אפיון חילוף חומרים של מקוטב M1 והמקרופאגים נגזר מח עצם M2 באמצעות ניתוח תאי שטף בזמן אמת
28 בנובמבר 2015
תכנות מחדש מטבולי הוא מאפיין ותנאי מוקדם לקיטוב מקרופאגים M1 ו-M2. כתב יד זה מתאר מבחן למדידת פרמטרים בסיסיים של גליקוליזה ותפקוד מיטוכונדריאלי במקרופאגים שמקורם במח עצם של עכבר. ניתן ליישם כלי זה כדי לחקור כיצד גורמים מסוימים משפיעים על חילוף החומרים והפנוטיפ של המקרופאגים.
המטרה הכוללת של ניתוח שטף חוץ-תאי זה היא להעריך את המאפיינים המטבוליים של M1 ו-M נאיביים, שני מקרופאגים מקוטבים שמקורם במח עצם. שיטה זו יכולה לשמש מסגרת לחקירת האופן שבו ציטוקינים, תרכובות או קודי גנו, מסוימים משפיעים על הפנוטיפ המטבולי של מקרופאגים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא דורשת רק כמות קטנה של מקרופאגים.
יתר על כן, הוא מודד את כל הפרמטרים הרלוונטיים של גליקוליזה ומיטוכונדריה בבדיקה אחת. למרות ששיטה זו מספקת תובנה לגבי הפנוטיפ המטבולי של מקרופאגים שמקורם במח עצם, ניתן ליישם אותה גם על כל סוגי המקרופאגים או תאי החיסון. היה לנו רעיון לפרסם את השיטה הזו ב-J מכיוון שאנו מקבלים לעתים קרובות בקשות ממדענים אחרים לסייע להם בבדיקות השטף התאי של הגישה המטבולית שלהם ביום השמיני של התרבית, לוודא את נוכחותם של מקרופאגים בוגרים על ידי בדיקה ויזואלית ולדגור את המקרופאגים הבוגרים שמקורם במח עצם ב-10 מיליליטר של מי מלח ציטראט למשך חמש דקות.
37 מעלות צלזיוס כאשר התאים מתנתקים. שוטפים את התרבות עם 10 מיליליטר PBS וסופרים את מספר התאים הקיימאים. לאחר מכן זרע חמש פעמים 10 עד התאים הרביעיים לבאר.
בתרבית תאים XFE 96, מיקרו-צלחת ב-100 מיקרוליטר של מדיום תרבית לבאר, מחזיקה את הפיפטה בזווית בערך באמצע הצד של כל באר. כדי להוציא את התאים, הוסף מדיום בלבד לבארות תיקון הרקע A אחת, A 12, H אחת ו-H 12. לאחר מכן אפשר לתאים להתיישב בטמפרטורת החדר במכסה המנוע של תרבית תאים למשך שעה.
לאחר אישור תרבית הדבקות, התאים בחממת פחמן דו חמצני של 37 מעלות צלזיוס 5%. שלוש שעות לאחר הציפוי, יש לעורר בין ארבע לשש בארות של תאים לכל מצב בהתאם ל-24 שעות. כדי לקטב את המקרופאגים שמקורם במח העצם ביום שלפני בדיקת השטף החוץ-תאי, הנח את מחסנית החיישן הפוכה ליד לוחית השירות ומלא כל צלחת היטב ב-200 מיקרוליטר תמיסת crin.
לאחר מכן, הורד את מחסנית החיישן על לוחית השירות כדי להטביע את החיישנים בתמיסת קין וודא שרמת תמיסת קין גבוהה מספיק כדי לשמור על החיישן שקוע. לאחר מכן הנח את המחסנית בחממה שאינה פחמן דו חמצני 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת, הסר בעדינות את הסופרנטנט מהמקרופאגים המקוטבים ושטוף את התאים עם 100 מיקרוליטר של בדיקה טרייה.
בינוני לבאר. הוסף 180 מיקרוליטר של מדיום בדיקה לכל באר, והשתמש במיקרוסקופ כדי לוודא שהתאים לא נשטפו. אם התאים עדיין מחוברים, הנח את הצלחת באינקובטור שאינו פחמן דו חמצני של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת לפני ריצת הבדיקה בזמן שהתאים דגירה.
