Name: אקס תרבות Vivo של פרוסות המוח הקטן אפרוח וממוקד מרחבית Electroporation של מבשרי תא גרגיר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: למד שיטת אלקטרופורציה מרחבית ממוקדת לשכבת הגרגירים החיצונית במוח הקטן של אפרוח. שיטה זו מאפשרת לחקור נדידה, התמיינות והתנהגות של תאי גזע עצביים בפיתוח המוח.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

השיטה המוצגת במאמר זה נבעה מממומנת על ידי BB BBSRC / עבודת I021507 / 1 (TB, RJTW) ומלגת לימודי דוקטורט MRC (MH).

הערה: כל הניסויים בוצעו עם בהתאם לקינגס קולג &#39;לונדון, בריטניה והנחיות הטיפול בבעלי החיים של משרד הפנים הבריטיים. 1. Dissection של E14 מוח קטן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה ביצי תרנגולת המופרת חום ב 38 מעלות צלזיוס ליום עוברי 14. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המספריים ביצה באמצעות לערוף עוברים אפרוח באוב ולהסיר את הראש לצלחת פטרי המכילה קרח הקר PBS (איור 1 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים סטנדרטיים, לעשות חתכים מאחורי כל עין לאורך כל הדרך הרקמות, הסרת העיניים ולסת עליונה. לעשות חתך שני לאורך כל דרך לוע הסרת הלסת התחתונה (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים סטנדרטיים, להסיר את כל העור מפני שטח של גולגולת על ידי קילוף אותו (איור 1 ג) ולהסיר עצמות קדמיות והקודקודית, חושף מוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מהיבט הגחון, להסיר סחוס בלוע וmesenchyme עזר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מהיבט גב, זהירly להסיר גב mesenchyme לטיפול לוקח למוח האחורי שלא לפגוע פיא, ומוח הנפרד שלם (איור 1D). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות חתך לאורך כל הדרך רקמת המוח התיכון ובין המוח האחורי ומוח אחורי הנפרד כולל המוח הקטן (איור 1E). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על ידי ביצוע חתכים לאורך כל דרך הרקמה בשני צמתים לרוחב של המוח הקטן וצלחת עלאר של המוח האחורי, להסיר כל המוח הקטן, תוך הקפדה על השמירה על שלמות פיא ברחבי נתיחה (איור 1F). הסר את מקלעת דמית העין ויוצרים (איור 1G). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את המוח הקטן גזור לתוך קר כקרח HBSS. </li></ol> 2. פורסים תרבות של E14 מוח קטן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את כל המוח הקטן לפלטפורמה סטרילי של רקמות ופר בעזרת מרית או פיפטה פסטר 3 מיליליטר עם הקצה לחתוך להרחיב את הצמצם. הסר נוזל עודף באמצעות פיפטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך כל המוח הקטן כל בtהוא נדרש התמצאות בעובי 300 מיקרומטר באמצעות מסוק הרקמות משובצים מהירויות חיתוך ב 50% מהמקסימום. שלמות רקמה נשמרה בקלות בסעיף sagittal; עם זאת, נטייה היא גם שיקול חשוב לניתוח תא (תא דנדריטים פורקינג הם sagittally מיושרים, ואילו אקסונים תא גרגיר לרוץ רוחבי, ניצב למישור של הדנדריטים תא פורקינג &#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה פסטר 3 מיליליטר, לכסות את המוח הקטן הפרוס בקרח HBSS הקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הפרוסות בHBSS לצלחת פטרי 60 מ&quot;מ המכילה HBSS הטרי קר כקרח בעזרת פיפטה פסטר 3 מיליליטר עם קצה לחתוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת מיקרוסקופ לנתח מואר עם מקור אור סיבים אופטי, להבטיח הפרדת פרוסות בודדות באמצעות מלקחיים שען. לזהות פרוסות להיות electroporated, המבוסס על שלמות הרקמות שלהם ומיקום Medio-צדדי. הערה: כל נתיחה מהעובר דרך לחתוך דגירה במדיום התרבות לוקחת upo בהתאם סביב 10-20 דקותניסיון n. לבצע