אפיון חילוף חומרים של מקוטב M1 והמקרופאגים נגזר מח עצם M2 באמצעות ניתוח תאי שטף בזמן אמת

תכנות מחדש מטבולי הוא מאפיין ותנאי מוקדם לקיטוב מקרופאגים M1 ו-M2. כתב יד זה מתאר מבחן למדידת פרמטרים בסיסיים של גליקוליזה ותפקוד מיטוכונדריאלי במקרופאגים שמקורם במח עצם של עכבר. ניתן ליישם כלי זה כדי לחקור כיצד גורמים מסוימים משפיעים על חילוף החומרים והפנוטיפ של המקרופאגים.

המטרה הכוללת של ניתוח שטף חוץ-תאי זה היא להעריך את המאפיינים המטבוליים של M1 ו-M נאיביים, שני מקרופאגים מקוטבים שמקורם במח עצם. שיטה זו יכולה לשמש מסגרת לחקירת האופן שבו ציטוקינים, תרכובות או קודי גנו, מסוימים משפיעים על הפנוטיפ המטבולי של מקרופאגים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא דורשת רק כמות קטנה של מקרופאגים.

יתר על כן, הוא מודד את כל הפרמטרים הרלוונטיים של גליקוליזה ומיטוכונדריה בבדיקה אחת. למרות ששיטה זו מספקת תובנה לגבי הפנוטיפ המטבולי של מקרופאגים שמקורם במח עצם, ניתן ליישם אותה גם על כל סוגי המקרופאגים או תאי החיסון. היה לנו רעיון לפרסם את השיטה הזו ב-J מכיוון שאנו מקבלים לעתים קרובות בקשות ממדענים אחרים לסייע להם בבדיקות השטף התאי של הגישה המטבולית שלהם ביום השמיני של התרבית, לוודא את נוכחותם של מקרופאגים בוגרים על ידי בדיקה ויזואלית ולדגור את המקרופאגים הבוגרים שמקורם במח עצם ב-10 מיליליטר של מי מלח ציטראט למשך חמש דקות.

37 מעלות צלזיוס כאשר התאים מתנתקים. שוטפים את התרבות עם 10 מיליליטר PBS וסופרים את מספר התאים הקיימאים. לאחר מכן זרע חמש פעמים 10 עד התאים הרביעיים לבאר.

בתרבית תאים XFE 96, מיקרו-צלחת ב-100 מיקרוליטר של מדיום תרבית לבאר, מחזיקה את הפיפטה בזווית בערך באמצע הצד של כל באר. כדי להוציא את התאים, הוסף מדיום בלבד לבארות תיקון הרקע A אחת, A 12, H אחת ו-H 12. לאחר מכן אפשר לתאים להתיישב בטמפרטורת החדר במכסה המנוע של תרבית תאים למשך שעה.

לאחר אישור תרבית הדבקות, התאים בחממת פחמן דו חמצני של 37 מעלות צלזיוס 5%. שלוש שעות לאחר הציפוי, יש לעורר בין ארבע לשש בארות של תאים לכל מצב בהתאם ל-24 שעות. כדי לקטב את המקרופאגים שמקורם במח העצם ביום שלפני בדיקת השטף החוץ-תאי, הנח את מחסנית החיישן הפוכה ליד לוחית השירות ומלא כל צלחת היטב ב-200 מיקרוליטר תמיסת crin.

לאחר מכן, הורד את מחסנית החיישן על לוחית השירות כדי להטביע את החיישנים בתמיסת קין וודא שרמת תמיסת קין גבוהה מספיק כדי לשמור על החיישן שקוע. לאחר מכן הנח את המחסנית בחממה שאינה פחמן דו חמצני 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת, הסר בעדינות את הסופרנטנט מהמקרופאגים המקוטבים ושטוף את התאים עם 100 מיקרוליטר של בדיקה טרייה.

בינוני לבאר. הוסף 180 מיקרוליטר של מדיום בדיקה לכל באר, והשתמש במיקרוסקופ כדי לוודא שהתאים לא נשטפו. אם התאים עדיין מחוברים, הנח את הצלחת באינקובטור שאינו פחמן דו חמצני של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת לפני ריצת הבדיקה בזמן שהתאים דגירה.

