הפקה רציפה של המסיס ובלתי מסיס אלפא-סינוקלאין ממוח פרקינסון

המטרה הכוללת של מתודולוגיה זו היא לחלץ אלפא-סינוקלאין מסיס ובלתי מסיס ממוחות פרקינסוניים לאחר המוות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בחקר מחלת הפרקינסון. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שמדובר בטכניקה פשוטה יחסית המשתמשת בריאגנטים ומכשירי מעבדה נפוצים.

לאחר הכנת התמיסות והמאגרים הדרושים, התחל בהנחת דגימה של 0.5 גרם של רקמת גרעיני בסיס קפואה על צלחת פטרי קטנה. השתמש בלהב אזמל סטרילי כדי לטחון במהירות לשברים מרובעים של מילימטר אחד. אוספים את הרקמה הטחונה לצינור של 15 מיליליטר, ומוסיפים 10 נפחים של קר כקרח, 1X TBS לשפופרת.

הומוגניזציה של הדגימות באמצעות הומוגנייזר מכני ב-20,000 סל"ד למשך 10 שניות. לאחר מכן מצננים על קרח במשך שתי דקות. חזור על ההומוגניזציה שלוש פעמים, וקירור על קרח בכל פעם.

צנטריפוגה את ההומוגנאט ב-10,000 גרם למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. העבירו את הסופרנטנט ההומוגני הגולמי לצינורות צנטריפוגות פוליקרבונט, וצנטריפוגה ב-100,000 גרם למשך שעה בארבע מעלות צלזיוס. העבירו את הסופרנטנט לצינורות מקוררים על קרח, ושמרו אותו כחלק המסיס TBS.

שטפו בחמישה נפחים של מאגר 1X TBS, וצנטריפוגה ב-100,000 גרם למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס. שאפו והשליכו את הסופרנטנט. ואז חזור על הכביסה.

שטיפה יסודית של כדורים בין שלבי אולטרה-צנטריפוגה היא קריטית להצלחת הליך זה. לאחר שאפשרו לדגימות להגיע לטמפרטורה של 10 מעלות צלזיוס כדי למנוע משקעי SDS, הוסיפו חמישה נפחים של 1X TBS-SDS והשעו מחדש את הגלולה הסופית על ידי סוניקציה למשך 10 שניות ב-20 קילו-הרץ בטמפרטורת החדר. אולטרה צנטריפוגה ב 100, 000 גרם למשך 30 דקות ב -25 מעלות צלזיוס.

לאחר אולטרה-צנטריפוגה, העבירו את הסופרנטנט לצינורות מקוררים על קרח, ושמרו כחלק המסיס SDS. הוסף לגלולה חמישה נפחים של מאגר 1X TBS-SDS בטמפרטורת החדר, וצנטריפוגה ב-100, 000 גרם למשך 15 דקות ב-25 מעלות צלזיוס. השלך את מאגר הכביסה וחזור על הכביסה.

לאחר השלכת הסופרנטנט, הוסף 50 מיקרוליטר של 1X TBS-SDS-Urea והמיס באמצעות סוניקטור המוגדר על 20 קילו-הרץ למשך 10 שניות. סמן דגימה זו כחלק המסיס באוריאה. חיוני לוודא היטב שכל החלבונים הבלתי מסיסים מופקים בהליך.

יש לדלל דגימות TBS-SDS-Urea אחת לאחת עם מאגר TBS 1X כדי לאפשר תאימות עם ריאגנטים לבדיקת חלבון, ולבדוק כל שבר עבור תכולת החלבון הכוללת באמצעות ערכת בדיקת חלבון מסחרית על פי פרוטוקול היצרן. Aliquot דגימות ל-20 מיקרוליטר אליקוטים עם 10% גליצרול כדי להפחית מחזורי הקפאה-הפשרה עתידיים, ולאחסן בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס. טען 10 מיקרוליטר של תמציות TBS, TBS-SDS ו-TBS-SDS-Urea בסמן משקל מולקולרי על 10 בארות, ארבעה עד 12 אחוז ג'ל פוליאקרילאמיד Bis-Tris עם MOPS כמאגר פועל בטכניקות סטנדרטיות.