ניתוחים אחד בכל פעם, כדי להבטיח cerebella שמבלה זמן מינימאלי בין עריפת הראש והתרבות לשעבר vivo. </li></ol> 3. Electroporation של פרוסות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבנות תא electroporation ידי תיקון האנודה של electroporator לבסיס של צלחת פטרי 60 מ&quot;מ עם סרט בידוד. להוסיף כ 1 מיליליטר של HBSS כדי לכסות את האלקטרודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים להוסיף 0.4 מיקרומטר תרבות על גבי האלקטרודה המכוסה בHBSS. לאפשר את הכנס התרבות לנוח על האלקטרודה לוודא תמיד יש קשר בין ההוספה ואלקטרודה. הערה: בהתקנה זו, להכניס התרבות עם פרוסות ינוחו על פני השטח של הפתרון, שמירה על המעגל אבל מאפשר מיקוד המרחבי של הקתודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרוסות העברה מזוהות (עד חמש לכל הכנס תרבות) על הוספת התרבות באמצעות פיפטה פסטר 3 מיליליטר עם הקצה לחתוך. נפרד ומאפשר להתיישב על הוספת התרבות בsagittאוריינטצית אל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה, להסיר HBSS העודף, כך שפרוסות כבר לא טובלים בפתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות קצה P10 פיפטה, DNA פיפטה (בריכוז של 1 מיקרוגרם / μl) מדולל עם 20% ירוקים מהר על פני השטח של אזור מיקוד של הפרוסה. 20% ירוקים מהיר מבטיחים פתרון ה- DNA צמיג ומונעים להחריד פיזור רחב של DNA. להוסיף כ 5 DNA μl פתרון ירוק מהיר / לכל פרוסה (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הקתודה מעל רצוי רקמות ממוקדות וelectroporate עם 3 x 10 V, 10 פעימות משך msec. יש להימנע ממגע ישיר של הקתודה עם הרקמה. במקום זאת, לנצל את מתח של נוזל משטח לשמור מוליכות (מקום הקתודה הקרובה לרקמה ככל האפשר מבלי לגעת ברקמה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על משלוח DNA וelectroporation לאזורים מרובים של EGL על כל פרוסה המוח הקטן בודדת כרצויה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם השלמת electroporation, inse תרבות העברהRT 30 מ&quot;מ צלחת פטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל תרבות, להוסיף 1 מיליליטר של מדיום התרבות המחומם מראש (Basal נשר בינוני, 0.5% (w / v) D - (+) - גלוקוז, 1% תוספת B27, 2 מ&quot;מ L- גלוטמין, 100 U / פניצילין מיליליטר, 100 מיקרוגרם / סטרפטומיצין מיליליטר) מתחת להוספת התרבות כך שהוספת התרבות היא במגע עם מדיום, אבל פרוסות לא טובלת בזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תרבויות על 37 מעלות צלזיוס / 6% CO 2 עד 3 ימים. להחליף את כל מדיום התרבות כל שעות 24 עם מדיום מראש חימם טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות התרבות, לתקן פרוסות בתרבות מוסיפה לשעה 1 בparaformaldehyde 4% (או O / N ב 4 ° C) בצלחת 30 מ&quot;מ טרי ללא תקשורת ותרבות. </li></ol> 4. הדמיה של המוח הקטן Slices <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות קיבעון, לשטוף פרוסות 3 פעמים במשך 5 דקות בPBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות סכין גילוח, לנתח כל פרוסה המוח הקטן electroporated ותרבותי מלהכניס התרבות על ידי חיתוך סביב פרוסה והסרת פרוסה והאזור של הכנס הוא דבקו. לַעֲשׂוֹתלא תנסה להסיר פרוסה מהמשטח להכניס התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרוסות הר בכ 1 מיליליטר של מדיום הרכבה המכיל DAPI (אם רוצה) תחת טיפול לוקח coverslip לא להכניס בועות, ותמונה באמצעות מיקרוסקופיה confocal לייזר סריקה. הערה: יכולים להיות מגוונים פרמטרים הדמיה על פי המבנים electroporated, ולפי שיקול דעתו של המשתמש הבודד. </li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