הכינו 10 x תערובות תרכובות הזרקה כמפורט בטבלה וחממו את התערובות ל-37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן טען את מחסנית החיישן בנפחים המתאימים של תרכובת ויציאות A, B, C ו-D באמצעות מדריכי הטעינה המסופקים כדי לאפיין את הביו-אנרגיה של המקרופאגים המקוטבים על ידי בדיקת שטף חוץ-תאי. השתמש באשף הבדיקה כדי ליצור תבנית בדיקה עם זמני ערבוב של שתי דקות ושלוש דקות, ולפחות שלוש לולאות מדידה של ערבוב וקצב לפני כל אחת מארבע ההזרקות ואחרי ההזרקה האחרונה.
לאחר מכן התחל את הבדיקה ופעל לפי ההוראות כפי שמצוין על ידי המכשיר. טעינת לוחית המחסנית עם הבדיקות המיובשות כדי לאפשר כיול על ידי המכשיר ולוחית התא. בהוראה, בתום הבדיקה, השליכו בזהירות את כל מדיום הבדיקה ואחסנו את המיקרו-צלחת של תרבית התאים המנותחת במינוס 20 מעלות צלזיוס עד לנורמליזציה.
כדי לנרמל את התאים באמצעות ערכת בדיקת התפשטות התאים, יש להפשיר את הצלחת ולדגור את התאים ב-200 מיקרוליטר של מאגר ליזה תאים טרי שהוכן לבאר למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לבסוף, מדוד את הקרינה עם עירור של כ-480 ננומטר ופליטה מקסימלית של כ-520 ננומטר. שימוש במדידות הקרינה הנרכשות כדי לחשב את היחס שבו ספירת התאים הממוצעת של כל בארות המקרופאגים הנאיביות מוגדרת כאחת, ואז לייצא את היחסים הללו לתוכנת ניתוח גלי סוסון הים.
כדי לנרמל את הנתונים, בדיקת שטף חוץ-תאי תניב בדרך כלל קצב החמצה חוץ-תאית או ECAR וקצב צריכת חמצן, או עלילות OCR כפי שמודגם באיור מייצג זה לאחר הזרקת הגלוקוז, העלייה הנצפית ב-ECAR מייצגת את קצב הגליקוליזה. העלייה הנוספת שנצפתה ב-ECAR לאחר עיכוב TP סינתאז עם כל הליגה מיצין מספקת מידע נוסף על הרזרבה והקיבולת הגליקוליטית. בעת ניתוח ערכי ה-OCR, הזרקת CIN מקלה על חישוב צריכת החמצן המשמשת לסינתזה מיטוכונדריאלית A TP, FCCP מבטל את הנשימה המיטוכונדריאלית.
מדידות ה-OCR המתאימות מניבות נתונים על ריקבון קיבולת הנשימה המקסימלית והעודפת הידועה והזרקת אנטימיצין, עם זאת, חוסמים קומפלקסים מיטוכונדריאלים 1 ו-3 כאשר ה-OCR השיורי מייצג את צריכת החמצן הלא מיטוכונדריאלית. הפעלת מקרופאגים עם LPS גורמת לחילוף חומרים גליקוליטי מוגבר. עם ההבדלים בין LPS ל-IL, ארבעה מקרופאגים מטופלים הופכים ברורים עוד יותר כאשר נצפים שיעורי צריכת החמצן.
ואכן, בעוד שהמטבוליזם החמצוני המקסימלי מדוכא מאוד במקרופאגים שטופלו ב-LPS, IL 4 גורם לנשימה חזקה ב-M שני מקרופאגים. לאחר השליטה, ניתן להשלים את בדיקת השפעת החוץ-תאית תוך שעתיים אם היא מבוצעת כראוי. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להזריק וטרינר יחד עם FCCP כדי לתדלק נשימה מקסימלית עם ניתוק.
לאחר טכניקה זו, ניתן לבצע בדיקות נוספות כמו אלייזה כדי להעריך קיטוב מקרופאגים יעיל. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים מתחום האימונולוגיה לחקור את המאפיינים המטבוליים של מגוון רחב של תאי חיסון. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע ניתוח שטף חוץ-תאי כדי להעריך את הפנוטיפ המטבולי של מקרופאגים.