הכינו 10 x תערובות תרכובות הזרקה כמפורט בטבלה וחממו את התערובות ל-37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן טען את מחסנית החיישן בנפחים המתאימים של תרכובת ויציאות A, B, C ו-D באמצעות מדריכי הטעינה המסופקים כדי לאפיין את הביו-אנרגיה של המקרופאגים המקוטבים על ידי בדיקת שטף חוץ-תאי. השתמש באשף הבדיקה כדי ליצור תבנית בדיקה עם זמני ערבוב של שתי דקות ושלוש דקות, ולפחות שלוש לולאות מדידה של ערבוב וקצב לפני כל אחת מארבע ההזרקות ואחרי ההזרקה האחרונה.

לאחר מכן התחל את הבדיקה ופעל לפי ההוראות כפי שמצוין על ידי המכשיר. טעינת לוחית המחסנית עם הבדיקות המיובשות כדי לאפשר כיול על ידי המכשיר ולוחית התא. בהוראה, בתום הבדיקה, השליכו בזהירות את כל מדיום הבדיקה ואחסנו את המיקרו-צלחת של תרבית התאים המנותחת במינוס 20 מעלות צלזיוס עד לנורמליזציה.

כדי לנרמל את התאים באמצעות ערכת בדיקת התפשטות התאים, יש להפשיר את הצלחת ולדגור את התאים ב-200 מיקרוליטר של מאגר ליזה תאים טרי שהוכן לבאר למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לבסוף, מדוד את הקרינה עם עירור של כ-480 ננומטר ופליטה מקסימלית של כ-520 ננומטר. שימוש במדידות הקרינה הנרכשות כדי לחשב את היחס שבו ספירת התאים הממוצעת של כל בארות המקרופאגים הנאיביות מוגדרת כאחת, ואז לייצא את היחסים הללו לתוכנת ניתוח גלי סוסון הים.

כדי לנרמל את הנתונים, בדיקת שטף חוץ-תאי תניב בדרך כלל קצב החמצה חוץ-תאית או ECAR וקצב צריכת חמצן, או עלילות OCR כפי שמודגם באיור מייצג זה לאחר הזרקת הגלוקוז, העלייה הנצפית ב-ECAR מייצגת את קצב הגליקוליזה. העלייה הנוספת שנצפתה ב-ECAR לאחר עיכוב TP סינתאז עם כל הליגה מיצין מספקת מידע נוסף על הרזרבה והקיבולת הגליקוליטית. בעת ניתוח ערכי ה-OCR, הזרקת CIN מקלה על חישוב צריכת החמצן המשמשת לסינתזה מיטוכונדריאלית A TP, FCCP מבטל את הנשימה המיטוכונדריאלית.

מדידות ה-OCR המתאימות מניבות נתונים על ריקבון קיבולת הנשימה המקסימלית והעודפת הידועה והזרקת אנטימיצין, עם זאת, חוסמים קומפלקסים מיטוכונדריאלים 1 ו-3 כאשר ה-OCR השיורי מייצג את צריכת החמצן הלא מיטוכונדריאלית. הפעלת מקרופאגים עם LPS גורמת לחילוף חומרים גליקוליטי מוגבר. עם ההבדלים בין LPS ל-IL, ארבעה מקרופאגים מטופלים הופכים ברורים עוד יותר כאשר נצפים שיעורי צריכת החמצן.

ואכן, בעוד שהמטבוליזם החמצוני המקסימלי מדוכא מאוד במקרופאגים שטופלו ב-LPS, IL 4 גורם לנשימה חזקה ב-M שני מקרופאגים. לאחר השליטה, ניתן להשלים את בדיקת השפעת החוץ-תאית תוך שעתיים אם היא מבוצעת כראוי. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להזריק וטרינר יחד עם FCCP כדי לתדלק נשימה מקסימלית עם ניתוק.

לאחר טכניקה זו, ניתן לבצע בדיקות נוספות כמו אלייזה כדי להעריך קיטוב מקרופאגים יעיל. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים מתחום האימונולוגיה לחקור את המאפיינים המטבוליים של מגוון רחב של תאי חיסון. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע ניתוח שטף חוץ-תאי כדי להעריך את הפנוטיפ המטבולי של מקרופאגים.