הפרוטוקול דיווח כאן מתאר שיטה לנתח, electroporating וculturing פרוסות של המוח הקטן יום 14 עוברי מהחומוס. פרוטוקול זה מאפשר מיקוד של electroporation לאזורים קטנים מוקד של EGL, כוללים מיקוד מבודד של אונות המוח הקטן בודדות. הוא מאפשר ניתוח והדמיה גנטיים ברזולוציה גבוהה ונוחות, ובמחיר נמוך בהשוואה לטכניקות הוקמו במכרסמים 43-47. ניתוח כזה הוא אינו אפשרי כיום בvivo עקב תקופה הממושכת התפתחותית הזמן, המחסור באפשרויות מיקוד גנטי EGL ספציפי בעכבר, והאחידות של מנגנונים מו...

המוח הקטן יושב בקצה הקדמי של המוח האחורי, והוא אחראי לאינטגרציה של עיבוד חושי ומוטורי במוח הבוגר, כמו גם ויסות תהליכים קוגניטיביים גבוהים יותר 1. ביונקים וציפורים, ברשותה מורפולוגיה משוכללת וfoliated בכבדות, מוצר של הגברה מעבר הנרחבת של אבות במהלך פיתוח שמייצר יותר ממחצית תאי העצב במוח הבוגר. המוח הקטן היה נושא של לימודים לneurobiologists במשך מאות שנים ובעידן המולקולרי כמו כן זכה לתשומת לב משמעותית. זה מתייחס לא רק לביולוגיה מעניינת מיסודה, אלא גם לעובדה שהוא מעורב בכבדות במחלות של בני אדם כוללים הפרעות גנטיות התפתחותיים כגון הפרעות ספקטרום האוטיסטי 2 והבולטת ביותר בסרטן במוח הקטן, מדולובלסטומה 3, המהווה את המוח בילדים הנפוץ ביותר גידול. חשוב לציין, זה מערכת מודל מצוינת בתוך &quot;שich ללמוד הקצאת גורל וneurogenesis במהלך התפתחות מוח 4. בשנים האחרונות, יש לו גם הוקם כמערכת מודל למחקר ההשוואתי של התפתחות המוח, בשל המגוון העצום של צורות המוח הקטן ראו על פני תולדות הגזע חוליות 5-10. המוח הקטן מתפתח ממחצית הגב של 1 rhombomere במוח האחורי והתפתחותית 11 מורכב משתי אוכלוסיות עיקריות אב, שפת rhombic ואזור חדרית. שפת rhombic משתרעת סביב אזור הגב של neuroepithelium של המוח האחורי בגבול עם צלחת הגג. זה הוא מקום הולדתו של הנוירונים מעוררים glutamatergic של המוח הקטן 12-14. אזור חדרית מוליד נוירונים המעכבים GABAergic המוח הקטן, בולט ביותר נוירונים פורקינג הגדולים 14,15. בהמשך פיתוח (מיום העוברי על 13.5 בעכבר; E6 בחומוס 16), ProGen glutamatergicitors להעביר בעקיפין משפת rhombic וליצור שכבת pial של אבות: אזור אב המשני נקרא השכבה החיצונית גרגיר (EGL). זה שכבה זו שעוברת הגברה המעבר הנרחבת שמובילה למספרים של נוירונים גרגיר הענק שנמצאו במוח הבוגר. הפצת נשק בEGL נקשר ארוכה למיקום תת-pial שנובע מהגירה משיקה משפת rhombic 17, עם המעבר ליציאת מחזור התא והתמיינות עצבית של אבות להיות קשורה עם יציאתם מהשכבה החיצונית EGL למרכז EGL 18. הגירה משיקה נרחבת של תאי גרגיר לאחר mitotic בציר המדיאלי-רוחב מתרחשת באמצע וEGL הפנימי 19, לפני הגירת רדיאלי סופית לשכבה הפנימית של גרגיר קליפת המוח הקטן הבוגרת. הגירה של תאים משפת rhombic על פני השטח של המוח הקטן תלויה באיתות CXCL12 מפיא 20-22 </sup&gt; ותאי גרגיר להביע קולט CXCL12 CXCR4. ההגירה משיקה שלהם היא בכך מזכיר את זו של בעקיפין neocortical הנודד אוכלוסיות interneuron מעכבות 23-25. מסקרן, מחקרים מיקרוסקופיים אלקטרונים 17 הראו כי תאי EGL עם מורפולוגיה שגשוג לשמור על קשר pial, מקשר התנהגות תא עם יכולת שגשוג באופן המזכיר את האבות הבסיסיים של קליפת המוח היונקים 26. הדבר בא לידי ביטוי בריבוד האמור של EGL לשלוש בתת-השכבות שמוגדרים על ידי סביבה תאית שונה ובו יש לי מבשרי גרגיר ביטוי גנים שונים חתימות 18. התפשטות של אבות בoEGL מתרחשת בהתפלגות נורמלית של גדלי שיבוט כזה שכאשר אבותיהם בנפרד כותרת גנטית בסוף ההתפתחות עוברית בעכבר, הם להצמיח ממוצע חציון של 250-500 גר &#39;postmitoticנוירונים ranule 27,28. הפצת הנשק תלויה באיתות שהשש mitogenic מבסיס תאי פורקינג &#39;29-32. היכולת להגיב שלשש הוכחה להיות תלוי לחלוטין על ביטוי אוטונומי תא של גורם שעתוק Atoh1, הן במבחנה 33 וin vivo 34,35. כמו כן, יציאת מחזור התא והתמיינות הוכחה להיות תלוי בביטוי של גורם השעתוק במורד הזרם NeuroD1 36, שעשוי מדכאים ישירים של Atoh1 37. למרות התקדמות זו, וקידום רב בפענוח הבסיס הביולוגי של תא יציאת מחזור תא 38-42, המנגנון הבסיסי המולקולרי (ים) שעומד בבסיס ההחלטה ליציאה ממחזור התא ולעבור מאב לנוירון הבחנה, ו הגירה הנלווית postmitotic משיקה בEGL הפנימי, כמו גם את המתג מאוחר יותרלהגירה רדיאלי, יישאר חלקי הבין. זה הוא בגלל חוסר היכולת להשתלט הניסיונית של EGL במידה רבה: זה מאוחר פיתוח, וקשה למקד גנטי שכן רב מאותו המקור עצבי המולקולות חיוניות גם קודם לכן בחייו של מבשרי גרגיר בשפת rhombic. כדי להתגבר על בעיה זו, מחברים רבים פיתחו in vivo וelectroporation vivo לשעבר כשיטת למקד המוח הקטן שלאחר הלידה במכרסמים 43-48. הנה, אנחנו חלוצים שימוש electroporation vivo לשעבר בחומוס ללמוד EGL, המייצג את היתרונות משמעותיים במונחים של עלות ונוחות. השיטה של electroporation והתרבות הפרוסה vivo לשעבר של רקמת המוח הקטן אפרוח שלנו משתמשת ברקמה גזור מיום עוברי 14 אפרוחים בשיא התפשטות EGL. שיטה זו מאפשרת מיקוד גנטי של EGL עצמאי של שפת rhombic ויהיה להגדיר את הבמה לנתיחה גנטית של המעבר מגרגיראב לנוירון גרגיר postmitotic במוח הקטן.

