Name: הפקה רציפה של המסיס ובלתי מסיס אלפא-סינוקלאין ממוח פרקינסון (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-05T14:00:01.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: למד שיטה לבידוד אלפא-סינוקלאין מסיס ובלתי מסיס מרקמת מוח אנושית של חולי פרקינסון. הפרוטוקול משתמש באולטרה-צנטריפוגה ו-Western blot לניתוח צבירת החלבון והבנת מנגנוני המחלה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אני מודה לד"ר אדמנטיוס מאמאיס על חילוץ α-סינוקלאין מרקמה אנושית והפעלת כתמים. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענק MRC (MR/L010933/1) ובחלקה על ידי פרס Wellcome Trust/MRC Joint Call in Neurodegeneration (WT089698) לקונסורציום מחלת הפרקינסון הבריטי (UKPDC) שחבריו הם מהמכון לנוירולוגיה של UCL, אוניברסיטת שפילד ויחידת זרחון החלבון MRC באוניברסיטת דנדי. RB קיבלה מימון מקרן MJFox לעבודה זו וממומנת גם על ידי קרן Reta Lila Weston.

רקמת המוח לאחר המוות נתרמה לבנק מוח כיכר מלכה להפרעות נוירולוגיות, אוניברסיטת קולג &#39;בלונדון, המכון לנוירולוגיה תוך שימוש בפרוטוקולים ואושרו אתי מאוחסן למחקר במסגרת רישיון שהונפק על ידי רשות הרקמה האנושית (פח&quot;ע) בריטניה (לא. 12,198). ראה רשימה של מקרים המשמשים לפרוטוקול זה (טבלה 1). 1. הכנת חוצצים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חיץ 1X TBS (נאגר מלוח-טריס): <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 10X TBS כפתרון מניות עם 500 מ&quot;מ טריס-HCl pH 7.4 ו1,500 מ&quot;מ NaCl. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוקל 60.5 מתוך גרם טריס-Cl pH 7.6 ו87.6 גרם של NaCl ב800 מיליליטר של מים טוהר גבוהים. התאם את ה- pH עם 1 M HCl ולהפוך סופי מניית נפח 1 ל &#39; </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הריכוז הסופי של TBS 1X על ידי דילול המניה 10 פעמים במים מזוקקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעכבי פרוטאז להוסיף (PI), (לוח 1 לכל 50 מיליליטר חיץ) וטבליות מעכב phosphatase Phos הפסקה (1 לוח לכל 10 מיליליטר של חיץ) ללבטל את ההשפעות של פעולות אנזימטיות הלא ספציפיות של פרוטאזות וphosphatases. הערה: כאן השתמשנו אנזים מעכב טבליות מרוש אבל מעכבים זמינים מסחרי אחרים באותה מידה ניתן להשתמש על פי הוראות היצרן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חיץ TBS-SDS ידי הוספת 5% w / v נתרן סולפט dodecyl (SDS) ל1X TBS (pH 7.4) חיץ. מחממים את הפתרון עד 60 ° C עם ערבוב מתמיד באמצעות stirrer מגנטי לsolubilize SDS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חיץ TBS-SDS-אוריאה על ידי הוספת אוריאה לריכוז סופי של 8 מ &#39;w / v לחיץ 1X TBS-SDS (pH 7.4). מחממים את הפתרון עד 60 ° C עם ערבוב מתמיד על בוחש מגנטי לפזר אוריאה. </li></ol> 2. Homogenization הדוגמה ודיפרנציאל ultracentrifugation הערה: החלק מהעבודה הבא כרוך טיפול ברקמת המוח אנושי על פי הכללים של HTA בריטניה. נהלי הפעלה סטנדרטיים המקומיים אחריו בכל tiMES. דגימות מוח הם גזורים מלוקים קפואים מוח וחומר רקמה הומוגני בmicrocabinet נשמר בלחץ שלילי. כפפות חלוקים חד פעמיים, מסיכות פנים, מגינים על נעליים ומשקפי בטיחות שחוקות לאורך כל ההליך. פסולת רקמה אנושית היא מושלכת לאחר המעוקר ב 121 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות לסילוק בטוח. חדים (להבי אזמל) מתבצעים במכל חדים מתאים לבלימה וסילוק בטוח. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח נתח של רקמה אנושית קפוא (כ 0.5 גרם במשקל מאזור הגרעינים הבזליים) ומהירות ברר לרסיסים קטנים (כ 1 מ&quot;מ 2) על קרח באמצעות צלחת פטרי קטנה ולהב אזמל סטרילי. השתמש בצלחת פטרי, נפרדת ולהב סכין מנתחים עבור כל דגימה. אסוף את הרקמות טחונות בצינור 15 מיליליטר ולהוסיף 10 כרכים של חיץ 1XTBS קר כקרח לצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Homogenize הדגימות באמצעות homogenizer מכאני ב -20,000 סל&quot;ד במשך 10 שניות. מגניב על קרח למשך 2 דקות. חזור על פעולה שלוש פעמים זהים. הערה: זה נעשה כדי שהדגימות לא התחממו תוך homogenizing. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להבהיר ידי צנטריפוגה XG ב 1000 עבור 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. בטל גלולה של חומר שאינו הומוגני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח supernatant (homogenate הגולמי), להוסיף לפוליקרבונט צינורות צנטריפוגה (גודל של צינור תלוי בגודל הרוטור) ולאזן בזהירות. צנטריפוגה ב 100,000 XG במשך שעה 1 ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור supernatant כמו זה החלק TBS-המסיס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף גלולה פעמיים בחמישה כרכים של חיץ 1X TBS ו צנטריפוגות בכל פעם ב100,000 XG במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. מחק את supernatants. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה הסופי על ידי sonicating גלולה במשך 10 שניות ב 20 קילוהרץ בכ 5 כרכים של 1X TBS-SDS ב RT. הערה: לפני תוספת של דגימות מאגר המכילות SDS יש להביא ב 10 מעלות צלזיוס, כדי למנוע משקעים SDS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Ultracentrifuge ב100,000 XG למשך 30 דקות ב -25 מעלות צלזיוס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור supernatant כמו זה הדואר SDS חלק מסיס. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף גלולה פעמיים ב 5 כרכים של חיץ 1X TBS-SDS ב RT. צנטריפוגה בכל פעם ב100,000 XG במשך 15 דקות במהירות של 25 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Solubilize גלולה הסופית ב -50 μl של חיץ TBS-SDS-אוריאה 1X באמצעות sonicator נקבע על 20 קילוהרץ במשך 10 שניות להגיע לsolubilization מלא; זה נקרא החלק מסיס האוריאה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Assay כל חלק לתכולת חלבון כולל באמצעות ערכת assay החלבון מסחרית על פי הפרוטוקול של היצרן. לדלל דגימות TBS-SDS-אוריאה 1: 1 עם חיץ 1X TBS כדי לאפשר תאימות עם ריאגנטים assay החלבון. דגימות הקפאת aliquots הקטן (20 μl) ב -80 ° C כדי להפחית להקפיא להפשיר מחזורים. הערה: הוספת גליצרול 10% לדגימות מומלצת לאחסון לטווח ארוך ב -80 ° C. </li></ol> 3. immunoblotting של דוגמאות וניתוח תוצאות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות לרוץ מTBS, TBS-SDS ותמציות TBS-SDS-אוריאה על 10-גם 4-12% ג&#39;ל polyacrylamide Bis-טריסעם מגבים כחיץ פועל באמצעות טכניקות סטנדרטית. ראה גלאגר וצ&#39;אקראבאטי (2008) 29 לפרוטוקול כתם מערבי מפורט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עומס 10 מיקרוגרם של חלבון מכל מדגם על כל מסלול יחד עם סמן משקל מולקולרי לTBS וSDS ושברים אוריאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל ג&#39;ל ב 200 V עבור שעה 1 או עד הצבע הכחול ממאגר הטעינה הגיע התחתון של ג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את החלבונים מג&#39;לי electrophoretically על קרומי ניילון 28, רטוב מראש ראשון במתנול 100% ולאחר מכן למאגר המכיל מתנול העברה 20%. לספק סימן זיהוי על הכתם כדי לקבוע את צד חלבון ואת הכיוון של הסמנים מולקולרי גודל-משקל. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כריך ג&#39;ל עם הקרום לצד נייר סינון רטוב. מיקום נכון של קרום הוא קריטי עם הקרום בין הג&#39;ל והאנודה. לבצע ההעברה לשעה 2 ב 40 V. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איפור 1X PBS-tween (1X PBS-T) חיץ: ממיסים לוח 1 של PBS ב200 מיליליטרמים להניב 0.01 חיץ M פוספט, 0.0027 M אשלגן כלורי ו0.137 כלוריד M נתרן, pH 7.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסום את הקרום בפתרון 5% BSA ב1X PBS-T למשך 30 דקות עם הרעד ב 70 סל&quot;ד. זה מונע שאינו ספציפי מחייב של נוגדן ראשוני על הקרום. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחקור את כתם החלבון עם 6 מיליליטר של α-syn נוגדן ראשוני SYN-1 (Biosciences BD; נוגדנים חד שבטי עכבר) בשעת 1: 750 דילול (N O / 4 ° C) ואחריו סדרה של שוטף עם 1X PBS-T ( 3 x 5 דקות בכל פעם) 28. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הכתם עם HRP המתאים מצומדות נוגדנים משני בשעת 1: 2,000 דילול למשך 30 דקות. לבצע סדרה של שוטף (3 x 5 דקות בכל פעם) עם 1X PBS-T. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את הכתמים בפתרון chemiluminescence משופר עבור 15 שניות בחדר חשוך. כתמי כיסוי עם ניילון נצמד ומקום סרטי autoradiography נגד הכתם עם צד עד חלבון בקלטת אור-הוכחה כדי ללכוד את האותות המתאימים (להקות גודל מתאימות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפתח סרטי autoradiography במפתח אוטומטי. הערה: ניתן גם פיתחו &quot;כתמים ידני באמצעות מפתח וסדר ממקור מסחרי במקרה מכונה מפתח אוטומטי אינה זמינה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הכתם המערבי עם 6 מיליליטר של כתם מערבי הפשטת חיץ במשך 10 דקות עם קבוע רועד להתפשט הכתם של אות נוגדן α-syn. בצע את שלבים 3.43 עד 3.6.2 באמצעות נוגדן ראשוני ביתא אקטין (חד שבטי עכבר) בשעת 1: 8,000 דילול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סריקה ולהמיר את התמונה הסופית לצפיפויות תמונה ומידת Tiff באמצעות NIH ImageJ למטרות כימות (תוכנה להורדה בחינם). הערה: התוכנה מאפשרת קריאה של צפיפות של אזור היחסי של ריבית (להקות הגודל המתאימות) ויכול לבוא לידי ביטוי גם כיחס של צפיפות / β-α-אקטין syn (גן בית שמירה) כיחידות שרירותיות או על נתונים שלה כאשר גן שמירה על הבית הוא לא חוקי (כמו במקרה של דגימות אוריאה מסיסה). </li&gt; </ol>

