דור משופר של המושרה cardiomyocytes שימוש Construct Polycistronic הבעת יחס אופטימלי של Gata4, Mef2c וTbx5

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא להדגים כיצד לייצר ביעילות קרדיומיוציטים מושרים מפיברובלסטים לבביים עם מבנה MGT פולי ציוני, המבטא יחס אופטימלי של gata four, F two C ו-TBX five. שיטה זו מספקת פלטפורמה רבת ערך למחקר קרדיומיוציטים מושרים ותאפשר מחקרים גבוהים עד לאחר סינון ומחקרים מכניסטיים של תכנות קרדיומיוציטים מושרים, תוך העברת התחום לעבר יישומי מרפאה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שבאמצעות מבנה רטרו-ויראלי יחיד בלבד, ניתן להמיר ביעילות פיברובלסטים קרדיו-ויראלים לקרדיומיוציטים.

נקה את העכבר הטרנסגני GFP בעל השרשרת הכבדה אלפא מיוזין בילודים עם 75% נפח לנפח. אתנול מבצע המתת חסד. לאחר מכן פתח את חלל הגוף על ידי ביצוע חתך אופקי מתחת לבית השחי אחד לשני באמצעות מלקחיים סטריליים, קהים ומכופפים.

נתחו את הלב והניחו אותו בבאר אחת מתוך צלחת 24 בארות המכילה קרח. PBS קר צופה בביטוי GFP בכל הלב באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. מניחים שלושה לבבות FP חיוביים לתוך צלחת תרבית באר מרכזית של 60 מילימטר בעזרת מלקחיים ומספריים סטריליים, טוחנים את הלבבות לחתיכות קטנות של פחות ממילימטר מעוקב אחד.

מעבירים את הלבבות הטחונים לכלי של 10 ס"מ ומכסים בשני מיליליטר פיברבלסט או מדיום FB. השאירו את הצלחות ללא הפרעה למשך שלוש שעות לפחות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה מוסיפים לאט שמונה מיליליטר של מדיום FB חם מראש לתבשיל המכיל את רקמת הלב הטחונה.

לאחר מכן דגרו על הרקמה ללא הפרעה למעט החלפת המדיום כל שלושה ימים. ביום השביעי יש לשאוב את מדיום התרבות ולשטוף את התאים עם DPBS. הוסף שלושה מיליליטר של 0.05% נסיעות ב-EDTA לכל צלחת ודגירה ב-37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.

הוסף חמישה מיליליטר של מדיום FB כדי לנטרל את הטריפסין, ולאחר מכן נתק בעדינות את התאים בעזרת מגרד תאים. לאחר מכן, אספו את התאים וסננו דרך מסנני תאים של 40 מיקרון כדי למנוע זיהום בשברי רקמת לב. גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה ב -200 פעמים G למשך חמש דקות, החל מלבבות עכברים יילודים מבודדים.

חותכים כל לב לארבעה חלקים שעדיין מחוברים באופן רופף. העבירו את הלבבות לתוך צינור חרוטי של 15 מיליליטר המכיל שמונה מיליליטר חם של 0.05% טריפסין EDTA ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. לאחר הדגירה, השליכו את הטריפסין EDTA והוסיפו חמישה מיליליטר של מערבולת קולגנאז חמה מסוג 2 למשך דקה אחת במהירות בינונית, ולאחר מכן דגרו את הצינור באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך שלוש עד חמש דקות.

ואז מערבב שוב את הצינור למשך דקה אחת. אפשרו לחתיכות הרקמה להתייצב ואספו את הסופרנטנט לתוך שפופרת חדשה המכילה חמישה מיליליטר של מדיום FB קר. הוסיפו חמישה מיליליטר של קולגנאז טרי מסוג 2 לחתיכות הרקמה וחזרו על שלבי המערבולת והדגירה.

שלבו את כל התאים שמכילים סופרנטנטים על ידי סינון שלהם דרך מסננת תאים של 40 מיקרון. צנטריפוגה של תאים אלה בטמפרטורה של 200 פעמים G למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. לפי אחת משיטות בידוד הפיברובלסטים הלבביים.