<table><tbody><tr><td>קוצץ רקמות מקלווין</td><td>Mickle Laboratory Engineering Ltd</td><td></td><td>חתך ב-300 &mu; M לקבלת התוצאות הטובות ביותר.</td></tr><tr><td>נשר בינוני בסיסי (Gibco)</td> <td>Life Technologies</td><td>41010-026</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>0.4 &mu; m תרבית הכנסה</td><td>Millipore</td><td>PICM0RG50</td><td></td></tr><tr><td>TSS20 Ovodyne electroporator&nbsp;</td><td>Intracel</td><td>01-916-02</td><td>השתמש בפולסים של 3 x 10 וולט, 10 מילי-שניות לאלקטרופורציה.</td></tr></tbody></table>

אקס תרבות vivo של פרוסות המוח הקטן אפרוח וממוקד מרחבית electroporation של מבשרי תא גרגיר

Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

השכבה החיצונית של המוח הקטן גרגיר (EGL) היא האתר של ההגברה המעבר הגדולה ביותר במוח המתפתח, ומודל מצוין לחקר התפשטות והבחנה עצביות. בנוסף, שינויים אבולוציוניים של יכולת שגשוגה היו אחראים להרחבה הדרמטית של גודל המוח הקטן באמניוטים, מה שהופך את המוח הקטן מודל מצוין ללימודי Evo-Devo של מוח החוליות. תאים המרכיבים את EGL, אבות גרגיר המוח הקטן, גם מייצגים תא משמעותי ממוצא למדולובלסטומה, גידול העצבי בילדים הנפוץ ביותר. בעקבות הגברה מעבר, מבשרי גרגיר להעביר רדיאלית לשכבת גרגרים הפנימית של המוח הקטן שבו הם מייצגים את האוכלוסייה העצבית הגדולה ביותר במוח של היונקים הבוגר. בחומוס, השיא של התפשטות EGL מתרחש לקראת סוף השבוע של הריון השני. על מנת למקד את השינוי גנטי לשכבה זו בהשיא של שגשוג, שפיתחנו שיטה למניפולציה גנטית דרך electroporation vivo לשעבר של פרוסות המוח הקטן מעובר חומוס עוברי יום 14. שיטה זו משחזרת כמה היבטים חשובים של in vivo פיתוח נוירון גרגיר ויהיה שימושי ביצירת הבנה מעמיקה של התפשטות תאי גרגיר המוח הקטן ובידול, ולכן פיתוח של המוח הקטן, אבולוציה ומחלה.