<ol><li>Forman, M. S., Trojanowski, J. Q., Lee, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodegenerative+disease+a+decade+od+discoveries+paves+the+way+for+therapeutic+breakthroughs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Neurodegenerative disease a decade od discoveries paves the way for therapeutic breakthroughs.</a> Nat Med. 10, 1055-1063 (2004).</li>
<li>Spillantini, M. G., Schmidt, M. L., Lee, V. M., Trojanowski, J. Q., Jakes, R., Goedert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A-synuclein+in+Lewy+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A-synuclein in Lewy bodies.</a> Nature. 388, 839-840 (1997).</li>
<li>Spillantini, M. G., Crowther, R. A., Jakes, R., Hasegawa, M., Goedert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-synuclein+in+filamentous+inclusions+of+Lewy+bodies+from+Parkinson%27s+disease+and+dementia+with+Lewy+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Alpha-synuclein in filamentous inclusions of Lewy bodies from Parkinson's disease and dementia with Lewy bodies.</a> Proc Natl Acad Sci. 95, 6469-6473 (1998).</li>
<li>Baba, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggregation+of+alpha-synuclein+in+Lewy+bodies+of+sporadic+Parkinson%27s+disease+and+dementia+with+Lewy+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Aggregation of alpha-synuclein in Lewy bodies of sporadic Parkinson's disease and dementia with Lewy bodies.</a> Am J Pathol. 152, 879-884 (1998).</li>
<li>Ahmed, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neuropathology%2C+pathophysiology+and+genetics+of+multiple+system+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroptahol+Appl+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">The neuropathology, pathophysiology and genetics of multiple system atrophy.</a> Neuroptahol Appl Neurobiol. 38 (1), 4-24 (2012).</li>
<li>Ploymeropoulos, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+in+the+alpha-synuclein+gene+identified+in+families+with+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mutation in the alpha-synuclein gene identified in families with Parkinson's disease.</a> Science. 276, 2045-2047 (1997).</li>
<li>Kruger, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ala30Pro+mutation+in+the+gene+encoding+alpha-synuclein+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Ala30Pro mutation in the gene encoding alpha-synuclein in Parkinson's disease.</a> Nat Genet. 18, 106-108 (1998).</li>
<li>Zarranz, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+new+mutation%2C+E46K%2C+of+alpha-synuclein+causes+Parkinson+and+Lewy+Body+dementia%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Neurol%22%5BJournal%5D)">The new mutation, E46K, of alpha-synuclein causes Parkinson and Lewy Body dementia.</a> Ann. Neurol. 55, 164-173 (2004).</li>
<li>Proukakis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+alpha-synuclein+missense+mutation+in+Parkinson+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">A novel alpha-synuclein missense mutation in Parkinson disease.</a> Neurology. 80 (11), 1062-1064 (2013).</li>
<li>Kiely, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synucleinopathy+associated+with+G51D+SNCA+mutation%3A+a+link+between+Parkinson%27s+disease+and+Multiple+System+atrophy%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Synucleinopathy associated with G51D SNCA mutation: a link between Parkinson's disease and Multiple System atrophy?</a> Acta Neuropathol. 125 (5), 753-769 (2013).</li>
<li>Lesage, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G51D+alpha-synuclein+mutation+causes+a+novel+Parkinson-pyramidal+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">G51D alpha-synuclein mutation causes a novel Parkinson-pyramidal syndrome.</a> Ann Neurol. 73 (4), 459-471 (2013).</li>
<li>Singleton, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-synuclein+locus+triplication+causes+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Alpha-synuclein locus triplication causes Parkinson's disease.</a> Science. 302, 841(2003).</li>
<li>Chartier-Harlin, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-synuclein+locus+duplication+as+a+cause+of+familial+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Alpha-synuclein locus duplication as a cause of familial Parkinson's disease.</a> Lancet. 364, 1167-1169 (2004).</li>
<li>Cookson, M. R., Hardy, J., Lewis, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+neuropathology+of+PD%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Clin+Exp+Pathol%22%5BJournal%5D)">Genetic neuropathology of PD.</a> Int J Clin Exp Pathol. 1 (3), 217-231 (2008).</li>
<li>Fauvet, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B1-synuclein+in+central+nervous+system+and+from+erythrocytes%2C+mammalian+cells%2C+and.+Escherichia+coli+exists+predominantly+as+disordered+monomer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">α-synuclein in central nervous system and from erythrocytes, mammalian cells, and. Escherichia coli exists predominantly as disordered monomer.</a> J Biol Chem. 287, 15345-15364 (2012).</li>
<li>Bartels, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B1-synuclein+occurs+physiologically+as+a+helically+folded+tetramer+that+resists+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">α-synuclein occurs physiologically as a helically folded tetramer that resists aggregation.</a> Nature. 477, 107-110 (2011).</li>
<li>Campbell, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulation+of+insoluble+alpha-synuclein+in+dementia+with+Lewy+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+of+Dis%22%5BJournal%5D)">Accumulation of insoluble alpha-synuclein in dementia with Lewy bodies.</a> Neurobiol of Dis. 7 (3), 192-200 (2000).</li>
<li>Campbell, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+solubility+of+alpha-synuclein+in+multiple+system+atrophy+differs+from+that+of+dementia+with+Lewy+bodies+and+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">The solubility of alpha-synuclein in multiple system atrophy differs from that of dementia with Lewy bodies and Parkinson's disease.</a> J Neurochem. 76, 87-96 (2001).</li>
<li>Miller, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-synuclein+in+blood+and+brain+from+familial+Parkinson%27s+disease+with+SNCA+locus+triplication%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Alpha-synuclein in blood and brain from familial Parkinson's disease with SNCA locus triplication.</a> Neurology. 62, 1835-1838 (2004).</li>
<li>Anderson, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+Ser-129+is+the+dominant+pathological+modification+of+alpha-synuclein+in+familial+and+sporadic+Lewy+body+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of Ser-129 is the dominant pathological modification of alpha-synuclein in familial and sporadic Lewy body disease.</a> J Biol Chem. 281, 29739-29752 (2006).</li>
<li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+solubility+and+phosphorylation+of+alpha-synuclein+over+the+course+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Changes in the solubility and phosphorylation of alpha-synuclein over the course of Parkinson's disease.</a> Acta Neuropathol. 121, 695-704 (2013).</li>
<li>Mamais, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Divergent+solubility+and+aggregation+properties+in+G2019S+LRRK2+Parkinson%27s+disease+brains+with+Lewy+Body+pathology+compared+to+idiopathic+cases%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+of+Dis%22%5BJournal%5D)">Divergent solubility and aggregation properties in G2019S LRRK2 Parkinson's disease brains with Lewy Body pathology compared to idiopathic cases.</a> Neurobiol of Dis. 58, 183-190 (2013).</li>
<li>Lashley, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+clinical%2C+pathological%2C+biochemical+and+genetic+study+of+fused+in+sarcoma+proteinopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">A comparative clinical, pathological, biochemical and genetic study of fused in sarcoma proteinopathies.</a> Brain. 134 (pt9), 2548-2564 (2011).</li>
<li>Brelstaff, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transportin-1%3A+a+marker+of+FTLD-FUS%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Transportin-1: a marker of FTLD-FUS.</a> Acta Neuropathol. 122 (5), 591-600 (2011).</li>
<li>Kahle, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperphosphorylation+and+insolubility+of+alpha-synuclein+in+transgenic+mouse+oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+reports%22%5BJournal%5D)">Hyperphosphorylation and insolubility of alpha-synuclein in transgenic mouse oligodendrocytes.</a> EMBO reports. 3 (6), 583-588 (2002).</li>
<li>Nuber, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+progressive+dopaminergic+phenotype+associated+with+neurotoxic+conversion+of+%CE%B1-synuclein+in+BAC-transgenic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">A progressive dopaminergic phenotype associated with neurotoxic conversion of α-synuclein in BAC-transgenic rats.</a> Brain. 136, 412-432 (2013).</li>
<li>Tofaris, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathological+changes+in+dopaminergic+nerve+cells+odf+the+substantia+nigra+and+olfactory+bulb+in+mice+transgenic+for+truncated+human+a-synuclein+%281-120%29%3A+implications+for+Lewy+Body+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pathological changes in dopaminergic nerve cells odf the substantia nigra and olfactory bulb in mice transgenic for truncated human a-synuclein (1-120): implications for Lewy Body disorders.</a> J Neurosci. 26 (15), 3942-3950 (2006).</li>
<li>Neumann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FET+proteins+TAF15+and+EWS+are+selective+markers+that+distinguish+FTLD+with+FUS+pathology+from+amyotrophic+lateral+sclerosis+with+FUS+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">FET proteins TAF15 and EWS are selective markers that distinguish FTLD with FUS pathology from amyotrophic lateral sclerosis with FUS mutations.</a> Brain. 134 (9), 2595-2609 (2011).</li>
<li>Gallagher, S., Chakravarti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoblot+analysis+%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Immunoblot analysis .</a> J Vis. Exp. (16), e759(2008).</li>
<li>Tong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+alpha-synuclein+accumulation+in+multiple+system+atrophy%2C+Parkinson%27s+disease+and+progressive+supranuclear+palsy%3A+a+comparative+investigation%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Brain alpha-synuclein accumulation in multiple system atrophy, Parkinson's disease and progressive supranuclear palsy: a comparative investigation.</a> Brain. 133, 172-188 (2010).</li>
<li>Paleologou, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+elevated+levels+of+soluble+%CE%B1-synuclein+oligomers+in+post-mortem+brain+extracts+from+patients+with+dementia+with+Lewy+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Detection of elevated levels of soluble α-synuclein oligomers in post-mortem brain extracts from patients with dementia with Lewy bodies.</a> Brain. 132, 1093-1101 (2009).</li>
<li>Culvenor, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-A%CE%B2+component+of+Alzheimer+s+disease+Amyloid+%28NAC%29+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Non-Aβ component of Alzheimer s disease Amyloid (NAC) revisited.</a> American Journal of Pathology. 155 (4), 1173-1181 (1999).</li>
<li>Braak, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staging+of+brain+pathology+related+to+sporadic+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Staging of brain pathology related to sporadic Parkinson's disease.</a> Neurobiol Aging. 24, 197-211 (2003).</li>
<li>McKeith, I. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+and+management+of+dementia+with+Lewy+bodies%3A+third+report+of+the+DLB+consortium%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Diagnosis and management of dementia with Lewy bodies: third report of the DLB consortium.</a> Neurology. 65, 1863-1872 (2005).</li>
<li>Lee, B. R., Kamitani, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+immunodetection+of+endogenous+%CE%B1-synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Improved immunodetection of endogenous α-synuclein.</a> PLoS ONE. 6, e23939(2011).</li>
<li>Newman, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+quantitative+immunoblotting+of+endogenous+%CE%B1-synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A new method for quantitative immunoblotting of endogenous α-synuclein.</a> PLoS ONE. 8 (11), e81314(2013).</li>
</ol>

