אופטימיזציה של assay Scratch הפצע כדי לזהות שינויים בנדידת תאי Murine mesenchymal סטרומה לאחר נזק על ידי תמצית עשן סיגריות מסיס

המטרה הכוללת של בדיקה זו היא לזהות שינויים ביכולת הנדידה של תאי סטרומה מזנכימליים ריאתיים לאחר נזק עם תמצית עשן סיגריות מסיסה. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה הרגנרטיבית של הריאות, כולל כיצד ניתן לשפר את יכולת הנדידה של תאי אב ריאה כדי לסייע בתיקון הריאות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא עברה אופטימיזציה כדי לספק מדידות כמותיות טובות יותר לנדידת תאים תוך שמירה על חסכון לביצוע וקל להתאמה אישית שלנו.

בהדגמה זו, בדיקת השריטה תשמש לכימות יכולת הנדידה של תאי סטרומה מזנכימליים של ריאות עכברים, או MSCs. לאחר חשיפה לתמצית עשן סיגריות מסיסה, ה-MSCs גדלים במדיה שלמה על לוחות של 60 מילימטר וניזוקים כמתואר בטקסט הפרוטוקול. מפגש מתאים חשוב לבדיקת השריטה מכיוון שהוא מבטיח שתוכנת ההדמיה יכולה לזהות נכון את גבולות השריטה.

דוגמה זו מציגה MSCs במפגש של 95% המתאים לגירוד בסביבה סטרילית. הסר את המכסה מצלחת של MSCs פגומים והנח קצה ישר, כגון סרגל פלסטיק מעוקר על פני השפה העליונה של הצלחת. קצה ישר ממזער את כמות התאמות הסיבוב הדרושות לצלחת כאשר היא מונחת מאוחר יותר על במת המיקרוסקופ להדמיה.

מבלי להסיר את המדיה, השתמש בקצה פיפטה סטרילי של 200 מיקרוליטר המונחה על ידי הקצה הישר הסטרילי כדי ליצור ארבע שריטות מקבילות על פני הצלחת, במרחק של כחמישה מילימטרים זו מזו ובאורך של 50 מילימטרים. יצירת שריטות מרובות על צלחת של 60 מילימטר אינה משנה את המיקרו-סביבה באופן המשפיע על נדידת התאים עבור MSCs, אך עשויה להוות שיקול עבור סוגי תאים אחרים. שאפו את המדיה ושטפו בעדינות את הצלחת עם שני מיליליטר של מדיה שלמה חמה מראש.

זה מונע מהתאים להיצמד למרכז השריטה ומסיר תאים שהשתחררו מהשריטה. החלף בארבעה מיליליטר של מדיה שלמה טרייה באמצעות תווית טוש סטרילית וקבועה כל שריטה מאחת עד ארבע בצד התחתון של הצלחת במקומות שלא יפריעו להדמיה. יש לצלם את התמונות הראשוניות של כל שריטה מכיוון שחשוב להשוות תמונות מאותה שריטה לפני ואחרי ההעברה, מכיוון שיכולה להיות שונות ברוחב השריטה.

אם בדיקת השריטות מתבצעת על מספר צלחות, מומלץ לצלם תמונות ראשוניות של כל השריטות בצלחת אחת לפני ביצוע שריטות בצלחת הבאה. השתמש במיקרוסקופ ניגודיות פאזה הפוך עם מצלמה כדי לרכוש את התמונות הדרושות לניתוח. מקם את לוחית התרבות על המיקרוסקופ והשתמש במטרה בהספק נמוך כדי לאתר שריטות.

מספר אחת. הכרחי שהשריטה תופיע אופקית לחלוטין על המסך תוך שמירה על השריטה אופקית לחלוטין ובמרכז שדה הראייה, להשיג כמה שיותר תמונות כדי להקיף 90% מאורך השריטה. השג תמונות מחלקים נפרדים של השריטה ללא חפיפה בין התמונות.