סעיף זה ממחיש דוגמאות של תוצאות שניתן להשיג באמצעות electroporation פרוסה ותרבות של המוח הקטן מחומוס יום 14 עוברי. הנתיחה של המוח הקטן מודגמת באיור 1 ותא electroporation הקים מוצג באיור 2. אנחנו מראים שזה אפשרי לelectroporate והצלחת פרוסות המוח הקטן תרבות, אשר שומרות על המבנה שלהם ומורפולוגיות סלולריות במבחנה (איור 3 א). electroporation הממוקד לfolia פרט מושגת בקלות (איור 3).</stro...

השכבה החיצונית של המוח הקטנה הגרגר היא האתר של ההגברה המעבר הגדולה ביותר במוח המתפתח. כאן, אנו מציגים פרוטוקול למקד שינוי גנטי לשכבה זו בשיאו של שגשוג באמצעות vivo electroporation והתרבות של פרוסות המוח הקטן לשעבר מעובר חומוס עוברי יום 14.

אקס תרבות Vivo של פרוסות המוח הקטן אפרוח וממוקד מרחבית Electroporation של מבשרי תא גרגיר

The cerebellar external granule layer (EGL) is the site of the largest transit amplification in the developing brain, and an excellent model for studying ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לכוון מודיפיקציה גנטית לשכבה הנבטית החיצונית של המוח הקטן בעוף, כדי לצפות, לבחון ולשנות את המורפולוגיה וההתנהגות של תאי הגרנולה בהגדרת ex vivo. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הנוירוביולוגיה ההתפתחותית, כגון האופן שבו תאי מוצא עצביים נודדים, שוכפלים ומבדילים. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא טומנת בחובה יתרונות משמעותיים בעלות ובנוחות הקשורה למחקרים.למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי התפתחות גרנולות בעוף, ניתן ליישמה גם על אורגניזמי מודל אחרים, כגון זוחלים ויונקים. כדי להתחיל, הניחו ביצי תרנגולות חומות מופרות באינקובטור לביצים בטמפרטורה של 38 °C עד שיגיעו ליום עוברי 14. ביום עוברי 14, חללו פתח בביצה כדי לחשוף את העובר ובצעו כריתת ראש לעובר האפרוח in ovo.הניחו את הראש בתוך צלחת פטרי המכילה PBS קר מאוד תחת מיקרוסקופ סטריאו. השתמשו בפינצטה סטנדרטית כדי לבצע חתך מאחורי כל עין דרך כל הרקמה, והסירו את העיניים ואת הלסת העליונה. לאחר מכן, בצעו חתך שני דרך הלעי (pharynx) כדי להסיר את הלסת התחתונה.לאחר מכן, השתמשו בפינצטה סטנדרטית כדי להסיר את העור מפני השגולה על ידי קילופו. לאחר מכן, הסירו את העצמות המצחיות והפריאטליות כדי לחשוף את המוח מההיבט הוונטרלי. הסירו את הסחוס הלועי ואת המזנכימה העזרית.לאחר מכן, הניחו את המוח כאשר הצד הגבי פונה כלפי מעלה והסִירו בזהירות את המזנכימה הגבית למוח האחורי, תוך הקפדה שלא לפגוע ב-p. לאחר מכן, בצעו חתך דרך כל הרקמה בין המוח האמצעי למוח האחורי כדי לנתק את המוח האחורי, כולל הדגישון (cerebellum). בצעו חתכים דרך כל הרקמה בשני החיבורים הצדיים של הדגישון ובלוח ה-aller של המוח האחורי.הסיר את הדגיש (cerebellum) כולו, תוך הקפדה על שמירת השלמות של ה-PIA לאורך כל הניתוח. לבסוף, הסר את הפלקסוס הכורואידלי (choroid plexus) המתגבש והעבר את הדגיש המנותח ל-HBSS קר בקרח. העבר את הדגיש השלם לפלטפורמה הסטרילית של קוצץ רקמות (tissue chopper) באמצעות שפכטל או פיפטת פסטור של שלושה מיליליטר שקצה הטיפ שלה גזור.כדי להרחיב את הפתח, הסר נוזלים עודפים באמצעות פיפטה. הגדר את מהירות החיתוך של קוצץ הרקמות ל-50% מהערך המקסימלי שלה. לאחר מכן, חתוך את המוח הקטן (cerebellum) בכיוון הנדרש בעובי של 300 micrometers באמצעות פיפטת פסטור של שלושה מיליליטר.כסו את פרוסות המוזח (cerebellum) ב-HBSS קר. לאחר מכן, העבירו את ה-HBSS ואת הפרוסות לצלוחית פטריתת 60 מילימטר המכילה 20 מיליליטר של HBSS קר מאוד באמצעות פיפטת פסטור של שלושה ליטר עם קצה חתוך, והניחו את צלוחית הפטריה תחת מיקרוסקופ דיסקציה המואר במקור אור סיב אופטי. לאחר מכן, השתמשו בפינצטת שעונים כדי להפריד פרוסות בודדות של רקמת מוח וזהו את הפרוסות שיועברו אלקטורפורציה על סמך שלמות הרקמה ומיקומן מדיאל-לטרלי.