המחבר יש מה למסור.

מאמר זה מתאר פרוטוקול יוכימיים להפקה ובדיקה של מאפייני מסיסות ההפרש של monomeric, oligomeric וα-syn מצטבר ממוח החולה באמצעות תנאי ריצת ג&#39;ל denaturing. זוהי טכניקה מבוססת היטב ללמוד α-syn מצטבר 17, 18, ​​20, 21 חלבון שהוא בדרך כלל מסיס בצורה המקורית שלו, אבל לזכות בנכסי צבירת amyloidogenic או גדלו עם התקדמות מחלה או עם מוטציות גנטיות. עם זאת, חלק מהקבוצות השתמשו בשינויים קלים בריכוזי SDS במאגרים שלהם (8% או 10% במקום 5%) 21,22, 30. SDS הוא חומר ניקוי anionic וsolubilises α-syn oligomers שיכול לכלול צורות קרום מחויבת של α-syn, ואילו אוריאה, מגיב chaotropic denatures צורות מצטברות וסיביות או amyloidogenic מסיסה של α-syn 20. בהקשר זה מחקר שיטתי על ידי אל Paleologou et 31 בחן את היציבותשל oligomers-כנסת, α וסיבים עם ריכוזים שונים של אוריאה (6.5-8 M) או SDS (0.25-2%) ודיווח כי oligomers יציב בריכוזי SDS, אבל לא עם ריכוז גבוה של אוריאה. נוגדן FILA-1 שלהם, ספציפי לoligomers-כנסת, α וסיבים זוהה ריכוזים גבוהים יותר של סיבים על 6.5 M ריכוזי אוריאה בתנאי denaturing שאינם. ריכוזי חיץ שימוש בפרוטוקול זה מקרוב מראות מה שתואר באל Culvenor et. (1999) 32. האזורים במוח אנטומי להפקה ביוכימיים של α-syn מסיס יש לבחור בזהירות וזה צריך לשקף עומס LB וLN-כנסת, α בהתאם להתקדמות מחלה 33,34. מקרים המשמשים כאן הם דגימות הגרעינים הבזליים מתת neocortical והלימבית של PD משקפים שלבים מאוחרים וביניים של התקדמות PD לפי McKeith ctriteria 34. בבנק מוח כיכר המלכה, מחצית מהמוח היאקבוע באופן שיגרתי בפורמלין לניתוח histochemical ואת החצי השני הוא גזור בקפידה לאזורים אנטומיים שונים ובזק קפוא ומאוחסן במקפיאי C -80 o ללימודים / ניתוח RNA נוספים ביוכימיים ו- DNA. בעקבות קיבעון פורמלין של המוח ועל ידי נתיחת neuropathologists, אימונוהיסטוכימיה מבוצעת באמצעות נוגדן α-syn ותוצאות בארכיון. גם כנוהל שגרתי, את ה- pH של רקמת המוח נמדד בעת הגעה כמדד למצב האגונאלית של רקמת המוח. זה מהווה בסיס איתן לאיכות שימור רקמות לאנליזה ביוכימית. הנתונים שלנו כאן מראה שיש יותר SDS מונומר α-syn המסיס במקרי PD השוואה לקבוצת ביקורת; בפרט מקרי PD neocortical יש עומס α-syn גבוה יותר בהשוואה למגוון PD הלימבית. מקרי neocortical מייצגים התקדמות גדולה יותר של פתולוגיה α-syn PD באזורי neocortical כגון cor הקדמי והקודקודיתפרקטיקות 33,34. יש מקרי PD הלימבית ציונים גבוהים יותר LB באזורי המוח הקדמי / אזורים הלימבית הבסיסיים כגון האמיגדלה, transentorhinal ואזורי cingulate. לנתונים משמעותיים וניתוח סטטיסטי, אחד חייב לרוץ לפחות 4 מקרים מכל קבוצה. כמו כן יש לנו לא ניסיתי ניתוח סטטיסטי של נתוני הכתם שהוצגו כאן. זה חייב להיות גם ציין כי ייתכן שנוגדנים שונים להכיר צורות שונות / הרכב oligomers-כנסת, α סדר גבוה יותר וכל ייתכן שיש לה רגישות היחסית והעדפה. הדבר ניכר מן התוצאות של טונג et al. 29 שבו הם מראים כי 4 נוגדנים שונים α-syn (SYN-1, SS, אונקו וLB509) לתת תוצאות לשינוי לפחות לoligomers / אגרגטים α-syn. מונומרים α-syn הוכרו בהיקפים דומים על ידי כל 4 הנוגדנים אם כי אלה יכולים להיות וריאציה תלוי אם epitope נוגדן α-syn ממוקם גם בN-המסוף או C-terminal 29. באופן דומה, נוגדנים ספציפיים לphospho-אלפא סינוקלאין לקבוע משקל מולקולרי גבוה מובחן סינוקלאין α-מיני 20,21. בפרוטוקול המתואר כאן, הנוגדן המאופיין ביותר SYN-1 כבר בשימוש 19-21. עם זאת, חשוב לשקול אימות כל נוגדן חדש על כתמים מערביים באמצעות ניסויי preabsorption נוגדן וגם ביטוי יתר ומציאה של החלבון בתאים. חשוב לקחת בחשבון וריאציות אחרות שיושמו על ידי חוקרים כדי לקבוע שברים קטנים של צורות α-syn ולא יציב או tetrameric α-syn. זה יכול לכלול קל-קיבעון של קרומים עם 0.4% PFA בPBS לשמור על צורות הקטועות של α-syn 35 או טיפול במדגם homogenates עם linkers הצלב לייצב tetramers 36. הערכה ביוכימיים מדויקת של חלבונים באמצעות ti שלאחר המוותssue דורש מזעור של פירוק חלבונים האנזימטית ושינוי. לכן מומלץ להשתמש רקמות עם העיכובים שלאחר המוות הקצרים ו / או בחר דגימות מתאימות בתוך תיק הקבוצות. אימונוהיסטוכימיה באמצעות נוגדנים סטנדרטיים אימונוהיסטוכימיה α-syn צריכה להתבצע לפני תחילת פרוטוקול הבידוד. הפתולוגיה α-syn המידה משתנה מאוד ויכולה להשתנות בהתאם לאזורים הנבחרים. מומלץ לבחור אזורים עם פתולוגיה בשפע כביקורת חיובית לתשואה אופטימלית עם כל ריצה. השימוש במעכבי פרוטאז ואם מעכבי phosphatase ההכרחי כדי למנוע השפלה האנזימטית לא רצויה לאחר שחרורו של פרוטאזות או phosphatases תאיים המתרחשת במהלך תמוגה תא ושמירה על הדגימות ב 4 ° C הוא קריטי. חשוב שכל הדגימות בתוך הקבוצה של ניסויי מטופלות באופן שווה ובעקביות כדי למנוע וריאציות התוך משתמש; fre מרובהיש להימנע מחזורי Eze ההפשרה כזה פוטנציאלי עלול לחזור לאחר translational שינויים כגון זרחון. נקודה קריטית לזכור כאשר בוחנים מספר גדול של דגימות הוא שהנתונים מimmunoblots צריכים להיות מנורמלים למדגם אחד, שאמורה לפעול במקביל לכל דוגמאות האחרות בג&#39;לים, ואת כל הנתונים בהפניה למדגם ש. הדבר נעשה כדי להבטיח נורמליזציה של נתונים immunoblot בין כמה כתמים. זוהי השיטה שאומצה במחקר שנערך לאחרונה שלנו 22. יש לציין כי על מנת לשמור על ECL הרקע נמוך, לא צריכים להיות מותר הכתמים להתייבש בכל עת במהלך פרוטוקול הכתם המערבי. בנוסף, יש להימנע חשיפות ארוכות מאוד (&gt; 10 דקות) על סרטי autoradiography כמו זה יוביל לרוויה של אות ECL ויוביל לכימות מדויק. פרוטוקול לעיל זוהי טכניקה פשוטה יחסית באמצעות מעבדה משותפת ובstruments ויכול להיות כלי רב ערך לחקירת הפתופיזיולוגיה חלבון α-syn של במחקר PD. מתודולוגיה זו לא יכולה להיות מורחבת עם שינויים מתאימים לחקר הביולוגיה α-syn בבעלי חיים מהונדסים α-syn אלא גם למחלות ניווניות אחרות שמציעות פיקדונות חריגים של חלבונים מצטברים כגון הספירה, MSA, DLB, HD וfrontotemporaldementias בלבד. עם זאת נתונים הכתם המערביים תוארו כאן יכולים גם להיות מאומתים באמצעות מבחני immunosorbent צמוד אנזים באמצעות נוגדנים לצורות מסוימות של α-syn 31.