שטפו את גלולת התא הסופית פעם אחת ב-10 מיליליטר של מיון תאים מופעלים מגנטיים או מאגר מקסימלי. הסר 10 מיקרוליטר לספירת תאים חיים וצנטריפוגה את התאים הנותרים ב-200 פעמים G למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס עבור פחות מ-1 כפול 10 לתאים השביעיים. השעו מחדש את גלולת התא עם 10 מיקרוליטר של ירך, 1.2 מיקרו-חרוזים מגנטיים מצומדים ב-90 מיקרוליטר של מאגר מקסימלי צונן וערבבו.

ובכן דוגרים את החרוזים בארבע מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. כדי לגלול את התאים, הוסף 10 מיליליטר של מאגר מקסימלי וצנטריפוגה את הדגימות ב-200 פעמים G למשך חמש דקות. יש לשטוף פעם אחת עם 10 מיליליטר של מאגר מקסימלי ולהשעות מחדש את כדור התא בנפח כולל של שני מיליליטר במכסה תאים.

הגדר מפריד מקסימלי והוסף עמודת LS. איזון העמודה עם שלושה מיליליטר של מאגר מקסימלי. העבירו את מתלה התא דרך עמוד ה- LS ושטפו שלוש פעמים עם שני מיליליטר של מאגר מקסימלי.

לאחר מכן הסר את עמודת ה-LS מהמפריד והוציא שלוש פעמים עם שני מיליליטר של מאגר מקסימלי. איסוף ה- EIT בצינור חרוטי של 50 מיליליטר. צנטריפוגה את ה- EIT ב -200 פעמים G למשך חמש דקות.

השעו מחדש את הפיברובלסטים המבודדים ב-10 מיליליטר של מדיום FB וספרו את התאים, זרעו את התאים לתוך צלחות תרבית רקמה בצפיפות מתאימה בצלחת ג'לטין מקודדת מראש של 24 בארות כדי לתכנת מחדש פיברובלסטים לבביים. הוסף 500 מיקרוליטר של קרדיומיוציטים מושרים או מדיום ICM המכיל מוח פולי לכל באר מ-24 לוחות הבאר היושבים עם תאים. הוסף 10 מיקרוליטר של הרטרו-וירוס לכל באר של פיברובלסטים מבודדים.

דגרו את הצלחת עם חלקיקים רטרו-ויראלים למשך 24 עד 48 שעות בחממת תרבית תאים. לאחר מכן החלף את המדיום המכיל את הנגיף ב-500 מיקרוליטר של מדיום ICM טרי, והחלף את המדיום כל יומיים-שלושה. התחל ברירה חיובית של תאים מתמרים נגיפיים על ידי השלמת מדיום ICM עם שני מיקרוגרם למיליליטר של מיצין פור.

לאחר שלושה ימים של בחירה, שנה את המדיום למינון תחזוקה של מיקרוגרם אחד למיליליטר פור מיצין כדי לדמיין המרה של פיברובלסטים לבביים לקרדיומיוציטים. התבונן בלוחות שנבחרו לביטוי GFP באמצעות מיקרוסקופ הפוך. לבסוף, 14 יום לאחר הטיפול הנגיפי, החלף את מדיום ICM ב-B 27.

מיקומי תאים פועמים ספונטניים בינוניים עשויים להופיע לאחר שלושה עד ארבעה שבועות לאחר ביטוי התמרה ויראלית של סמנים לבביים, כולל טרופונין לב t ואלפא. ניתן לזהות אקטינין על ידי אימונוכימיה בימים 10 עד 14. כאן, ביטוי טרופונין T לבבי נראה ב-I CMS שהומר מפיברובלסטים, המבטאים ביטוי GFP אלפא אקטינין ב-ICMs ניתן לראות כאן.

ניתוח על ידי זרימה ציטומטרית מראה עליות דומות בביטוי טרופונין T לבבי, במיוחד לאחר בחירת פור מיצין של קרדיומיוציטים מושרים. המיתולוגיה המתוארת כאן מאפשרת ייצור יעיל של קרדיומיוציטים מושרים המבוססים על אספקה רטרו-ויראלית של גורמי שעתוק NGT במבנה יחיד.