Name: פרוטוקולים לניתוח תפקידם של תאי פנט התחדשות Murine המעי באמצעות מותנה Cre-לקס מודלי עכבר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: למדו לבודד ולהכין מעי עכבר לניתוח תאי גזע אפיתליים ותאי פנת'. השיטה מאפשרת לחקור התחדשות אפיתל המעי ותפקיד תאי הפנת' בשמירה על שלמות המעי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

המחברים רוצים להודות למארק בישופ, מתיו זברב, ויקטוריה מארש-דרבן, אדם בלקווד וסילבי רובין. עבודה זו מומנה על ידי מענק תוכנית מ-Cancer Research UK.

<ol><li>Cheng, H., Origin Leblond, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((differentiation+and+renewal+of+the+four+main+epithelial+cell+types+in+the+mouse+small+intestine.+V.+Unitarian+Theory+of+the+origin+of+the+four+epithelial+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Anat%22%5BJournal%5D)">differentiation and renewal of the four main epithelial cell types in the mouse small intestine. V. Unitarian Theory of the origin of the four epithelial cell types.</a> Am J Anat. 141 (4), 537-561 (1974).</li>
<li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+stem+cells+in+small+intestine+and+colon+by+marker+gene+Lgr5%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5.</a> Nature. 449 (7165), 1003-1007 (2007).</li>
<li>Clevers, H. The gut, a clonal conveyor belt. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.molecularmovies.com/movies/view/96">http://www.molecularmovies.com/movies/view/96</a> (2015).</li>
<li>Snippert, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+crypt+homeostasis+results+from+neutral+competition+between+symmetrically+dividing+Lgr5+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells.</a> Cell. 143 (1), 134-144 (2010).</li>
<li>Lopez-Garcia, C., Klein, A. M., Simons, B. D., Winton, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+stem+cell+replacement+follows+a+pattern+of+neutral+drift%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Intestinal stem cell replacement follows a pattern of neutral drift.</a> Science. 330 (6005), 822-825 (2010).</li>
<li>Buczacki, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+label-retaining+cells+are+secretory+precursors+expressing+Lgr5%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Intestinal label-retaining cells are secretory precursors expressing Lgr5.</a> Nature. 495 (7439), 65-69 (2013).</li>
<li>Basak, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+early+fate+determination+in+Lgr5%2B+crypt+stem+cells+using+a+novel+Ki67-RFP+allele%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Mapping early fate determination in Lgr5+ crypt stem cells using a novel Ki67-RFP allele.</a> EMBO J. 33 (18), 2057-2068 (2014).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paneth+cells+constitute+the+niche+for+Lgr5+stem+cells+in+intestinal+crypts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts.</a> Nature. 469 (7330), 415-418 (2011).</li>
<li>Young, M., Ordonez, L., Clarke, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+are+the+best+routes+to+effectively+model+human+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+oncology%22%5BJournal%5D)">What are the best routes to effectively model human colorectal cancer.</a> Molecular oncology. 7 (2), 178-189 (2013).</li>
<li>Sauer, B., Henderson, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+DNA+recombination+in+mammalian+cells+by+the+Cre+recombinase+of+bacteriophage+P1%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Site-specific DNA recombination in mammalian cells by the Cre recombinase of bacteriophage P1.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 85 (14), 5166-5170 (1988).</li>
<li>Brault, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+the+beta-catenin+gene+by+Wnt1-Cre-mediated+deletion+results+in+dramatic+brain+malformation+and+failure+of+craniofacial+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Inactivation of the beta-catenin gene by Wnt1-Cre-mediated deletion results in dramatic brain malformation and failure of craniofacial development.</a> Development. 128 (8), 1253-1264 (2001).</li>
<li>Fevr, T., Robine, S., Louvard, D., Huelsken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt%2F%CE%B2-catenin+is+essential+for+intestinal+homeostasis+and+maintenance+of+intestinal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Wnt/β-catenin is essential for intestinal homeostasis and maintenance of intestinal stem cells.</a> Molecular and Cellular Biology. 27 (21), 7551-7559 (2007).</li>