אחד המאפיינים פתולוגיים המפתח הנפוץ בקרב כמה מחלות ניווניות היא ההיווצרות של אגרגטים חלבון חריגים שמתרחשת בחלבון / מחלה אופן ספציפי 1. לפיכך, יש לוחות האופייניים extraneuronal עמילואיד-ביתא ופיקדונות טאו hyperphosphorylated מצטברים בתוך תאי עצב במחלת אלצהיימר (AD); פיקדונות α-syn מצטברים בגופיפים לואי (LBS) אשר תכלילים intraneuronal, וגם בתוך התהליכים dystrophic עצבי נקראים neurites לוי (LNs) בPD, שיטיון PD ודמנציה עם הגופיפים לואי (DLBs) 2-4. פיקדונות α-syn נורמליים נראים גם בנגעי סימן היכר של תכלילים cytoplasmic גליה בMSA 5. במחלת הנטינגטון, יש פיקדונות פולי-Q האופייניים, ולא נורמלי טאר DNA מחייב חלבון-43 והתמזגו בחלבוני סרקומה (FUS) מופקד בdementias פרונטוטמפורל. חשוב לציין לPD, מוטציות גנטיות α-syn נמצאו Cauאוטוזומלית דומיננטי se PD 6-11. בנוסף, triplication α-syn הגן 12 ושכפול 13 גם גורם PD המשפחתי ובכך מקשרים ביטוי α-syn עלה ל pathomechanisms של PD. יש לציין, מקרי פ&quot;ד שני סדירים ומשפחתיים נמל פיקדונות חריגים של פתולוגיה α-syn 14. טיפולים זמינים נוכחיים לPD הם רק פליאטיבי ואין להם השפעה על עצירה או עיכוב התקדמות מחלה בלתי נמנעת. α-syn מתבטא בשפע במוח האנושי ומהווה כ 1% מכלל החלבון במוח. הוא קיים באופן ספציפי יותר בתוך תאי העצב אבל יכול להתקיים אם כי בכמויות נמוכות יותר בתוך תאי גליה. נקודת מחלוקת היא מבנה יליד α-syn אשר יכול להתקיים כמונומר אקראי 15 או כtetramer מקופל 16. במהלך מחלה, α-syn משנה קונפורמציה שמאפשרת לה לקבל misfolded והוא חשב שתהליך זה להיות הגורם למחלה pathogeNesis. למרות כמה שנים של חקירות היבטי pathophysiological של α-syn ומחלה, הגורמים למנגנוני מחלה המדויקים נותרו חמקמקים 14. מחקרים באמצעות ניתוח שלאחר המוות של מוח פרקינסון עד כה סיפקו רמזים חשובים לגבי ביולוגיה רגילה ונורמלית של α-syn הן בPD סדיר וגם PD הקשורים מוטציות בגן LRRK2 17-22. כאן, פרוטוקול חילוץ ביוכימי (ראה תכנית מוצגת באיור 1) לפיקדונות α-syn מסיסים יותר ויותר מרקמת מוח PD שלאחר מות אדם שנמל אגרגטים α-syn בדרגות שונות תואר. טכניקה זו יכולה גם להיות מותאמת עם שינויים בהרכבים חיץ ללמוד חלבונים מצטברים ממחלות ניווניות אחרות 23,24 וגם מרקמת המוח בבעלי חיים מהונדסים 25-27. השיקול העיקרי לעיבודים הם ההבדלים בsolubility והסכומים הכולל של החלבונים המתאימים שחלקם הם בעיקר גרעיניים וייתכן שיצטרך מאגרים גבוה מלח למיצוי אופטימלי כפי שמוצג לFUS 28.

<table><tbody><tr><td>Tris-HCL</td><td>Sigma</td><td>T5912</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>VWR</td><td>27800.291</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Fluka</td><td>71727</td><td></td></tr><tr><td>אוריאה</td><td>סיגמא</td><td>U5378</td><td></td></tr><tr><td>טבליות מעכב פרוטאז&nbsp;</td><td>Roche</td><td>04 693 116001</td><td></td></tr><tr><td>טבליות מעכב פוספטאז&nbsp;</td><td>רוש&nbsp;</td><td>04 906 837001</td><td></td></tr><tr><td>טבליות מי מלח חוצץ פוספט&nbsp;</td><td>סיגמא&nbsp;</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE MOPS SDS מאגר הפעלה</td><td>Invitrogen</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>מאגר העברת NuPAGE</td><td>Invitrogen</td><td>NP0006-1</td><td></td></tr><tr><td>ממברנת Hybond-P&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN303F</td><td></td></tr><tr><td>נייר סינון Whatman 3 מ"מ</td><td>סיגמא</td><td>WHA30306185</td><td></td></tr><tr><td>ביס-טריס ג'ל 4-12%&nbsp;</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NP0322BOX Supersignal West Pico Chemiluminescent</td><td>Substrate Pierce</td><td>34080</td><td></td></tr><tr><td>Bio-RAD DC ערכת בדיקת חלבון&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0112</td><td></td></tr><tr><td>צינורות פוליקרבונט Thickwall Beckman</td><td>Beckman</td><td>355630</td><td></td></tr><tr><td>מאגר הפשטת כתמים מערביים</td><td>Thermo scientific</td><td>46430</td><td></td></tr><tr><td>Syn-1 נוגדן ראשוני (חד שבטי של עכבר)</td><td>BD Biosciences</td><td>610786</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן ראשוני בטא-אקטין (חד שבטי של עכבר&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A5441</td><td></td></tr><tr><td>HRP מצומד עז אנטי עכבר נוגדן משני</td><td>סנטה קרוז</td><td>sc-2031</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר</td><td>סיגמא</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>חברת מכשירים</td><td></td><td>רוטור / דגם no&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>אולטרה צנטריפוגה ספסלית, אופטימה מקס</td><td>בקמן</td><td>MLA-80</td><td></td></tr><tr><td>סוניקטור</td><td>מערכות חום</td><td>XL20-20</td><td></td></tr>, <tr><td>הומוגנייזר</td><td>ג'נקה וקונקל</td><td>TP18/10</td><td></td></tr></tbody></table>

