאים מבוססי חלבון ממברנה (PMBCs) עם מאפיינים שניתן לסמוך עליהם, המאפשרים כימוס של מטענים שונים.

בימוי האסיפה של אלסטין כמו חלבונים לתוך הגדרת מבנים Supraולקולריים מוגדרים מחוץ לגופית

אנו מדווחים על פרוטוקול לייצור קרום שומנים היברידי בממשק המים/אוויר על ידי סימום ביטל השימנים עם נחושת (II) 2,9,16,23-טטרה-אטרה-butyl-29H,31H-phthalocyanine (CuPc) מולקולות. קרום שומנים היברידית וכתוצאה מכך יש מבנה כריך שומנים/CuPc/שומנים. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם גם על היווצרות של ננו-חומרים פונקציונליים אחרים.

הרכבה עצמית של קרום שומנים היברידי מסוממים עם מולקולות אורגניות הידרופוביות בממשק מים/אוויר

שמנים המשמשים ליישומי אספקת תרופות יכולים לשבש את פרופיל השומנים של החולים, דבר שאינו רצוי במחלות לב וכלי דם. שמנים עשירים בחומצות שומן אומגה-3 הם חלופה בריאה לשמנים קונבנציונליים ויש להם פוטנציאל עצום למערכות העברת תרופות בתחליב עצמי.

ננו-תחליב עצמי של שמנים בריאים לשיפור המסיסות של תרופות ליפופיליות

הפרוטוקול הנוכחי מתאר הרכבת ליפוזומים בסיוע אוקטאנול (OLA), טכניקה מיקרופלואידית ליצירת ליפוזומים תואמים ביולוגית. OLA מייצרת ליפוזומים חד-מפוזרים בגודל מיקרון עם אנקפסולציה יעילה, המאפשרת ניסויים מיידיים על שבב. פרוטוקול זה צפוי להתאים במיוחד לביולוגיה סינתטית ולמחקר תאים סינתטיים.

הרכבת ליפוזום בסיוע אוקטאנול על שבב לביו-הנדסה

פרוטוקול זה מתאר את מערכת סינתזת החלבונים ללא תאים (CFPS) המשמשת לבניית תאים סינתטיים. הוא מתאר שלבי מפתח עם תוצאות מייצגות במיקרו-תאים שונים. מטרת הפרוטוקול היא לבסס שיטות עבודה מומלצות למעבדות מגוונות בקהילת התאים הסינתטיים, ולקדם את ההתקדמות בפיתוח תאים סינתטיים.

מערכת סינתזת חלבונים ללא תאים לבניית תאים סינתטיים

למדו שיטת הרכבת חלבונים מסיסים במים עם כלורופיל באמולסיות מים בשמן. טכניקה זו מאפשרת מחקר מעמיק של אינטראקציות כלורופיל-חלבון ללא צורך בתיוג חלבונים.

המים אמולסיות שמן: מערכת חדשה להרכבת חלבונים מסיסים במים כלורופיל מחייב עם פיגמנטים הידרופובי

גלה סרטונים נוספים