אין לצלם תמונות מ-5% הראשונים והאחרונים של אורך השריטה מכיוון ששבירת האור בשולי צלחת התרבית חושפת את התמונות והופכת אותן לבלתי ניתנות לניתוח. שמור תמונות מאפס, מספר אחת בתיקיה. השג תמונות לשריטות שתיים, שלוש וארבע באותו אופן, ושמור תמונות מכל שריטה בתיקיה נפרדת.

החזר את הצלחות לחממה מיד לאחר הדמיה ראשונית זו. תנו לתאים לנדוד במשך ארבע עד שבע שעות לפני תחילת הבדיקה הזו. הורד את תוכנת Image J והתקן את תוסף כלי ריפוי הפצעים.

פתח את קובץ התמונה בתמונה J, ולאחר מכן לחץ על תהליך ומצא קצוות כדי להדגיש את התאים המקיפים את השריטה עבור כלי ריפוי הפצעים. כדי לחשב את שטח האחסון הזמני, לחץ על התאמת תמונה וסף צבע, ובתפריט הנפתח עם התווית צבע סף, שנה את הערך ל-BNW בתפריט סף הצבע. הזז את המחוון התחתון לגמרי ימינה כדי להפוך את התמונה לשחורה לחלוטין, ולאחר מכן כוונן את המחוון העליון כדי ליצור ניגודיות מקסימלית בין השריטה לחזית התא.

כוונן לאט את מחוון הבהירות העליונה משמאל לימין עד שהתמונה תציג בצורה נקייה את קווי המתאר של השריטה. לאחר זיהוי קצוות השריטה, לחץ על כלים נוספים. בסרגל הכלים של התמונה J בחר כלי ריפוי פצעים MRI מהתפריט הנפתח ולחץ על כפתור M כדי להדגיש את אזור השריטה ולהוציא את האזור המחושב.

בחלון מוקפץ של תוצאות, העתק והדבק את כל המספרים מחלון התוצאות בגיליון אלקטרוני של Excel. הקפד להפריד נתונים משריטות בודדות. לאחר שהתאים נדדו במשך ארבע עד שבע שעות, חזור על הליך רכישת התמונה עבור השריטות מצלמות את הלוחות באותו סדר שבו הם נשרטו, כך שלתאים בכל צלחת היה זמן שווה לנדוד.

ניתן לדמות את התאים במספר נקודות זמן בהתאם לרגישותם לשינויי טמפרטורה ו-pH. לאחר מכן מנותחים תמונות השריטה הסופיות באמצעות תמונה J באותו אופן כפי שהודגם עבור תמונות השריטה הראשוניות. ניתן גם לחשב אזורי טיטה כדי לכמת את ההעברה, נכון.

מפגש הוא קריטי להצלחת בדיקת השריטות. שריטה מוצלחת של MSCs ריאות עכברים במפגש של 95% מוצגת כאן. לעומת זאת, מפגש של 70% נמוך מדי לשריטה מוצלחת ויכול לייצר גבולות כוזבים.

אלה הן תמונות מקוריות מייצגות לפני ההעברה ואחרי ההעברה עם גבולות אזור טיוטה מתאימים כפי שהוגדרו על ידי תוכנת ההדמיה. גרפים אלה מציגים את שטח השריטה הממוצע המחושב בפיקסלים עבור כל אחת מארבע השריטות שבוצעו על פני צלחת של MSCs של ריאות עכברים במפגש של 95% לפני או אחרי הנדידה עם חשיפה לתמצית עשן סיגריות של 0% או 4%. השוואה של השינוי הממוצע המחושב באזור השריטה גילתה פחות נדידה של MSC ריאות עכברים לאחר חשיפה לתמצית עשן סיגריות של 4%.

בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לייעל ולנטר בקפידה את מפגש התאים עבור סוג התא המסוים איתו עבדנו ולתרגל יצירת השריטות כדי להבטיח שהן אחידות ככל האפשר. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע טכניקות אחרות כמו אימונוהיסטוכימיה כדי לענות על שאלות נוספות לגבי שינויים וביטוי חלבונים שעשויים להשפיע על נדידת התאים.