הפקה רציפה של המסיס ובלתי מסיס אלפא-סינוקלאין ממוח פרקינסון

Sequential Extraction of Soluble and Insoluble Alpha-Synuclein from Parkinsonian Brains

אלפא-סינוקלאין חלבון (α-syn) בא לידי הביטוי בשפע בעיקר בתאי עצב, וקיים במספר צורות שונות - מונומרים, tetramers, oligomers וסיבים. במהלך מחלה, α-syn עובר שינויי קונפורמציה כדי ליצור oligomers ואגרגטים משקל מולקולריים גבוהים שנוטים לעשות החלבון מסיס יותר. באופן חריג α-syn מצטבר היא תכונת נוירו של מחלת פרקינסון (PD), דמנציה עם הגופיפים לואי (DLB) וניוון מרובה מערכת (MSA). אפיון וניתוח של מאגרים באמצעות-כנסת, α מסיסים עם כוח חומר ניקוי הגדלת וultracentrifugation במהירות גבוהה ביוכימיים מספק כלי רב עוצמה כדי לקבוע את הפיתוח של פתולוגיה α-syn קשור עם התקדמות מחלה. פרוטוקול זה מתאר את הבידוד של α-syn מסיס יותר ויותר / מצטבר מרקמת המוח אנושית פוסט-מורטם. מתודולוגיה זו ניתן להתאים עם שינויים ללימודים של α הנורמלי ולא נורמליהביולוגיה -syn במודלים של בעלי חיים מהונדסים מחסה מוטציות-כנסת, α שונים, כמו גם במחלות ניווניות אחרות שכוללות פיקדונות סיביים חריגים של חלבונים הקשורים למחלות שלהם.

TBS, SDS וחלבוני אוריאה מסיסה המופקים מגרעינים הבזליים הבאים הפרוטוקול מוצג באיור 1 היו לרוץ על ג&#39;לים וimmunoblotted עם חד שבטי עכבר SYN-1 α-syn נוגדן ראשוני. שברים המסיסים TBS מוצגים הנוכחות של α-syn monomeric (~ 14 מיני KDA) במקרי PD ושליטה שנבדקו (איור 2 א). שברים המסיסים SDS גם הראו α-syn monomeric בשפע בכל שלושת תת-הסוגים של המקרים שנחקרו כמוצג בכתם החשיפה הנמוך (איור 2 ג). מקרי PD הראו גם מינים גבוהים יותר משקל מולקולרי (MW)-כנסת, α כפי שנראה בכתם החשיפה הגבוה, אשר עשוי להיות oligomers (איור 2 ג). שברים מסיסים האוריאה ממקרי PD הראו כמויות גבוהות של מונומרים α-syn, oligomers ומינים מצטברים לעומת שליטת מקרים. מקרי PD אידיופטית neocortical להפגין כמויות גדולות יותר של aggreg<html> ated α-כנסת, מינים, תוך מקרים הלימבית מראים רמות ביניים של α-syn מסיס. שני השברים SDS ואוריאה ממקרי PD אידיופטית להפגין רמות משתנה של מוצרי α-syn קטועים ב 12 kDa ו -6 kDa כמתואר 20. לעומת זאת, מקרי שליטה לא הראו שום α-syn מסיס או מצטבר (איור 2E). צעדי צפיפות חצי כמותית משקפים את כמות עומס LB כcategoriesd באמצעות אימונוהיסטוכימיה α-syn מדגימה את האופי מסיס של α-syn מצטבר (איור 2, 2D, 2F) במקרי PD neocortical והלימבית. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53415/53415fig1.jpg" /> איור 1. תרשים סכמטי של הליך חילוץ -syn α מסיס.r קבל = &quot;_ blank&quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53415/53415fig2.jpg" /> איור 2. immunoblots נציג של רמות -syn α מPD ולשלוט רקמה אנושית. TBS, SDS ושברים מסיסים אוריאה מגרעיני בסיס (אזור שמטפח פתולוגיה α-syn במקרי PD) של מקרי PD אידיופטית ונורמליות נוירולוגית (שליטה) המוח נותח לנוכחות של α-syn באמצעות immunoblot המערבי. 10 מיקרוגרם של חלבון הועמסו על כל מסלול. ב TBS שברים (), בעיקר מונומרים α-syn נמצאים בכל המקרים. בSDS שברים (C), כמה oligomers של α-syn נראה יחד עם מונומרים בעיקר ברקמות PD. בשברי אוריאה (C), מונומרים, oligomers וα-syn מצטבר לידי ביטוי variably בreflectin מקרי PDז עומס LB שלהם. דגימות הבקרה נורמליות נוירולוגית להראות הנוכחות של רק כמויות קטנות של α-syn monomeric. לתשומת לבך מוצרים פגומים אפשריים של α-syn נראים בחלק מהמקרים עם עומס LB גבוה. ראש החץ המוצק מייצג את צורת monomeric של α-syn. * אולי מייצג צורת C-סופני קטועים של α-syn כפי שתואר קודם לכן 20,26. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53415/53415fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <table fo:keep-together.within-page="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> כיסוי מגן </td><td> מִין </td><td> גיל בyrs המוות </td><td> עיכוב שלאחר המוות (שעות) </td><td> pH של רקמות </td></tr><tr><td> 1 neocortical </td><td> M </td><td> 82 </td><td> 40 </td><td> 6.3 </td></tr><tr><td> 2 neocortical </td><td> F</td><td> 75 </td><td> 35.3 </td><td> 6.4 </td></tr><tr><td> 1 הלימבית </td><td> M </td><td> 81 </td><td> 28.5 </td><td> 6.2 </td></tr><tr><td> 2 הלימבית </td><td> F </td><td> 79 </td><td> 36.5 </td><td> 6.2 </td></tr><tr><td> בקרת 1 </td><td> M </td><td> 80 </td><td> 38 </td><td> 6.1 </td></tr><tr><td> בקרה 2 </td><td> F </td><td> 83 </td><td> 32.5 </td><td> 6.3 </td></tr></tbody></table> נתונים דמוגרפיים מוגבל טבלת 1. מהמקרים משמשים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד של אלפא-סינוקלאין (α-syn) שהופך ליותר ויותר בלתי מסיס/מצטבר מרקמת מוח אנושית לאחר המוות. באמצעות ניצול חוצצים עם חוזק חומר ניקוי הולך וגובר וטכניקות אולטרה-צנטריפוגה במהירות גבוהה, ניתן לבחון את המאפיינים המשתנים של צבירת α-syn ברקמות חולה ולא חולות.

Alpha-synuclein (&#945;-syn) protein is abundantly expressed mainly within neurons, and exists in a number of different forms - monomers, tetramers, ...

