אפיון חילוף חומרים של מקוטב M1 והמקרופאגים נגזר מח עצם M2 באמצעות ניתוח תאי שטף בזמן אמת

המטרה הכללית של אנליזת שטף חוץ-תאי זו היא להעריך את המאפיינים המטבוליים של מקרופאגים ממח עצם נאיביים, וכן כאלה שהופנו לסוגי M1 ו-M2. שיטה זו יכולה לשמש כמסגרת לחקירת האופן שבו ציטוקינים, תרכובות או גנוטיפים ספציפיים משפיעים על הפנוטיפ המטבולי של מקרופאגים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא דורשת כמות קטנה בלבד של מקרופאגים.

יתרה מכך, היא מודדת את כל פרמטרי הגליקוליזה והמיטוכונדריה הרלוונטיים בבדיקה אחת בודדת. למרות ששיטה זו מספקת תובנה לגבי הפנוטיפ המטבולי של מקרופאגים המופקים ממח עצם, ניתן להחיל אותה גם על כל סוגי המקרופאגים או תאי מערכת החיסון. עלה בדעתנו לפרסם שיטה זו ב-J מכיוון שאנו מקבלים לעיתים קרובות בקשות ממדענים אחרים לסייע להם בבדיקות של שטף תאי מטבולי. ביום השמיני של התרבית, ודאו את נוכחותם של מקרופאגים בוגרים באמצעות בדיקה ויזואלית, והדגירו את המקרופאגים הבוגרים המופקים ממח עצם ב-10 milliliters של citrate saline למשך חמש דקות.

העבירו ל-37 °C כאשר התאים ניתקו. שטפו את התרבית עם 10 mL של PBS וספרו את מספר התאים החיוניים. לאחר מכן, זרעו 5×10⁴ תאים לבאר.

במיקרופלטה לתרבית תאים מסוג XFE 96, יש להוסיף 100 µL של מצע גידול לכל באר, תוך החזקת הפ pipette בזווית במחצית גובה הדופן של כל באר. לצורך חלוקת התאים, יש להוסיף מצע בלבד לבארי תיקון הרקע A1, A12, H1 ו-H12. לאחר מכן, יש לאפשר לתאים לשקוע בטמפרטורת החדר תחת מנדף לתרבית תאים למשך שעה אחת.

לאחר אישור התרבית ההצמדה, יש להכניס את התאים למדגרה בטמפרטורה של 37 degree Celsius ו-5%carbon dioxide. שלוש שעות לאחר הזריעה, יש להמריץ בין ארבע לשש בארות של תאים לכל תנאי, בהתאם לצורך, למשך 24 שעות. כדי להקטב את המקרופאגים המופקים ממח העצם ביום שלפני בדיקת ה-extracellular flux, יש להניח את מחסנית החיישן (sensor cartridge) הפוכה לצד לוח העזר ומלאו כל באר ב-200 microliters של תמיסת crin.

בשלב הבא, הורד את מחסנית החיישן אל לוח העזר כדי להטביע את החיישנים בתמיסת Cain, וודא שגובה תמיסת Cain גבוה מספיק כדי להשאיר את החיישן טבול. לאחר מכן, הנח את המחסנית באינקובטור של 37 degrees Celsius ללא פחמן דו-חמצני למשך הלילה. למחרת, הסר בעדינות את הנוזל העליון מהמקרופאגים המקוטבים ושטוף את התאים עם 100 µL של תמיסת בדיקה שהוכנה טרייה.

מדיום לכל באר. הוסף 180 µL של מדיום בדיקה לכל באר, והשתמש במיקרוסקופ כדי לוודא שהתאים לא נשטפו. אם התאים עדיין צמודים, הנח את הפלטה באינקובטור ללא CO2 בטמפרטורה של 37 °C למשך שעה לפני הרצת הבדיקה בזמן שהתאים דגרו.