סקירה כללית
מחקר זה מציג שיטה להערכת המאפיינים המטבוליים של מקרופאגים המופקים ממחולל גרמיים (bone marrow) המקוטבים ל-M1 ו-M2, באמצעות אנליזת שטף חוץ-תאי (extracellular flux analysis). טכניקה זו מאפשרת לחוקרים לבחון כיצד גורמים שונים משפיעים על המטבוליזם והפנוטיפ של המקרופאגים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- אימונולוגיה
- מטבוליזם של תאים
- ביולוגיה של מקרופאגים
רקע
- קיטוב מקרופאגים הוא קריטי לתגובה החיסונית.
- תכנות מחדש מטבולי חיוני לתפקודי מקפאגים מסוג M1 ו-M2.
- הבנת המטבוליזם של מקרופאגים עשויה להוות בסיס לאסטרטגיות טיפוליות.
- שיטה זו נותנת מענה לצורך בבדיקות מטבוליות יעילות במחקר.
מטרת המחקר
- פיתוח בדיקה מהימנה למדידת גליקוליזה ותפקוד מיטוכונדריאלי במקרופאגים.
- אספקת מסגרת למחקר השפעותיהם של ציטוקינים ותרכובות על מטבוליזם של מקרופאגים.
- הסﾗה של מחקרים נוספים על מאפיינים מטבוליים של תאי מערכת החיסון.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- ניתוח שטף חוץ-תאי למדידת גליקוליזה ופרמטרים מיטוכונדריאליים.
- תרבית וקיטוב של מקרופאגים ממקור של מחית עצם.
- שימוש בטכנולוגיית Seahorse למדידות מטבוליות בזמן אמת.
- נורמליזציה של נתונים מבוססת פלואורסצנציה לאחר הבדיקה.
תוצאות עיקריות
- הדגמה של ההבדלים המטבוליים בין מקפגים מסוג M1 ל-M2.
- זיהוי האופן שבו טיפולים ב-LPS וב-IL-4 משפיעים על מטבוליזם של מקפגים.
- מתן תובנות לגבי רזרבה גליקוליטית ותפקוד מיטוכונדריאלי.
- ביסוס פרוטוקול שניתן להשלימו ביעילות בתוך שעתיים.
מסקנות
- שיטה זו משפרת את ההבנה של מטבוליזם של מקרופאגים.
- היא משמשת ככלי בעל ערך למחקר בתחום האימונולוגיה.
- מחקרים עתידיים יכולים להתבסס על מסגרת זו כדי לבחון תאי מערכת חיסון שונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית להנהלה
תכנות מחדש מטבולי הוא גורם קריטי הקובע את המצבים התפקודיים של מקרופאגים, המשפיע באופן ישיר על מסלולי דלקת ופתרון (resolution) במודלים של מחלות. ניתוח זרימה חוץ-תאית בזמן אמת מאפשר הערכה כמותית ומהירה של פעילות גליקולית ומטוכונדריאלית במקרופאגים מקוטבים, ובכך מספק הפחתת סיכונים מכניסטית לתיקוף מטרות אימונומודולטוריות. גישה זו תומכת בביטחון חיזוי בשלבי הגילוי המוקדמים על ידי קישור פנוטיפים המונעים על ידי ציטוקינים לתלויות מטבוליות, ובכך מספקת בסיס לקבלת החלטות לגבי תיקי טיפולים אנטי-דלקתיים או אימונו-מטבוליים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פרמצבטיקה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן היפותזות טיפוליות על ידי קישור של גרייה באמצעות LPS או IL-4 לשינויים מטבוליים מוגדרים בגליקוליזה וב-OXPHOS.
- ערך תפעולי: מאפשר תיקוף של מטרות פונקציונליות באמצעות מדידה בזמן אמת של ECAR ו-OCR כמדדים פנוטיפיים של מצב ההפעלה של מקרופאגים.
- ערך ניבוי: תומך בהפחתת סיכונים מכניסטית על ידי זיהוי תלויות מטבוליות המתואמות עם תפקודי מקרופאגים פרו-דלקתיים או רפואיים (reparative).
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: מייצרת פלטי ECAR ו-OCR כמותיים וסטנדרטיים המתאימים לסריקה בעלת תוכן גבוה (high-content screening) של תרכובות אימונומודולטוריות.