המטרה הכללית של מתודולוגיה זו היא להפיק alpha-synuclein מסיס ובלתי מסיס ממוחות של חולי פרקינסון לאחר המוות. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בחקר מחלת הפרקינסון. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא פשוטה יחסית ומשתמשת בריאגנטים ובמכשור מעבדה נפוצים.לאחר הכנת התמיסות והבפרים הדרושים, התחילו בהנחת דגימה של 0.5 גרם מרקמת גרעיני הבסיס (basal ganglia) קפואה על פטרי קטנה. השתמשו בלהב סקלפל סטרילי כדי לקצוץ במהירות לרסיסים של מילימטר רבוע אחד. אספו את הרקמה הקצוצה לשפופרת של 15 מיליליטר, והוסיפו לשפופרת 10 נפחים של 1X TBS קר מאוד.הומוגניזרו את הדגימות באמצעות הומוגניзатор מכני ב-20, 000 rpm למשך 10 שניות. לאחר מכן, קיררו על קרח למשך שתי דקות. חזרו על פעולת ההומוגניזציה שלוש פעמים, תוך קירור על קרח בכל פעם.סבב את ההומוגנאט בצנטריפוגה ב-10,000 gs למשך חמש דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. העבר את העילאי של ההומוגנאט הגולמי למבחנות צנטריפוגה מפוליקרבונט, וסבב ב-100,000 gs למשך שעה אחת בארבע מעלות צלזיוס. העבר את העילאי למבחנות מקוררות על קרח, ושמור זאת כfrac soluble TBS.שטפו בחמישה נפחים של תמיסת 1X TBS, וסבבו בצנטריפוגה ב-100,000 gs למשך 15 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. שאבו והשליכו את העל-מבנה (supernatant). לאחר מכן חזרו על השטיפה.שטיפה יסודית של המשקעים בין שלבי העלטרה-צנטריפוגציה היא קריטית להצלחת פרוצדורה זו. לאחר המתנה עד שהדגימות יגיעו לטמפרטורה של 10 degrees Celsius כדי למנוע שקיעה של SDS, יש להוסיף חמישה נפחים של 1X TBS-SDS ולשעבד מחדש את המשקע הסופי באמצעות סוניקציה למשך 10 שניות ב-20 kilohertz בטמפרטורת החדר. יש לבצע עלטרה-צנטריפוגציה ב-100, 000 gs למשך 30 דקות ב-25 degrees Celsius.לאחר אולטרה-צנטריפוגציה, העבירו את הנוזל העליון למבחנות מקוררות על קרח, ושמרו אותו כחלק המסיס ב-SDS. הוסיפו למשקע חמישה נפחים של בופר 1X TBS-SDS בטמפרטורת החדר, וסובבו בצנטריפוגה במהירות של 100,000 gs למשך 15 דקות בטמפרטורה של 25 degrees Celsius. השליכו את בופר השטיפה וחזרו על השטיפה.לאחר השלכת הנוזל העליון, הוסיפו 50 µL של 1X TBS-SDS-Urea ובצעו המסה באמצעות סוניקטור המכוון ל-20 kHz למשך 10 שניות. סמנו דגימה זו כשבר המומס בעוריאה. חיוני לוודא באופן יסודי שכל החלבונים הבל מסיחים הופקו במהלך ההליך.דללו את דגימות ה-TBS-SDS-Urea ביחס של אחד לאחד עם באפר 1X TBS כדי לאפשר תאימות עם ריאגנטים לבדיקת חלבון, ובדקו כל פракציה לתכולת חלבון כוללת באמצעות ערכה מסחارية לבדיקת חלבון בהתאם לפרוטוקול היצרן. חלקו את הדגימות לאליקוואוטים של 20 µL עם 10% glycerol כדי להפחית מחזורי הקפאה והפשרה עתידיים, ואחסנו בטמפרטורה של 80- °C. טענו 10 µL של תמצי ה-TBS, TBS-SDS ו-TBS-SDS-Urea ומרקר למשקל מולקולרי על ג'ל פוליאקרילאמיד Bis-Tris בריכוז 4% עד 12% עם 10 בארות, תוך שימוש ב-MOPS כבאפר הרצה ובטכניקות סטנדרטיות.הריצו את הג'ל במתח של 200 וולט למשך שעה אחת, או עד שהצבע הכחול של תמיסת הטעינה יגיע לתחתית הג'ל. הרטיבו ממבנה ניילון ב-100% methanol, ולאחר מכן השריגו אותו בתמיסת העברה המכילה 20% methanol. סמנו סימן זיהוי על הבלוט (blot) כדי לקבוע את צד החלבון ואת הכיוון של סממני המשקל המולקולרי.הניחו את הג'ל והממברנה בין דפי סינון רטובים. בצעו את ההעברה למשך שעתיים במתח של 40 volts. חסמו את הממברנה בתמיסת 5%BSA ב-1X PBS-T למשך 30 דקות עם ניעור במהירות של 70 rpm, כדי למנוע קישור לא ספציפי של הנוגדן הראשוני לממברנה.בצעו גילוי של חלבון הבלוט על ידי הדגרה עם ששה מיליליטר של הנוגדן הראשוני alpha-synuclein Syn-1 המדולל ביחס של 1:750 ב-PBS-T למשך לילה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. למחרת, שטפו את הממברנה עם 1X PBS-T שלוש פעמים למשך חמש דקות בכל פעם. לאחר מכן, הדגרו את הבלוט עם הנוגדן המשני המתאים המצומד ל-HRP המדולל ביחס של 1:2,000 ב-PBS-T למשך 30 דקות.שטפו את הממברנה כבעבר עם 1X PBS-T. טבלו את הבלוטים בתמיסת כימולומינצנציה משופרת (enhanced chemiluminescence) לפי הנחיות היצרן בחדר חשוך. כסו את הבלוטים בניילון נצמד, ותעו את האות באמצעות אוטורדיוגרפיה.לאחר ההדמיה, הדגרי את ה-western blot עם שישה מיליליטר של תמיסת stripping ל-western blot למשך 10 דקות עם ניעור קבוע, כדי להסיר מה-blot את אות הנוגדן ל-alpha-synuclein. חזרי על הליך ה-western blot כדי לבחון את הממברנה עם נוגדן ראשוני ל-beta-actin בדילול של 1 ל-8,000. סרקי והמירי את התמונה הסופית לתמונת Tiff ומדדי צמיפויות באמצעות NIH ImageJ לצורכי כימות.התמונות הבאות הן דוגמאות מייצגות של אימונובלוטים (immunoblots) של רמות אלפא-סינוקלאין (alpha-synuclein) מרקמות גרעינים בסיסיים (basal ganglia) אנושיים של חולי PD ומקבוצת ביקורת. פракציות ממיסות ב-TBS, SDS ובurea נותחו לנוכחות של אלפא-סינוקלאין באמצעות אימונובלוט מערבי (western immunoblot). לכל נתיב הועמסו 10 milligrams של חלבון.בפרקציית ה-TBS, מונומרים של alpha-synuclein נוכחים בכל המקרים. הכוכבית עשויה לייצג צורה קטועה בטרמינוס C של alpha-synuclein. בפרקציית ה-SDS, נצפים מספר אוליגומרים של alpha-synuclein לצד מונומרים, כפי שמוצג על ידי חץ מלא ברקמת ה-PD.בfraccia של urea, מונומרים, אוליגומרים ואלפא-סינוקלאין מצובב (aggregated alpha-synuclein) מופיעים בביטויים משתנים במקרי PD, מה שמשקף את עומס גופי הלווי (Lewy body load) בהתאמה. דגימות הביקורת הנוירולוגיות התקינות מראות נוכחות של כמויות קטנות בלבד של אלפא-סינוקלאין מונומרי. לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבצע את שיטת מיצוי החלבון הזו בתוך יום עבודה אחד, ולאחריה western immunoblot למחרת, במידה והיא מבוצעת כהלכה.לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום הביולוגיה של גופי לואי לחקור מיני alpha-synuclein בלתי מסיסים ומצברים ברקמות אנושיות פתולוגיות ובמודלים של בעלי חיים in-vivo. זכרו כי עבודה עם רקמה אנושית שאינה מקובעת דורשת נקיטת אמצעי זהירות, ויש להשתמש בכפפות ובחלוקי מעבדה לאורך כל הליכי הטיפול.