הכינו 10 תערובות של תרכובות להזרקה כפי שצוין בטבלה וחממו את התערובות ל-37 °C. לאחר מכן, טענו את מחסנית החיישן עם הנפחים המתאימים של התרכובת ובפורטים A, B, C ו-D באמצעות מדריכי הטעינה המסופקים, כדי לאפיין את הביו-אנרגיה של המקרופאגים המפולרים באמצעות בדיקת שטף חוץ-תאי (extracellular flux assay). השתמשו באשף הבדיקה (assay wizard) כדי ליצור תבנית בדיקה עם זמני ערבוב של שתי דקות וזמני מדידה של שלוש דקות, ולפחות שלושה מחזורי ערבוב ומדידת קצב לפני כל אחת מארבע ההזרקות ואחרי ההזרקה האחרונה.

לאחר מכן, התחילו את הבדיקה ופעלו לפי ההוראות המופיעות במכשיר. טענו את פלטת המחסנית עם הגששים ההידרטליים כדי לאפשר כיול של המכשיר ושל פלטת התאים. כאשר תתבקשו לכך, בסיום הבדיקה, רוקנו בזהירות את כל תוצר הבדיקה ואחסנו את מיקרופלטת תרבית התאים המנותחת בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס עד לשלב הנורמליזציה.

כדי לנרמל את התאים באמצעות ערכת הבדיקה לסמיכות תאים, הפשיר את הפלטה והדגר את התאים ב-200 µL של תמיס לייזיס של תאים (cell lysis buffer) שהוכן טרי לכל באר למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לבסוף, מדוד את הפלואורסצנציה עם מקסימום עירור של כ-480 nm ומקסימום פליטה של כ-520 nm. השתמש במדידות הפלואורסצנציה שהתקבלו כדי לחשב את היחס, כאשר ממוצע מספר התאים בכל בארי המקרופאגים הנאיביים מוגדר כ-1, ולאחר מכן ייצא את היחסים הללו לתוכנת הניתוח seahorse wave.

כדי לנרמל את הנתונים, בדיקת שטף חוץ-תאי תניב בדרך כלל גרפים של קצב חמצצת חוץ-תאי (ECAR) וקצב צריכת חמצן (OCR), כפי שמוצג בדמות מייצגת זו; לאחר הזרקת גלוקוז, העלייה הנצפית ב-ECAR מייצגת את קצב הגליקוליזה. העלייה הנוספת הנצפית ב-ECAR לאחר עיכוב של סינתזת ATP באמצעות oligomycin מספקת מידע נוסף על הרזרבה והקיבולת הגליקולית. בניתוח ערכי ה-OCR, הזרקת CIN מקלה על חישוב צריכת החמצן המשמשת לסינתזת ATP מיטוכונדריאלית, ו-FCCP מנתק את הנשמה המיטוכונדריאלית.

מדידות ה-OCR התואמות מספקות נתונים על קיבולת הנשימה המקסימלית והרזרבית; עם זאת, הזרקה של rotenone ו-antimycin a חוסמת את קומפלקסים 1 ו-3 של המיטוכונדריה, כאשר ה-OCR הנותר מייצג את צריכת החמצן שאינה מיטוכונדריאלית. הפעלת מקרופאגים באמצעות LPS משרה עלייה במטבוליזם הגליקוליטי. ההבדלים בין מקרופאגים שטופלו ב-LPS לבין כאלו שטופלו ב-IL-4 הופכים בולטים אף יותר כאשר בוחנים את קצבי צריכת החמצן.

אכן, בעוד שהמטבוליזם החמצוני המקסימלי מדכא מאוד במקרופאגים שטופלו ב-LPS, IL-4 משרה נשימה חזקה במקרופאגי M2. לאחר ששולטה בשיטה, ניתן להשלים את בדיקת ה-extracellular flux תוך שעתיים אם היא מבוצעת כראוי. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להזריק pyruvate יחד עם FCCP כדי להזין את הנשימה המקסימלית בעת ביטול הצימוד (uncoupling).

לאחר טכניקה זו, ניתן לבצע בדיקות נוספות כגון ELISA כדי להעריך קיטוב יעיל של מקרופאגים. טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים מתחום האימונולוגיה לחקור את המאפיינים המטבוליים של מגוון רחב של תאי חיסון. לאחר צפייה בסרטון זה, צריכה להיות לכם הבנה טובה לגבי אופן ביצוע ניתוח זרימה חוץ-תאית (extracellular flux analysis) להערכת הפנוטיפ המטבולי של מקרופאגים.