<li>Ireland, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+Cre-mediated+control+of+gene+expression+in+the+murine+gastrointestinal+tract%3A+effect+of+loss+of+beta-catenin%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Inducible Cre-mediated control of gene expression in the murine gastrointestinal tract: effect of loss of beta-catenin.</a> Gastroenterology. 126 (5), 1236-1246 (2004).</li>
<li>Kemp, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elimination+of+background+recombination%3A+somatic+induction+of+Cre+by+combined+transcriptional+regulation+and+hormone+binding+affinity%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Elimination of background recombination: somatic induction of Cre by combined transcriptional regulation and hormone binding affinity.</a> Nucleic Acids Res. 32 (11), e92(2004).</li>
<li>Madison, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cis+elements+of+the+villin+gene+control+expression+in+restricted+domains+of+the+vertical+%28crypt%29+and+horizontal+%28duodenum%2C+cecum%29+axes+of+the+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Cis elements of the villin gene control expression in restricted domains of the vertical (crypt) and horizontal (duodenum, cecum) axes of the intestine.</a> J Biol Chem. 277 (36), 33275-33283 (2002).</li>
<li>Parry, L., Young, M., El Marjou, F., Clarke, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+crucial+role+of+paneth+cells+in+mediating+the+intestinal+response+to+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Evidence for a crucial role of paneth cells in mediating the intestinal response to injury.</a> Stem Cells. 31 (4), 776-785 (2013).</li>
<li>Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generalized+lacZ+expression+with+the+ROSA26+Cre+reporter+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain.</a> Nat Genet. 21 (1), 70-71 (1999).</li>
<li>el Marjou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+and+inducible+Cre-mediated+recombination+in+the+gut+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific and inducible Cre-mediated recombination in the gut epithelium.</a> Genesis. 39 (3), 186-193 (2004).</li>
<li>Guillemot, F., Nagy, A., Auerbach, A., Rossant, J., Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+role+of+Mash-2+in+extraembryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Essential role of Mash-2 in extraembryonic development.</a> Nature. 371 (6495), 333-336 (1994).</li>
<li>Gregorieff, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+pattern+of+Wnt+signaling+components+in+the+adult+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Expression pattern of Wnt signaling components in the adult intestine.</a> Gastroenterology. 129 (2), 626-638 (2005).</li>
<li>van der Flier, L. G., Haegebarth, A., Stange, D. E., van de Wetering, M., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OLFM4+is+a+robust+marker+for+stem+cells+in+human+intestine+and+marks+a+subset+of+colorectal+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">OLFM4 is a robust marker for stem cells in human intestine and marks a subset of colorectal cancer cells.</a> Gastroenterology. 137 (1), 15-17 (2009).</li>
<li>Merritt, A., Allen, T., Potten, C., Hickman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+in+small+intestinal+epithelial+from+p53-null+mice%3A+evidence+for+a+delayed%2C+p53-independent+G2%2FM-associated+cell+death+after+gamma-irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Apoptosis in small intestinal epithelial from p53-null mice: evidence for a delayed, p53-independent G2/M-associated cell death after gamma-irradiation.</a> Oncogene. 14 (23), 2759-2766 (1997).</li>
<li>Marshman, E., Ottewell, P., Potten, C., Watson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase+activation+during+spontaneous+and+radiation-induced+apoptosis+in+the+murine+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Caspase activation during spontaneous and radiation-induced apoptosis in the murine intestine.</a> J Pathol. 195 (3), 285-292 (2001).</li>
