דור משופר של המושרה cardiomyocytes שימוש Construct Polycistronic הבעת יחס אופטימלי של Gata4, Mef2c וTbx5

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא להדגים כיצד לייצר ביעילות תאי שריר לב (cardiomyocytes) מושריים מפיברובלסטים של הלב באמצעות מבנה poly cistronic MGT, המבטא יחס אופטימלי של gata4, Tbx5 ו-Mef2c. שיטה זו מספקת פלטפורמה בעלת ערך למחקר של cardiomyocytes מושריים ותסייע בביצוע סריקות בהספק גבוה (high-throughput screening) ומחקרים מכניסטיים של תכנות cardiomyocytes מושריים, תוך קידום התחום לעבר יישומים קליניים. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שבאמצעות שימוש במבנה רטרו-ויראלי בודד, ניתן להמיר פיברובלסטים של הלב ל-cardiomyocytes ביעילות.

נקה את העכבר הטרנסגני הנושא GFP בשרשרת כבדה של אלפא-מיוזין בבניויל (neonatal alpha myosin heavy chain) באמצעות אתנול בריכוז 75% נפח לנפח, ובצע המתנזיה. לאחר מכן, פתח את חלל הגוף על ידי ביצוע חתך אופקי מבית השחי של צד אחד למשניו, תוך שימוש בפינצטה סטרילית, קהה ומעוקלת.

הוצא את הלב באמצעות דיסקציה והנח אותו בבאר אחת של פלטת 24 בארות המכילה קרח. השתמש ב-PBS קר ובמיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי לצפות בביטוי GFP בכל רחבי הלב. העבר שלושה עד ארבעה לבבות חיוביים ל-GFP לתוך צלחת תרבית עם באר מרכזית בקוטר 60 מילימטר באמצעות פינצטה ומספריים סטריליים, וקטע את הלבבות לחלקים קטנים שגודלם פחות מ-1 מילימטר מעוקב.

העבירו את הלבבות הקצוצים לצלחית של 10 סנטימטרים וכסו בשני מיליליטרים של מצע fiberblast או FB. השאירו את הצלחות ללא הפרעה למשך שלוש שעות לפחות באינקובטור בטמפרטורה של 37 degrees Celsius. לאחר האינקובציה, הוסיפו באיטיות שמונה מיליליטרים של מצע FB שחומם מראש לצלחית המכילה את רקמת הלב הקצוצה.

לאחר מכן דגרו את הרקמה ללא הפרעה, למעט החלפת המצע מדי שלושה ימים. ביום השביעי, שאבו את מצע התרבית ושטפו את התאים ב-DPBS. הוסיפו שלוש מיליליטר של 0.05%trypsin ב-EDTA לכל צלחת ודגרו ב-37 degrees Celsius למשך חמש דקות.

הוסיפו חמישה מיליליטר של מצע FB כדי לנטרל את ה-trypsin, ולאחר מכן הפרידו בעדינות את התאים באמצעות מגרדת תאים (cell scraper). לאחר מכן, אספו את התאים וסננו אותם דרך מסנני תאים של 40 מיקרון כדי למנוע זיהום על ידי שברי רקמת לב. השקיעו את התאים על ידי סבוב במערך צנטריפוגה ב-200 times G למשך חמש דקות, החל מלבבות מבודדים של עכברים רכים (neonatal mouse hearts).

חתכו כל לב לארבעה חלקים שעדיין מחוברים באופן רופף. העבירו את הלבבות לשפופרת קונית של 15 milliliter המכילה שמונה milliliters של 0.05%tripsin EDTA חמים והדגרירו בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך 15 דקות. לאחר ההדגירה, השליכו את ה-tripsin EDTA והוסיפו חמישה milliliters של type two collagenase חם, ערבלו במכשיר vortex למשך דקה אחת במהירות בינונית, ולאחר מכן הדגרירו את השפופרת במקלחית של 37 degree Celsius למשך שלוש עד חמש דקות.

לאחר מכן, ערבבו את המבחנה שוב במכשיר vortex למשך דקה אחת. המתינו עד שחלקי הרקמה ישקעו ואספו את הנוזל העליון (supernatant) למבחנה חדשה המכילה 5 mL של מצע FB קר. הוסיפו 5 mL של collagenase מסוג 2 טרי לחלקי הרקמה וחזרו על שלבי הערבוב ב-vortex והדגירה.