sequential-extraction-soluble-insoluble-alpha-synuclein-from

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

סרטון זה מדגים בדיקת אימונופלואורסצנטיות לזיהוי אגרגטים אלפא-סינוקלאין ספציפיים למחלות נוירודגנרטיביות על קטעי ביופסיה של העור. אימונוסטיין צף חופשי משמש כדי לתייג באופן פלואורסצנטי את ההידרולאז קרבוקסיל-טרמינלי ואת אגרגטי אלפא-סינוקלאין בנוירונים העוריים. תחת מיקרוסקופ קונפוקלי, תאים עם פלואורסצנטיות משני הנוגדנים מצביעים על נוכחות של אגרגטים אלפא סינוקלאין בנוירונים העוריים.

בדיקת אימונופלואורסנציה לאיתור אגרגטים אלפא-סינוקלאין בקטע ביופסיה של העור

סרטון זה מדגים את תהליך כימות הצטברות אלפא-סינוקלאין בנוירונים עובריים של עכברי דופמין שטופלו מראש בסיבי אלפא-סינוקלאין שנוצרו מראש. הוא מתאר את השלבים לתיקון, צביעה וכימות של נוירוני הדופמין המכילים אגרגטים אלפא-סינוקלאין באמצעות immunofluorescence.

חקר הצטברות אלפא-סינוקלאין בתאי עצב דופמין עובריים ראשוניים

מקור: Bétemps, D., et al.,  זיהוי α-synuclein הקשור למחלה על ידי ELISA משופר במוחם של עכברים טרנסגניים המבטאים יתר על המידה A53T אנושי מוטציה α-synuclein. J. Vis. Exp. (2015). סרטון זה מדגים את ההליך לאיתור חלבון α-synuclein הקשור למחלות נוירודגנרטיביות ברקמת המוח מעכברים טרנסגניים באמצעות ELISA. השלבים כוללים הומוגניזציה של רקמות, צנטריפוגה וזיהוי ELISA של חלבון α-synuclein כדי לכמת את צורותיו הקשורות למחלה.

איתור חלבון הקשור למחלות נוירודגנרטיביות α-Synuclein באמצעות ELISA

באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי בשילוב עם טכנולוגיית ביו-פאנינג יצרנו מערכת ביו-פאנינג שלילית וחיובית לרכישת נוגדנים כנגד וריאנטים חלבונים ספציפיים למחלה הנמצאים בכל חומר ביולוגי, אפילו בריכוזים נמוכים.  הצלחנו להשיג נוגדנים לגרסאות חלבון TDP-43 המעורבות בטרשת אמיוטרופית צידית.

רומן הכוח האטומי מיקרוסקופית מבוסס Biopanning לבידוד של חומרים כימיים מסוימים מורפולוגיה נגד גרסאות TDP-43 בטרשת לרוחב amyotrophic

מתואר ELISA המציע גישה כמותית חדשנית. הוא מגלה באופן ספציפי α-סינקליין הקשור למחלה (αSD) במודל עכבר מהונדס (M83) של סינקלינופתיה באמצעות מספר נוגדנים נגד צורת ה-αS המפוספסת ב-Ser129 או החלק ה-C-סופי של החלבון.

איתור של α-סינוקלאין קשורים למחלות על ידי ELISA משופר במוח של עכברים הטרנסגניים ביתר A53T אדם מוטצית α-סינוקלאין

המטרה של פרוטוקול זה נועד לספק מערכת מבוססת תא משכפל היווצרות של אלפא-synuclein אגרגטים ויוו. תכלילים תאיים אלפא-synuclein הם זרועה בנוירונים הראשי על-ידי הפנמת האמונה, הפצת אקסוגני מנוהל אגרגטים מקורי microsomes-הקשורים אלפא-synuclein מבודד מן העכברים הטרנסגניים חולה אלפא-synuclein.

הממשל אקסוגני של אלפא-synuclein Microsomes-הקשורים אגרגטים כדי נוירונים העיקרי כמודל תא עוצמה היווצרות הסיבים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור מערכת ביופסיה בחינם צף של העור על מקטעים לביופסיה של מעטפת המאפשרת זיהוי של מחלות היווצרות המחלה מסוים של מחלת אלפא מעורב במחלת פרקינסון מספר חלבונים של מערכת העצבים...

מיקוד אלפא Synuclein אגרגטים בתוך עורית היקפיים סיבים עצביים על ידי Free-צפה אימונוofלואונסנציה החופשית

המטרה של מאמר זה היא לתאר את השלבים הדרושים עבור הדור של סיבים אלפא-synuclein, בקרת איכות הבאים, והשימוש של סיבים מראש בvivo.

דור של אלפא-סינונוקלאומין מראש בנוי ממונמרים והשימוש ב Vivo

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט כדי ללמוד על הצטברות עצבי-מערכת בהצטברות נוירונים לעכבר הראשי דופמין. מערכת זרחזת-מצרפים לאגרגטים בנוירונים מושרה במבנה טרום-ביצוע. הדמיה אוטומטית של תאים אימונוofluor, וניתוח תמונה משוחדת להפוך את הפרוטוקול הזה חזק מתאים הקרנת תפוקה בינונית עד גבוהה של תרופות המעזות α-הצטברות.

לימוד טרום בנוי Fibril ריל המושרה α-Synuclein הצטברות בעכבר עובריים העיקרי מיילדופאמין דופמין המוח

עבודה זו מנתחת את המינון הווקטורי ואת זמן החשיפה הנדרשים כדי לגרום לדלקת עצבית, ניוון עצבי ופגיעה מוטורית במודל פרה-קליני זה של מחלת פרקינסון. וקטורים אלה המקודדים את α-סינוקלאין האנושי מועברים לתוך הסובסטנטיה ניגרה כדי לשחזר את הפתולוגיה הסינוקליינית הקשורה למחלת פרקינסון.

ניתוח מודל העכבר של מחלת הפרקינסון המושרה על ידי וקטורים ויראליים הקשורים לאדנו המקודדים α-סינוקלאין אנושי

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה למתן תוך-אפי של צברי α-סינוקלאין. שיטה זו מספקת תובנות לגבי התפשטות α-סינוקלאין מרירית חוש הריח לפקעת הריח במחלת פרקינסון.

טכניקה למתן תוך אפי של אגרגטים α-סינוקלאין

למד שיטה לבידוד אלפא-סינוקלאין מסיס ובלתי מסיס מרקמת מוח אנושית של חולי פרקינסון. הפרוטוקול משתמש באולטרה-צנטריפוגה ו-Western blot לניתוח צבירת החלבון והבנת מנגנוני המחלה.

הפקה רציפה של המסיס ובלתי מסיס אלפא-סינוקלאין ממוח פרקינסון

גלה סרטונים נוספים