<li>Fevr, T., Robine, S., Louvard, D., Huelsken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt%2Fbeta-catenin+is+essential+for+intestinal+homeostasis+and+maintenance+of+intestinal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Wnt/beta-catenin is essential for intestinal homeostasis and maintenance of intestinal stem cells.</a> Mol Cell Biol. 27 (21), 7551-7559 (2007).</li>
<li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crypt+stem+cells+as+the+cells-of-origin+of+intestinal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crypt stem cells as the cells-of-origin of intestinal cancer.</a> Nature. 457 (7229), 608-611 (2009).</li>
<li>Tian, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reserve+stem+cell+population+in+small+intestine+renders+Lgr5-positive+cells+dispensable%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A reserve stem cell population in small intestine renders Lgr5-positive cells dispensable.</a> Nature. 478 (7368), 255-259 (2011).</li>
<li>Yilmaz, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTORC1+in+the+Paneth+cell+niche+couples+intestinal+stem-cell+function+to+calorie+intake%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">mTORC1 in the Paneth cell niche couples intestinal stem-cell function to calorie intake.</a> Nature. 486 (7404), 490-495 (2012).</li>
<li>Adolph, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paneth+cells+as+a+site+of+origin+for+intestinal+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Paneth cells as a site of origin for intestinal inflammation.</a> Nature. 503 (7475), 272-276 (2013).</li>
<li>Marsh, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+Pten+is+dispensable+for+intestinal+homeostasis+but+suppresses+adenoma+development+and+progression+after+Apc+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Epithelial Pten is dispensable for intestinal homeostasis but suppresses adenoma development and progression after Apc mutation.</a> Nat Genet. 40 (12), 1436-1444 (2008).</li>
<li>Jardé, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+and+in+vitro+models+for+the+therapeutic+targeting+of+Wnt+signaling+using+a+Tet-O%CE%94N89%CE%B2-catenin+system%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">In vivo and in vitro models for the therapeutic targeting of Wnt signaling using a Tet-OΔN89β-catenin system.</a> Oncogene. 32 (7), 883-893 (2013).</li>
<li>Hung, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+mouse+model+for+sporadic+and+metastatic+colon+tumors+and+its+use+in+assessing+drug+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Development of a mouse model for sporadic and metastatic colon tumors and its use in assessing drug treatment.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (4), 1565-1570 (2010).</li>
<li>Dacquin, R., Starbuck, M., Schinke, T., Karsenty, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+alpha1%28I%29-collagen+promoter+is+the+best+known+promoter+to+drive+efficient+Cre+recombinase+expression+in+osteoblast%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Mouse alpha1(I)-collagen promoter is the best known promoter to drive efficient Cre recombinase expression in osteoblast.</a> Dev Dyn. 224 (2), 245-251 (2002).</li>
<li>Hinoi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+model+of+colonic+adenoma-carcinoma+progression+based+on+somatic+Apc+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Mouse model of colonic adenoma-carcinoma progression based on somatic Apc inactivation.</a> Cancer Res. 67 (20), 9721-9730 (2007).</li>
<li>Sansom, O. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+Apc+allows+phenotypic+manifestation+of+the+transforming+properties+of+an+endogenous+K-ras+oncogene+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Loss of Apc allows phenotypic manifestation of the transforming properties of an endogenous K-ras oncogene in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 103 (38), 14122-14127 (2006).</li>
<li>Wong, V. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lrig1+controls+intestinal+stem-cell+homeostasis+by+negative+regulation+of+ErbB+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Lrig1 controls intestinal stem-cell homeostasis by negative regulation of ErbB signalling.</a> Nat Cell Biol. 14 (4), 401-408 (2012).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>van de Wetering, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+Derivation+of+a+Living+Organoid+Biobank+of+Colorectal+Cancer+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Prospective Derivation of a Living Organoid Biobank of Colorectal Cancer Patients.</a> Cell. 161 (4), 933-945 (2015).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