יש לאחד את כל העל-נוזלים המכילים תאים על ידי סינונם דרך מסננת תאים של 40 micron. יש לסובב את התאים הללו בצנטריפוגה במהירות של 200 times G למשך חמש דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות Celsius, בהתאם לאחת משיטות בידוד הפיברובלסטים של הלב.

שטפו את משקע התאים הסופי פעם אחת ב-10 milliliters של magnetic activated cell sorting או max buffer. הסירו 10 microliters לצורך ספירת תאים חיים וסובבו במערך צנטריפוגה את התאים שנותרו ב-200 times G למשך חמש דקות בטמפרטורה של ארבע degrees Celsius עבור פחות מ-1 times 10 to the seventh תאים. השביו את משקע התאים עם 10 microliters של thigh 1.2 conjugated magnetic microbeads ב-90 microliters של max buffer מקורר וערבבו.

דגרו את החרוזים בטמפרטורה של 4 °C למשך 30 דקות. כדי לשקע את התאים, הוסיפו 10 milliliters של max buffer וסובבו את הדגימות בצנטריפוגה ב-200 ×g למשך חמש דקות. שטפו פעם אחת עם 10 milliliters של max buffer והשעיו מחדש את משקע התאים בנפח כולל של 2 milliliters תחת מנדף תרביות תאים.

הכינו מפריד max והוסיפו עמודת LS. השגו את העמודה לשיווי משקל באמצעות שלושה milliliters של max buffer. העבירו את תרחיף התאים דרך עמודת ה-LS ושטפו שלוש פעמים עם שני milliliters של max buffer.

לאחר מכן, הוצא את עמודת ה-LS מהמפריד ובצע אלוציה שלוש פעמים עם 2 mL של max buffer. אסוף את ה-EIT לשפופרת קונית בנפח 50 mL. סבב את ה-EIT בצנטריפוגה במהירות של 200 ×g למשך חמש דקות.

שחזר את הפיברובלסטים המבודדים ב-10 milliliters של מצע FB וספור את התאים, זרע את התאים בצלחות לתרבית רקמה בצפיפויות מתאימות בתוך פלטת 24 בארות מצופה מראש בג'לטין כדי לתכנת מחדש פיברובלסטים של הלב. הוסף 500 microliters של מצע cardiomyocyte מושרה או מצע ICM המכיל poly brain לכל באר בפלטות ה-24 בארות שבהן נזרעו התאים. הוסף 10 microliters של הרטרו-וירוס לכל באר של פיברובלסטים מבודדים.

דגרו את הפלטה עם חלקיקי הרטרו-וירוס למשך 24 עד 48 שעות באינקובטור לתרביות תאים. לאחר מכן, החליפו את המצע המכיל את הווירוס ב-500 µL של מצע ICM טרי, והחליפו את המצע מדי יומיים עד שלושה ימים. התחילו בסלקציה חיובית של תאים שעברו טרנסדוקציה ויראלית על ידי תוספת של 2 µg/mL של pur mycin למצע ה-ICM.

לאחר שלושה ימי סלקציה, יש להחליף את המצע למינון תחזוקה של 1 µg/mL purmycin כדי להדמיאן את המרת הפיברובלסטים של הלב לתאי שריר לב (cardiomyocytes). יש לבחון את הצלחות הסלקציה של purmycin לאיתור ביטוי של GFP באמצעות מיקרוסקופ הפוך. לבסוף, 14 ימים לאחר הטיפול הוויראלי, יש להחליף את מצע ה-ICM ב-B 27.

מוקדים של תאים עם פעימות ספונטניות בתווך עשויים להופיע שלושה עד ארבעה שבועות לאחר ביטוי של סממנים לבביים באמצעות טרנסדוקציה ויראלית, כולל cardiac troponin t ו-alpha. ניתן לזהות Actinin באמצעות אימונוכימיה בימים 10 עד 14. כאן, ניתן לראות ביטוי של cardiac troponin T ב-I CMS שהומרו מפיברובלסטים, המבטאים GFP; ביטוי של alpha actinin ב-ICMs ניתן לראות כאן.

ניתוח באמצעות ציטומטריה של זרימה מראה עליות דומות בביטוי של cardiac troponin T, במיוחד לאחר סלקציה של purmycin של תאי שריר לב מושריים. המתודולוגיה המתוארת כאן מאפשרת ייצור יעיל של תאי שריר לב מושריים המבוסס על הולכה רטרו-ויראלית של פקטורי שעתוק NGT בתוך קונסטרקט בודד.