- שחזור: נורמליזציה באמצעות ספירת תאים מבוססת פלואורסצנציה מבטיחה עקביות של הבדיקה בין בארות ובניסויים שונים, ובכך תומכת בהשוואת נתונים חוצה-פונקציות.
- מדרגיות: תואם לפורמט של פלטת מיקרו עם 96 בארות, מה שמאפשר בדיקה מקבילה של מספר תנאים או ריכוזי תרכובות בריצה אחת.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מקשר בין פנוטיפים מטבוליים של מקרופאגים למודלים של מחלות דלקתיות, שבהם האיזון בין M1 ל-M2 משפיע על הפתולוגיה וההחלמה.
- המשכיות תרגומית: מספק גשר פונקציונלי מקטבון in vitro להערכה פרה-קלינית של התערבויות מטבוליות בהפרעות ממחלות תיווך חיסוני.
- קידום מותאם סיכון: מדידות של קיבולת נשימית רזרבית (SRC) ורזרבה גליקולית מסייעות להעריך את התקינות (fitness) של המקרופאג ואת תגובתו למודולטורים מטבוליים.
שילוב זרימת עבודה וצנרת עיבוד
השיטה נכללת ברצף הגילוי, החל מבדיקת השערות על מטרות ועד לאופטימיזציה של מובילים (lead optimization), כאשר פנוטיפ מטבולי מספק מידע על רמת הוודאות לגבי המטרה והשפעת התרכובות על תפקוד תאי מערכת החיסון.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבירור נתיבים על ידי חשיפת האופן שבו גירויי קיטוב מעצבים מחדש נתיבי אנרגיה מרכזיים במקרופאגים.
- סריקה: מספקת קריאות גליקוליטיות ומיטוכונדריאליות בזמן אמת המאפשרות סריקת תרכובות עבור אימונומודולציה מטבולית.
- אנליזה: מדידות ECAR ו-OCR מספקות קריאות דינמיות וכמותיות להשוואת שטף מטבולי בין תנאים ונקודות זמן שונות.
- מחקר תרגומי: מקשר בין מטבוליזם של מקרופאגים in vitro לרלוונטיות in vivo באמצעות סימני היכר מטבוליים שמורים של מצבי השפעה.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה סטנדרטית לאפיון מטבולי שניתן ליישם בתוכניות מחקר באימונולוגיה, אונקולוגיה ופיברוזיס.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בחיזוי על ידי הפחתת העמימות בהקצאת פנוטיפ של מקרופאגים באמצעות פרופיל מטבולי אובייקטיבי.
- ערך תפעולי: מספק נתונים מטבוליים סטנדרטיים הניתנים לשחזור עם כמות מינימלית של תאים, ובכך משפר את יעילות הבדיקה ואת התפוקה.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשך התקדמות (go/no-go) על ידי אספקת תובנה מכניסטית מוקדמת לגבי השפעת תרכובים על מטבוליזם של תאי מערכת החיסון.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מותאם סיכונים של מועמדים לאימונומודולציה, בהתבסס על מעורבות של מטרה מטבולית ותיקון פנוטיפי.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בתרביות של תאי מערכת חיסון ראשוניים, קיטוב ושימוש במכשור למדידת זרימה חוץ-תאית.
- התהליך תלוי במנתח Seahorse XF ובמחסניות חיישנים תואמות למדידה של ECAR ו-OCR בזמן אמת.
- נדרשת סטנדרטיזציה של צפיפות זריעת המקרופאגים, משך הקיטוב והרכב מצע הבדיקה בין הרצות שונות.
- הסתגלות למקרופאגים אנושיים או כאלה שמקורם ברקמה עשויה לדרוש אופטימיזציה של גירויי הקיטוב ותנאי הבדיקה.
- מגבלות מעשיות כוללות רגישות של משך הבדיקה למצב בריאות התאים והצורך בנורמליזציה קפדנית כדי להתחשב בשונות במספר התאים או בחיוניותם.
שאלות נפוצות בתחום הביופארמה
Chapters in this video
0:05
Title
0:59
Bone Marrow-derived Macrophage Polarization
2:17
Extracellular Flux Assay Preparation
3:46
Bioenergetic Characterization of Polarized M1 and M2 Macrophages
5:17
Results: Metabolic Characteristics of Control M0 and M1- and M2-polarized Macrophages
6:49
Conclusion