שימוש בעכברים הטרנסגניים Cre-לקס מותנים לנתח את הפונקציה של גנים ותאים הוא גישה נפוץ. מודלים אלה היו בשימוש בהצלחה רבה במעי לזהות ולאפיין את תאי גזע 2,4-6 ולהבין את תפקידם במחלה 25. כדי לנצל באופן מלא דגמים אלה מחייב אפיון מקיף של המערכת כדי לאפשר נתונים להתפרש בצורה נכונה. הבנה של מערכות אלה מלאים היא קשה להשגה בשל גנים לעתים רחוקות להיות ספציפיים לסוג תא בודד או מיקום, חוסר ידע וחוסר היעילות של המערכות המשמשות כדי לעודד ביטוי Cre ביולוגיים. השיטות שתוארו כאן להדגים כיצד אנו להתגבר על בעיות אלה באמצעות עיצוב ויישום של ידע הקיים ניסיוניים. למרות שאנו משתמשים בשיטות אלה כדי לענות על שאלת מחקר ספציפית הטכניקות מוצגות כאן הנן גנריים וניתן לנצל לכל מחקר חוקר את Muriמעי ne. הכנת רקמת מעי הצעד החיוני להבטחת תוצאות חזקות הוא הקצירה והעיבוד של הרקמות, אשר צריך להיות מעובד באופן פרוטוקולים וקיבעון בזמן דבק בקפדנות. נושאים כמו כמעט כל משמעותיים במורד הזרם ניתן לייחס לחפצים הקשורים לייבוש הרקמות החוצה ו / או קיבעון שלם. העיתוי הוא קריטי כדי למנוע השפלה של אדריכלות רקמות ו / או חומצות גרעין וחלבונים. קיבעון שלם או נלהב מדי יכול לגרום לאובדן של הרזולוציה histochemical. קיבעון שלם בשל זמן או חלקים עבים מדי כדי לאפשר חדירה מקבע יכולה לגרום לאובדן של רזולוציה בתוך מאורות המעי שיכול להיות שנצפו כ&quot; סימן גאות &quot;על ניתוח IHC מספיק. בהמשך זה קריטי, כי קיבעון לא להאריך יותר מדי זמן, כמו β-קטנין הגרעיני יכול לפזר מתוך הגרעין, אלא אם כן באופן מיידי פרוcessed והשעווה המוטבעת הבאים קיבעון פורמלין. תפקיד של תאי פנט בנישת ISC הנתונים המוצגים כאן ביעילות להראות את החשיבות של תאי פנט בהתחדשות קריפטה במעי המבוגר הבאה אובדן ISC. עם זאת נותר האפשרות שאה-Cre חוסך אוכלוסייה של ISCs שמטרות T2 ויל-Cre-ER. טיאן et al. 26 באלגנטיות הוכיח כי ISCs היי Lgr5 מוחלפים על ידי אוכלוסייה של ISCs המילואים Lgr5 lo. סביר להניח כי ISCs אלה חסכו במערכת אה-Cre בשל אוכלוסיית המילואים שזוהתה כמבשרי תא הפרשת 6,7 עכשיו. חשיבותו של תא פנט הבוגר בתמיכת מבשרי תא הפרשה אלה בעת הצורך לחזור למדינת ISC נותרת ענתה. כתאי פנט מהווים אניהנישה SC 8 ולשחק תפקידים בויסות תגובות ISC לצריכת קלוריות 27 ודלקת 28 הוא נשאר סביר להניח כי פונקציות הסיעוד שלהם תהיה להאריך למבשרים שלהם. גישות וטכנולוגיות ליעילות המודל אנושי של סרטן המעי הגס חדשות הגילוי של ISC הוביל לזיהוי של גנים עכשיו שנמצא בשימוש כדי ליצור מודלים עכבר חדשים לחקירה את התפקידים של גנים ותאים בביולוגיה מעיים ומחלות, נסקרה על ידי קלארק ואח &#39;9. המגבלות רק לטכניקה זו היא זיהוי של גנים לבטא חלבון Cre. נכון לעכשיו ISCs באופן שיגרתי נחקר באמצעות עכברים הטרנסגניים מותנים המבוססים על תבנית ביטוי גני Lgr5. עכברים אשר מבטאים Cre מאמרגן Lgr5 שימשו למחוק APC, הגן שעבר מוטציה הנפוצה ביותר בסרטן מעי גס (CRC), הממחיש את ISC כתא ממוצא 25. סלקטיבי מחיקת גני CRC אחרים בתאים אלה מספק תובנה התקדמות מחלה והתפשטו לדוגמא. PTEN 29. תובנה נוספת לתוך פונקצית ISC מתבצעת תוחזר על ידי ablating במיוחד Lgr5 -expressing תאים בעכברים באמצעות קולטן רעלן דיפתריה האנושית גן (DTR) דפק לLgr5 לוקוס 26. אסטרטגיות אחרות להשתמש במערכת ט-O המאפשרת ביטוי הפיך מתמשך של חלבוני מוטציה 30. שימוש בכלים אלה כדי לשנות גן (ים) בתאים שונים ובמקומות 31 32,33 משמש כדי להבין איך הסרטן ליזום, התקדמות ולשלוח גרורות 34. לחלופין mutagenesis באמצעות מערכת transposon יופי השינה הוא זיהוי נהגים חדשים של CRC. הפיתוח המתמשך של עכברים, טכניקות ואסטרטגיות שינוי גנטיות ממשיך לפתח מודלים רלוונטיים יותר סבלניים. מ &#39;חדשethods פותחו לאפיון של epithelia וISCs המעיים. אפיון של היחס של סוגי תאי האפיתל יכול להיות מושגים באמצעות זרימה מבוסס cytometry על ביטוי ההפרש של קטינים ו -35 CD24. פוטנציאל ההתקדמות הגדולה ביותר בביולוגיה ISC ההבנה ותפקידם במחלה ייעשה באמצעות לשעבר vivo organoid מערכת תרבות 36. מערכת זו מאפשרת ISCs הנורמלי וממאירים לתרבות ב3D, שבו הם לשכפל ולהבדיל באופן יותר רלוונטי מבחינה פיזיולוגית. יש לקוות כי אלה יאפשר בדיקה ישירה של תרופות על דגימות מטופל במבחנה, סוללים את הדרך לרפואה מותאמת אישית 37.