בנו תא אלקטרופורציה על ידי קיבוע האנודה של אלקטרודה לבסיסו של Petri dish בעל גודל 60 מילימטר. באמצעות סרט בידוד, הוסיפו כ-1 מיליליטר של HBSS כדי לכסות את האלקטרודה. לאחר מכן, הניחו מסנן תרבית של 0.4 מיקרומטר.הכנסו מעל האלקטרודה המכוסה ב-HBSS. השתמשו בפיפטת פסטור בנפח של שלושה מיליליטר עם קצה חתוך כדי להעביר את הפרוסות שזוהו, עד חמש פרוסות לכל תבנית, אל תבנית התרבית. לאחר מכן, הפרידו את הפרוסות והמתינו להן עד שיישבו על התרבית.הכנס בכיוון סגיטלי. בעזרת פפט, הסר עודפי מדיום מפרוסות המוח. אפשר למסנן לנוח על האלקטרודה כך שיהיה מגע בין המסנן לאלקטרודה.בהגדרת מערך זו, המאחס לתרבית (culture insert) עם הפרוסות ינוח על פני המצע, ובכך ישמר את המעגל החשמלי, אך יאפשר מיקוד מרחבי של הקתודה. בעזרת טיפ של פיפט P 10, טפטפו 5 µL של DNA מהול ב-20% fast green על פני אזור מטרה בכל פרוסה.הוספת fast green מבטיחה שתמיסת ה-DNA תהיה צמיגה מספיק כדי למנוע התפשטות רחבה של ה-DNA. לאחר מכן, מקמו את הקתודה של רקמת המטרה הרצויה ובצעו אלקטרוליזה לדגימות. הימנעו ממגע ישיר של הקתודה עם הרקמה על ידי מיקום הקתודה קרוב ככל האפשר לרקמה, ללא מגע בפועל.חזור על האלקטרופורציה באזורים מרובים של השכבה הגרנולרית החיצונית בכל פרוסה בודדת של הדماغ הקטן, לפי הצורך. בסיום, העבר את תבנית השתיל לכלי פטרי בקוטר 30 מילימטר. לכל תרבית, הוסף מיליליטר אחד של מצע גידול שחומם מראש מתחת לתבנית השתיל.וודאו שההכנסה (insert) אינה צפה על המצע. על ההכנסה להיות במגע עם המצע, אך הפרוסות לא צריכות להיות טבולות בו. דגרו את התרביות למשך עד שלושה ימים, תוך החלפה של כל המצע בתרבית.החליפו את המצע בכל 24 שעות במצע טרי ומחומם מראש לאחר התרבית. העבירו את הפרוסות מהמכניסים של התרבית לצלוחית של 30 מילימטר המכילה 4% para formaldehyde למשך שעה אחת. ודאו שאתם מוסיפים את ה-para formaldehyde מעל התרבית.החדירו לאחר הקיבוע. שטפו את הפרוסות שלוש פעמים ב-PBS למשך חמש דקות בכל פעם. לאחר מכן, השתמשו במספרי עיניים כדי להוציא כל אחת מהפרוסות של ה-cerebellum שעברו electroporation ותרבית מהתרבית.החדירו על ידי חיתוך מסביב לכל פרוסה והוצאתה יחד עם אזור ההחדרה המחובר אליה. אין לנסות להסיר את הפרוסה ממשטח ההחדרה. הצמידו את הפרוסות בכ-1 ml של תמיסת קיבוע נבחרת תחת זכוכית כיסוי, תוך הקפדה על מניעת היווצרות בועות.לאחר שהשקופיות יבשו, אספו אותן וצלמו אותן באמצעות סריקה בלייזר. מיקרוסקופיה קונפוקלית של calbindin. צביעה של רקמת מוחיך בגיל E 14 מוצגת כאן בצבע אדום לאחר אלקטרופורציה עם פלסמיד GFP של בקרה ביום הראשון, השני והשלישי in vitro.צביעת ה-calbindin העקבית מראה כי שלמות הרקמה נשמרת בתרבית למשך שלושה ימים לפחות in vitro. להלן תמונות בהגדלה נמוכה של פלסמידים המקודדים ל-RFP ו-GFP שהוכנסו בהצלחה באמצעות אלקטרופורציה לשכבת הגרנולות החיצונית במיקומים שונים. הפלסמיד של ה-GFP כוון ל-fum בודד, כפי שמסומן על ידי הכוכבית.כאן מוצגת דוגמה שבה קונסטרוקט המקודד ל-GFP, המונחה על ידי enhancer 8 0 1, הוכנס באמצעות אלקטרופורציה לשכבה הגרנולרית החיצונית (external granule layer). הביטוי של 8 0 1 מגדיר תאי קדם של תאי גרנולה בתוך השכבה הגרנולרית החיצונית. מורפולוגיות תאיות שונות נראות בבירור לאחר שלושה ימים in vitro, וניתןה לעקוב אחר התנהגות התאים.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה של האופן שבו ניתן לבודד פרוסות בודדות של הדגיך (cerebellum) באמצעות מגוון כלים גנטיים, במטרה לצפות בפיתוח תאי הגרנול (granule cells) ולבצע בו מניפולציות. לאחר פרוצדורה זו, ניתן לבצע שיטות נוספות, כגון אימונוהיסטוכימיה, כדי להשיב על שאלות נוספות בנוגע לשלמות המבנית של הרקמה ולמיקומים היחסיים של סוגי תאים שונים, כגון תאי פורינקין (Purkinje cells) או גליאל ברגמן (Bergmann glia). לאחר השליטה בטכניקה זו, ניתן לבצעה בערך בשעתיים עבור תריסרי עוברי תרנגול, אם היא מבוצעת כהלכה.