הפעל את הג'ל ב -200 וולט למשך שעה, או עד שהצבע הכחול ממאגר הטעינה הגיע לתחתית הג'ל. הרטיבו קרום ניילון ב-100% מתנול, ולאחר מכן השרו במאגר העברה המכיל 20% מתנול. צור סימן מזהה על הכתם כדי לקבוע את צד החלבון ואת הכיוון של סמני גודל המשקל המולקולרי.

סנדוויץ' את הג'ל עם הממברנה לצד נייר פילטר רטוב. בצע את ההעברה במשך שעתיים ב 40 וולט. חסום את תמיסת ה-5% BSA ב-1X PBS-T למשך 30 דקות עם ניעור ב-70 סל"ד כדי למנוע קשירה לא ספציפית של נוגדן ראשוני לממברנה.

בדוק את כתם החלבון על ידי דגירה עם שישה מיליליטר של הנוגדן הראשוני אלפא-סינוקלאין Syn-1 מדולל 1 עד 750 ב-PBS-T בן לילה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת, שטפו את הממברנה עם 1X PBS-T שלוש פעמים למשך חמש דקות בכל פעם. לאחר מכן דגרו את הכתם עם הנוגדן המשני המצומד HRP המתאים מדולל מ-1 עד 2,000 ב-PBS-T למשך 30 דקות.

שטפו את הממברנה כמו קודם עם 1X PBS-T. טבלו את הכתמים בתמיסת כימילומינסנציה משופרת על פי הוראות היצרן בחדר חשוך. מכסים את הכתמים בניילון נצמד, ולוכדים את האות באמצעות אוטורדיוגרפיה.

לאחר ההדמיה, דגרו על הכתם המערבי עם שישה מיליליטר של מאגר הפשטת כתם מערבי למשך 10 דקות עם ניעור מתמיד כדי להסיר את אות הנוגדן אלפא-סינוקלאין. חזור על הליך הכתם המערבי כדי לבדוק את הממברנה עם נוגדן ראשוני בטא-אקטין בדילול של 1 עד 8,000. סרוק והמר את התמונה הסופית לתמונת Tiff ומדוד צפיפות באמצעות NIH ImageJ למטרות כמות.

התמונות הבאות מייצגות כתמים אימונולוגיים של רמות אלפא-סינוקלאין ממחלת פרקינסון ובקרת רקמת גרעיני הבסיס האנושית. השברים המסיסים TBS, SDS ואוריאה נותחו לנוכחות אלפא-סינוקלאין באמצעות אימונובלוט מערבי. 10 מיליגרם חלבון הועמסו לכל נתיב.

בשבר TBS, מונומרים אלפא-סינוקלאין קיימים בכל המקרים. הכוכבית מייצגת ככל הנראה צורה קטומה C של אלפא-סינוקלאין. בחלק ה-SDS, כמה אוליגומרים של אלפא-סינוקלאין נראים יחד עם מונומרים, המסומנים על ידי ראש החץ המוצק ברקמת PD.

בשבר האוריאה, מונומרים, אוליגומרים ואלפא-סינוקלאין מצטבר מתבטאים באופן משתנה במקרי מחלת פרקינסון, ומשקפים את עומס גוף לוי שלהם. דגימות הבקרה הנורמליות מבחינה נוירולוגית מראות נוכחות של כמויות קטנות בלבד של אלפא-סינוקלאין מונומרי. לאחר שליטה, טכניקת מיצוי חלבון זו יכולה להיעשות תוך יום עבודה, ולאחר מכן אימונובלוט מערבי למחרת, אם היא מבוצעת כראוי.

לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה של גוף לוי לחקור מיני אלפא-סינוקלאין בלתי מסיסים ומצטברים ברקמות אנושיות פתולוגיות ובמודלים של בעלי חיים in-vivo. אל תשכח שעבודה עם רקמה אנושית לא מקובעת דורשת אמצעי זהירות, ויש ללבוש כפפות ומעילי מעבדה לאורך כל הליכי הטיפול.