משטח luminal של מעי היונקים תכונות חוזר יחידות של מאורות ואצבע כמו תחזיות, כינה villi, שבולט לתוך הלום. משטח זה הוא גיליון רציף של epithelia שעובר התחדשות עצמית מלאה כל 3 כ - 4 ימים 1. רקמה דינמית זו נתמכת על ידי אוכלוסייה במהירות רכיבה על אופניים בתאי גזע (ISCs; הידוע גם בבסיס קריפטה תאי עמודים), אשר בתחילה זוהו על ידי הביטוי שלהם של גן Lgr5 2,3. תאים אלה קיימים בנישה מיוחדת בתחתית מאורות של Lieberkuhn. בתחילה, הגילוי שהיה רכיבה על אופניים במהירות ISCs היה צורם עם הרעיון הרווח שתאי גזע היו שקטים בטבע. קודם לזיהוי Lgr5 + ISC הוא הניח שאוכלוסייה של תווית שקטה שמירת תאים בעמדה 4, ביחס לבסיס של קריפטה, היו ISCs 1. h המחקר אחרוןכמו עכשיו השלים תצפיות אלה על ידי הוכחה כי בעיקר יש בריכה של רכיבה על אופניים equipotent ISCs בכל כוך שגורלם מוסדרים על ידי שכנותיה 4,5. במקרה שהם איבדו יכולים להיות מוחלפים על ידי תאים אלה שקטים שבדרך מחויבים לשושלת ההפרשה אך יכול לחזור לISCs אם אוכלוסיית ISC פגומה 6. שכנים ISC יכולים להיות או ISCs או תאי הבת שלהם. ISCs לייצר תאי בת נאיביים שרבו ולהתמיין לסוגי תאים מיוחדים המרכיבים את גיליון אפיתל שקווי לומן מעי 1. הגביע, enteroendocrine, enterocytes, ציצה ותאי M להעביר כלפי מעלה אל פני השטח luminal שבו הם מספקים פונקציות הקליטה ורגולטורים שונות, לעומת זאת, תאי פנט יישארו בתחתית הכוך שבו הם קיימים התערבבו עם ISCs. בשנים האחרונות זה כבר הוכיח כי חלקם של daught הנאיבי<html> תאים אה מיועדים לשושלת הפרשה הם תווית שקטה שמירת תאי Lgr5 lo מסוגלים חוזר לISC על פציעת 6,7. בשל חשיבותו בהתחדשות קריפטה עדיפות הונחה על הבנת יחסי הגומלין בין ISCs ושכנותיה, במיוחד תאי פנט. תאי פנט לשחק תפקיד מכריע בנישה שתומכת ISCs 8. בנוסף למוצרי bactericidal תאי פנט לייצר מולקולות איתות המפעילות את המסלולים המסדירים חידוש ISC או בידול. מחקרים קודמים הראו כי Lgr5 + ISCs יכול להתקיים רק כאשר הם יכולים להתחרות על אותות נישה חיוניים הניתנים על ידי תאי פנט בתם 8. מחקרים אלו בדקו את התפקיד של תאי פנט על Lgr5 הרגיל + ISCs ולא במצב שבו הם פגומים ודורשים חידוש מאוכלוסיית Lgr5 lo. class = &quot;jove_content&quot;&gt; כדי להבין מחלה ביולוגיה ומודל מעיים אנו בוחנים את התפקיד הפונקציונלי של תאים ו / או גנים באמצעות מודלים עכבר מהונדסים 9,10. לעתים קרובות מודלים אלה לנצל את טכנולוגית cre-לקס לשנות גן (ים) 9,10 תנאי. Cre (גורם רקומבינציה) recombinase הוא recombinase אתר ספציפי של משפחת אינטגראז, מבודד מP1 bacteriophage. Cre catalyses רקומבינציה הספציפית אתר בין BP המוגדר 34 &#39; לקס P &#39;(χ מוקד P1 מוצלב) אתרים. עכברים מהונדסים גנטית להכיל אתרי LoxP כי האגף אזורים של עניין שעל ביטוי של recombinase Cre הם נכרת. קישור הביטוי של גן Cre לתא או אמרגן ספציפי התפתחותי מאפשר שינוי להתבצע בצורה מרחבית 9,10, זה שימושי במיוחד בהתגברות על מוטציות קטלניות עובריות. נוסף המקשר את ביטוי Cre למסלול קולט,כי יכול להיות מופעל באופן מלאכותי, מאפשר שינויים זמניים. שימוש בטכנולוגיה זו אנו מומת גן CatnB 11 בepithelia המעיים. β-קטנין, מוצר גן CatnB, הוא רגולטור מרכזי של מסלול איתות Wnt הקנונית אשר מסדיר הומאוסטזיס ISC. שני מחקרים קודמים באמצעות אסטרטגיה זו הניבו תוצאות סותרות 12,13. המחקר על ידי Fevr et al. 12, הפגין אובדן של תאי גזע והומאוסטזיס מעיים. ואילו אירלנד et al. 14 מחקר דיווח כי בעקבות ירידה בכדאיויות תא הציר קריפטה-סיסי היה אוכלס מחדש מהתאים מהסוג בר להביע CatnB. ההבדל העיקרי במחקרים אלה היה האמרגן משמש להביע Cre בepithelia המעיים. Et al Fevr., מחקר השתמש אמרגן גן villin הצמוד לקולטן אסטרוגן שיכול להיות מופעל על ידי מתן tamoxifen (T2 ויל-Cre-ER) 15,16. בניגוד אירלנד et al., ניצלה את אלמנט האמרגן של גן P450A1 ציטוכרום החולדה (CYP1A1) לנהוג ביטוי Cre בתגובה לβ-naphthoflavone xenobiotic (אה-Cre). המאפיינים של המערכות השונות הללו נוצרו שתי השערות לחשבון לתצפיות שונות אלה. הראשון שCatnB נמחק בצורה יעילה יותר בISC באמצעות מערכת T2 ויל-Cre-ER לעומת אה-cre, ובכך להפחית את מספר ISCs לרמות תת-אכלוס. לחלופין היה זה בשל דיפרנציאלי מחיקת CatnB באוכלוסיית התאים המובחן. מטרות מערכת T2 ויל-Cre-ER כל תאי האפיתל של הכוך וסיסי ואילו מערכת אה-Cre מטרות רק תאים-פנט שאינו של הנישה ISC וקריפטה. מערכות אלה סיפקו כלים אידיאליים לבחינת behavIOR של ISCs והאינטראקציה שלהם עם תאי פנט. כאן אנו מציגים כמה פרוטוקולים מפורטים המבוססים על אופן בו אנו משמשים מערכות אלה כדי לקבוע שתאי פנט לשחק תפקיד מכריע בתיווך תגובת המעיים לפציעה 17.