ex-vivo-culture-chick-cerebellar-slices-spatially-targeted

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

כאן אנו מציגים שיטה לבודד cerebellar תרבות גרגר עצב ובתאים ונוירונים גרגיר cerebellar מהעכבר לאחר הלידה.

בידוד תרבות שלאחר הלידה cerebellar עכבר גרגיר Neuron ובתאים ונוירונים

בסרטון זה אנו מבצעים אלקטרופורציה של פרוסות המוח הקטן של עובר אפרוח עם פלסמידים של גן כתב. הטכניקה מאפשרת הדמיה של התפתחות והגירה של מבשרי תאי גרגיר ליצירת שכבה גרעינית.

Ex vivo electroporation of Chick Embryo Cerebellar Slices: שיטה להחדרת DNA פלסמיד המקודד חלבון פלואורסצנטי ירוק כדי לדמיין התפתחות תאים גרגיריים

הסרטון מדגים הכנת פרוסות במוח הקטן. זה מראה הליך מפורט לבידוד המוח הקטן מעובר אפרוח. לאחר מכן מכינים את הפרוסות מהמוח הקטן המנותח באמצעות מסוק רקמות לניתוח ניסיוני נוסף.

השגת פרוסות המוח הקטן ממוח אפרוח עוברי

מקור: ChanU., et al., שימוש באלקטרופורציה שלאחר הלידה in vivo כדי לחקור את המורפולוגיה של נוירוני גרגיר המוח הקטן והתפתחות סינפסות. J. Vis. Exp. (2021).סרטון זה מדגים את הניתוח של התפתחות נוירונים של גרגירי המוח הקטן על ידי הדמיית פרוסות רקמת מוח קבועות מראש מעכברים המסומנים בחלבון פלואורסצנטי, לכידת תמונות z-stack ברזולוציה גבוהה עם מיקרוסקופ קונפוקלי, ומדידת פרמטרים מבניים כולל אורך נויריט, היווצרות טפרים דנדריטיים, שטח פנים ונפח לחקר סינפטוגנזה.

הדמיית הסינפטוגנזה של נוירונים גרגירי המוח הקטן בשלבי התפתחות שונים

מקור: Bénard, M., et al. ex vivo הדמיה של נדידת תאי גרגיר מוח לאחר לידה באמצעות מקרוסקופיה קונפוקלית. J. Vis. Exp. (2015)סרטון זה מדגים שיטה מקרוסקופית קונפוקלית למעקב אחר נדידת ex vivo של תאי גרגיר בפרוסות מוח קטן ממוחות של חולדות לאחר לידה.

הדמיה Ex Vivo של נדידת תאי גרגיר המוח הקטן לאחר הלידה באמצעות מקרוסקופיה קונפוקלית

המורפוגנזה ונדידת נוירונים הן אירועים מכריעים שבבסיס התפתחות מוח תקין. כאן אנו מתארים שיטות לתמרן גנטי נוירונים בתרבית המוח הקטן גרגיר והמוח קטן מתפתח להערכה של מורפולוגיה ומאפייני נדידה של תאי עצב.

מניפולציה גנטית של Cerebellar גרגיר נוירונים<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; בVivo</em&gt; ללמוד עצבי מורפולוגיה וגירה

במהלך התפתחות המוח הקטן לאחר הלידה, תאי גרגיר לא בשלים שמקורם באזור הנבט מציגים אופני נדידה מובהקים כדי להגיע ליעדם הסופי ולהקים רשתות עצביות. פרוטוקול זה מתאר את הכנת פרוסות המוח הקטן ואת הגישה המקרוסקופית הקונפוקלית המשמשת לחקירת הגורמים המווסתים את נדידת העצבים.

Ex Vivo הדמיה של נדידת תאי המוח הקטן אחרי הלידה גרגיר שימוש Confocal Macroscopy

פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה עבור בידוד ואת culturing נוירונים גרגר מוחי העכבר הראשי (CGNs) מן הגורים בת 6-7 יום, התמרה חושית יעילה של CGNs להפסד ורווח של תפקוד לימודי, דגמי NMDA-induced excitotoxicity עצביים, מוות של תאים נמוך-אשלגן-induced נזק לדנ א, לחץ חימצוני באמצעות המודל באותה תרבות.

מידול מוות עצביים והתנוונות בנוירונים גרגר אסטרוציטומה העיקרי העכבר

מחקרים אובדן-של-הפונקציה המקובלת של גנים באמצעות ההסתרה חיות לעתים קרובות היו יקרים ולגזול. מבוסס-אלקטרופורציה בתיווך CRISPR סומאטית מוטגנזה מכוונת הוא כלי רב עוצמה כדי להבין ג'ין פונקציות בתוך vivo. כאן, אנחנו מדווחים על שיטה לנתח נוקאאוט פנוטיפים מתרבים תאים של הצרבלום.

בתיווך CRISPR אובדן ניתוח פונקציה גרגר אסטרוציטומה תאים באמצעות בתוך הרחם מבוסס-אלקטרופורציה את ההעברה של ג'ין

כאן אנו מתארים שיטה לדמיין סינפטוגנזה של נוירונים גרגיריים במוח הקטן של העכבר במהלך הזמן של התפתחות המוח לאחר הלידה, כאשר תאים אלה משכללים את המבנים הסינפטיים שלהם ויוצרים סינפסות כדי לשלב את עצמם במעגל המוח הכולל.

שימוש באלקטרופורציה לאחר הלידה של In Vivo לחקר מורפולוגיה של נוירון גרגיר המוח הקטן והתפתחות סינפסה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול אלקטרופורציה במבחנה לשחזור עבור מניפולציה גנטית של מבשרי תאי גרגר המוח הקטן העיקרי (GCPs) כי הוא חסכוני, יעיל, קיימא. יתר על כן, פרוטוקול זה מדגים גם שיטה פשוטה למחקר מולקולרי של מסלולי איתות קיפוד תלויי ציליום ראשוניים בתאי GCP ראשוניים.

שיטת אלקטרופורמציה יעילה וחסכונית לחקר מסלולי איתות ראשוניים תלויי סיליום במבשר תאי הגרגיר

למד שיטת אלקטרופורציה מרחבית ממוקדת לשכבת הגרגירים החיצונית במוח הקטן של אפרוח. שיטה זו מאפשרת לחקור נדידה, התמיינות והתנהגות של תאי גזע עצביים בפיתוח המוח.

אקס תרבות Vivo של פרוסות המוח הקטן אפרוח וממוקד מרחבית Electroporation של מבשרי תא גרגיר

גלה סרטונים נוספים