<table><tbody><tr><td>חוצץ אצטט</td><td>*</td><td>*</td><td>להכנת 100 מ"ל: 4.8 מ"ל 0.2 M חומצה אצטית, 45.2 מ"ל 0.2 M נתרן אצטט ו-50 מ"ל מים מזוקקים</td></tr><tr><td>חומצה אצטית</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>C/0400/PB17</td><td></td></tr><tr><td>אנהידריד אצטי</td><td>סיגמא</td><td>A6404</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת אנהידריד אצטית</td><td>*</td><td>*</td><td>2 M אנהידריד אצטי ב-0.1 M טריאתנולאמין הידרוכלוריד</td></tr><tr><td>כחול אלציאן</td><td>Sigma</td><td>A5268</td><td></td></tr><tr><td>Alcian Blue pH 2.5</td><td>*</td><td>*</td><td>להכנת 500 מ"ל: 15 מ"ל חומצה אצטית, 5 גרם Alcian Blue ו-485 מ"ל מים מזוקקים</td></tr><tr><td>נוגדן מצומד אנטי-דיגוקסיגנין אלקליין פוספטאז</td><td>Abcam</td><td>ab119345</td><td></td></tr><tr><td>B(בטא)-נפתאופלבון</td><td>סיגמא</td><td>N3633</td><td>BNF, להזריק מבלי לאפשר לתמיסה להתקרר יותר מדי מכיוון שהתרכובת תיפול מהתמיסה. ניתן לעשות שימוש חוזר בפתרון &ndash; יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; C בין השימושים, אין לחמם יותר מפעמיים.</td></tr><tr><td>Bloxall</td><td>Vector Labs</td><td>SP-6000</td><td></td></tr><tr><td>BM</td><td>סגול Roche</td><td>11442074001</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A4503</td><td>אלבומין סרום בקר</td></tr><tr><td>כלורופורם</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>C/4920/17</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת חשיפת מאגר ציטראט/אנטיגן</td><td>וקטור מעבדות</td><td>H-3300</td><td></td></tr><tr><td>שמן תירס</td><td>סיגמא</td><td>C8627</td><td></td></tr><tr><td>תמיסה מטשטת</td><td>*</td><td>*</td><td>עבור 500 מ"ל: 50 מ"ל גליצרול, 50 מ"ל Tris 0.1M pH8.8, 100 מ"ל EtOH, 300 מ"ל מי מלח (0.9% NaCl במים), DTT 1.7 גרם&nbsp; ניתן להכין מראש תמיסת חינוך ולאחסן, אך יש להוסיף DTT שולוד ממש לפני הדגירה (340 מ"ג/100 מ"ל).</td></tr><tr><td>מים מטופלים DEPC</td><td>Life Technologies</td><td>750023</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>101509944</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>O3690</td><td>0.5M</td></tr><tr><td>אתנול</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>E/0650DF/17</td><td></td></tr><tr><td>נייר סינון</td><td>Whatman</td><td>3000917</td><td></td></tr><tr><td>פורמלדהיד</td><td>סיגמא</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>פורמלין&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>SLBL11382V</td><td>פורמלין פורממיד ניטרלי חומצי</td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>F5786</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehye</td><td>Sigma</td><td>G6257</td><td></td></tr><tr><td>H2O2</td><td>Sigma</td><td>216763</td><td></td></tr><tr><td>Haematoxylin</td><td>Raymond A Lamb</td><td>12698616</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14175-053</td><td>HBSS (-MgCl2+; -CaCl2)</td></tr> <tr><td>מאגר הכלאה</td><td>*</td><td>*</td><td>&nbsp; 5 ופעמים; SSC, 50% פורממיד, 5% SDS, 1 מ"ג/מ"ל הפרין, 1 מ"ג/מ"ל כבד עגל tRNA</td></tr><tr><td>הידרוקינון</td><td>סיגמא</td><td>H9003</td><td></td></tr><tr><td>ImmPACT DAB Peroxidase</td><td>Vector Labs</td><td>SK-4105</td><td></td></tr><tr><td>Immpress HRP Anti-Mouse IgG Kit</td><td>Vector Labs</td><td>MP-7402</td><td></td></tr><tr><td>Immpress HRP Anti-Rabbit IgG Kit</td><td>Vector Labs</td><td>MP-7401</td><td></td></tr><tr><td>אבקת רקמת מעיים</td><td>*</td><td>*</td><td>המעי הדק של 5 עכברים בוגרים שולבו והומוגני בנפח המינימלי של PBS קר כקרח. 4 נפחים של אצטון קר כקרח נוספו למעי ההומוגני, שעורבב היטב והודגר על קרח למשך 30 דקות. זה היה צנטריפוגה והכדור נשטף באמצעות אצטון קר כקרח. זה עבר צנטריפוגה נוספת והכדור שנוצר התפשט על נייר סינון והניח לו להתייבש. לאחר ייבוש יסודי החומר נטחן לאבקה דקה באמצעות עלי וטיט.</td></tr><tr><td>K-ferricyanide</td><td>Sigma</td><td>P-3667</td><td></td></tr><tr><td>K-ferrocyanide</td><td>Sigma</td><td>P3289</td><td></td></tr><tr><td>Levamisole</td><td>Sigma</td><td>L0380000</td><td></td></tr><tr><td>Methacarn</td><td>*</td><td>*</td><td>60% מתנול: 30% כלורופורם: 10% חומצה אצטית</td></tr><tr><td>מתנול</td><td>Fisher Scientific</td><td>M/4000/17</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>סרום עיזים רגיל</td><td>Vector Labs</td><td>S-1012</td><td>NGS</td></tr><tr><td>סרום ארנב רגיל</td><td>Dako</td><td>X0902</td><td>NRS</td></tr><tr><td>NTMT</td><td>*</td><td>*</td><td>100 מ"מ NaCl, 100 מ"מ Tris HCl, 50 מ"מ MgCl2, 0.1% Tween20, 2 מ"מ Levamisole</td></tr><tr><td>PAP עט</td><td>וקטור</td><td>H-400</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>PBT</td><td>*</td><td>*</td><td>0.5 מ' NaCl, 10 מ"מ TrisHCL pH7.5, 0.1% טווין 20</td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>גיבקו</td><td>15140-122</td><td>100x סולוטיון.</td></tr><tr><td>תמיסת מלח חוצצת פוספט (10x)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP3994</td><td>מדולל 1:10 עם מים מזוקקים להכנת</td></tr><tr><td>1x שקופיות PLL</td><td>Sigma</td><td>P0425-72EA</td><td>מיקרוסקופ פולי-L-ליזין שקופיות</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma</td><td>P2308</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase k Solution</td><td>*</td><td>*</td><td>מדלל פרוטאינאז K ב-200 ומיקרו; גרם/מ"ל ב-50 מ"מ Tris, 5 מ"מ EDTA.</td></tr>תמיסת הפחתת <tr><td>Ralwax</td><td>BDH</td><td>36154 7N</td><td></td></tr><tr><td></td><td>*</td><td>*</td><td>להכנת 100 מ"ל: 1 גרם הידרוקינון, 5 גרם נתרן סולפיט ו-100 מ"ל מים מזוקקים</td></tr><tr><td>RnaseA</td><td>Sigma</td><td>R6148</td><td></td></tr><tr><td>מי מלח</td><td>*</td><td>*</td><td>0.9% NaCl במים מזוקקים</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td><td>I3771</td><td></td></tr><tr><td>סרום כבשים</td><td>Sigma</td><td>S3772</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת כסף חנקתית</td><td>Sigma</td><td>S/1240/46</td><td></td></tr><tr><td>Silver</td><td>*</td><td>*</td><td>להכנת 100 מ"ל: 10 מ"ל חוצץ אצטט, 87 מ"ל מים מזוקקים, 3 מ"ל 1% כסף חנקתי</td></tr><tr><td>נתרן אצטט</td><td>Fisher Scientific</td><td>S/2120/53</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>Sigma</td><td>S6753</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>נתרן גופרתי</td><td>Sigma</td><td>239321</td><td></td></tr><tr><td>SSC</td><td>Sigma</td><td>93017</td><td>20x מלח נתרן ציטראט</td></tr><tr><td>סרט כירורגי</td><td>Fisher Scientific</td><td>12960495</td><td></td></tr><tr><td>Tamoxifen</td><td>Sigma</td><td>T5648</td><td>TAM, להזריק מבלי לאפשר לתמיסה להתקרר יותר מדי מכיוון שהתרכובת תיפול מהתמיסה. ניתן לעשות שימוש חוזר בפתרון &ndash; יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; C בין השימושים, אין לחמם יותר מפעמיים.</td></tr><tr><td>TBS/T</td><td>איתות תאים</td> <td>#9997</td><td></td></tr><tr><td>Triethanolamine hydrochloride</td><td>Sigma</td><td>T1502</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCL</td><td>Invitrogen</td><td>15567-027</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Sigma</td><td>TP9416</td><td></td></tr><tr><td>VectaMount</td><td>Vector Labs</td><td>H-5000</td><td></td></tr><tr><td>VectaShield הרכבה קשיח בינוני עם DAPI</td><td>Vector Labs</td><td>H-1500</td><td></td></tr><tr><td>Vectastain ABC Kit</td><td>Vector Labs</td><td>PK-4001</td><td></td></tr><tr><td>X-gal</td><td>Promega</td><td>V3941</td><td></td></tr><tr><td>X-gal fixative</td><td>*</td><td>*</td><td>2% פורמלדהיד, 0.1% גלוטראלדהיד בצבע 1x PBS</td></tr><tr><td>X-gal</td><td>*</td><td>**</td><td>כתם X-gal; 200 &#956; l X-gal (A) בתמיסה B של 50 מ"ל (0.214 גרם MgCl2, 0.48 גרם K-ferricyanide, 0.734 גרם K-ferrocyanide ב-500 מ"ל PBS).&nbsp; ניתן להמציא את פתרון ב' מראש ולאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C</td></tr><tr><td>קסילן</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>X/0200/21</td><td></td></tr></tbody></table>

פרוטוקולים לניתוח תפקידם של תאי פנט התחדשות murine המעי באמצעות מותנה<em&gt; cre-לקס</em&gt; מודלי עכבר

Protocols for Analyzing the Role of Paneth Cells in Regenerating the Murine Intestine using Conditional Cre-lox Mouse Models

משטח אפיתל במעי היונקים הוא רקמה דינמית שמחדשת כל 3-7 ימים. הבנת תהליך התחדשות זו זיהתה אוכלוסייה של מהירות רכיבה על אופניים תאי גזע מעיים (ISCs) מאופיינים בביטוים של גני Lgr5. אלה נתמכים על ידי אוכלוסייה שקטה תאי גזע, מסומנת על ידי ביטוי BMI-1, מסוגל להחליף אותם במקרה של פציעה. חוקר את יחסי הגומלין בין האוכלוסיות אלה הוא חיוני להבנת תפקידם במחלות וסרטן. ISCs קיימת בתוך מאורות על פני השטח המעיים, נישות אלה תומכים בISC בחידוש epithelia. האינטראקציה בין ISCs הפעיל והשקט סבירה כרוכה תאים מובחנים אחרים בתוך הנישה, כפי שכבר בעבר הוכיח כי &#39;&#39; stemness &#39;&#39; של ISC Lgr5 קשור באופן הדוק לנוכחות של תאי פנט השכנים. שימוש בעכבר cre-לקס מותנהדגמים שבדקו את ההשפעה של מחיקה רוב ISCs הפעיל בנוכחות או עדר של תאי פנט. כאן אנו מתארים את הטכניקות והניתוח התחייבו מאפיין את המעי ולהוכיח שתאי פנט לשחק תפקיד מכריע בתוך הנישה ISC בסיוע ההתאוששות הבאה עלבון משמעותי.

תאי אפיתל במעי גזע (ISCs) מתערבבים עם תאי פנט. תאים אלה נבדלים צאצאים של ISC, התומך בISCs ולספק הגנה אנטי-בקטריאלי. כאן אנו מדגימים כיצד אנו השתמשנו במודלי עכבר מהונדסים מותנים לקבוע כי תאי פנט לשחק תפקיד מכריע בשמירה על epithelia המעיים.

פרוטוקולים לניתוח תפקידם של תאי פנט התחדשות Murine המעי באמצעות מותנה<em&gt; Cre-לקס</em&gt; מודלי עכבר

The epithelial surface of the mammalian intestine is a dynamic tissue that renews every 3 - 7 days. Understanding this renewal process identified a ...

המטרה הכללית של הליך נתיחה זה היא להדגים כיצד לבודד ולהכין את מעי העכבר עבור טכניקות אפיון המשך. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לחקור את יכולתם של תאי הגזע של המעי לאכלס מחדש את המעי בעקבות הליך ניסויי. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן להשתמש בה לאחר כל טכניקה, הליך או מניפולציה גנטית באמצעות טכנולוגיית cray locks. התחילו בהנחת עכבר בוגר שהורדם במצב שכיבה על הגב (supine) ובהרטבת הפרווה ב-70% ethanol.לאחר מכן, באמצעות מספריים, פתחו את חלל הפריטונאום (החלל התוך-περιטונאלי) לאורכו לאורך קו האמצע וקבעו את הקיבה באמצעות פינצטה. לאחר מכן, נתקו את החיבור לוואסגגס ומשכו בעדינות את הקיבה כדי להסיר את המעי הדק עד לתהודה. לאחר מכן, משכו בעדינות את התהודה כדי להסיר את המעי הגס עד לפיקטום.לאחר בידוד המעיים, הסירו את הקיבה שבנספח והשתמשו במזרק המצויד בקצה פיפטה קהה כדי לשטוף את המעיים ב-PBS. מיד לאחר השטיפה, חתכו את המעי לשלושה קטעים שווים בגודלם: פרוksিমלי, מרכזי ודיסטלי. לאחר מכן, חתכו כל קטע לחתיכות של סנטימטר אחד והניחו שלוש עד חמש פיסות רקמה במרכז חתיכה של סרט דביק כירורגי בגודל שני על שני סנטימטרים. כאשר כל הרקמות הוצמדו במבנה פירמידה, אטמו את הסרט סביב החתיכות לאורכן, כך שייווצרה ערימה דמוית בולי עץ.לאחר מכן, הניחו את הסרט בתוך כלי בעל תחתית שטוחה המכיל נוזל מקבע פורמלין ניטרלי ומסנן, בנפח הגדול פי 10 לפחות מנפח הרקמה, ואחסנו את הדגימות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס לפני השקיעה והחיתוך. לאחר הקיבוע, העבירו את הרקמה לכלי בעל תחתית שטוחה המכיל אתנול 70% בנפח הגדול פי 10 לפחות מנפח הרקמה, כדי לקבע את הרקמה ב-Metcon מיד לאחר השטיפה. חתכו את המעי לשלושה קטעים שווים בגודלם, כפי שהודגם כעת.לאחר מכן, הניחו כל מקטע זה לצד זה על פיסת נייר סינון בגודל 15 על 15 סנטימטר, והשתמשו במספרי קפיץ כדי לפתוח את המקטעים ב-FOSS לאחר שכל המקטעים פולחו. העבירו את נייר הסינון לתוך כלי זכוכית המכיל Metcon שהוכן טרי למשך 3 עד 24 שעות בטמפרטורת החדר. בסיום הקיבוע, השתמשו בפינצטה כדי להרים את קצהו של כל אחד מחלקי המעי אחד אחד, וגלגלו את הרקמות סביב הפינצטה ליצירת גלילי "Swiss rolls" אינדיבידואליים. אבטחו כל גליל על ידי פתיחה קלה של הפינצטה והחדרת מחט מדד 25 דרך הרקמה.לאחר מכן, העבירו את הרקמות הגלגול למכל בעל תחתית שטוחה המכיל נפח של לפחות 10 פעמים נפח הרקמות של פורמולה ניטרלית מחוייצת (neutral buffered formula) וחומר מקבע, למשך שעה אחת לפחות לפני העיבוד לוויזואליזציה של whole Mount של התפרצות הרקמה. שפכו שעווה גולמית מותכת מעורבבת עם שמן מינרלי לתוך צלח Petri של 15 סנטימטר. מיד לאחר שטיפת המעיים ב-PBS קר מאוד, שטפו את הרקמות עם 25 מיליליטר של מקבע ex cal קר מאוד.לאחר הקיבוע, חתוך את המעיים לשלושה עד חמישה קטעים שווים והנח כל קטע על אחת מלוחות השעווה המקוררות. 고בע את כל קצה כך שהקטעים יהיו מתוחים מעט, כאשר קווי הגריד (mesenteric lines) נמצאים בחלק העליון של הלוחות. גזור שאריות של גריד (mesentery) שביתר.לאחר מכן, השתמשו במספרי קפיץ כדי לחתוך את המעיים לאורכן, והדביקו אותם בסיכות ככל שהם נפתחים, עד שכל המקטעים יהיו דבוקים. לאחר שעה אחת לפחות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס, הצפו את הפלטות בכמות מספיקה של מקבע xal כדי לכסות את כל הרקמות. השתמשו בפיפטה של 25 מיליליטר או במזרק כדי להסיר את המקבע ושטפו את הרקמות פעם אחת עם 30 מיליליטר של PBS.לאחר מכן, כסו את החתכים ב-30 milliliters של תמיסת איחוד DTTD לדגירה של 30 עד 60 דקות בטמפרטורת החדר תוך כדי נענוע. בסיום הדגירה, הסירו את תמיסת הדה-איפיקציה באמצעות פיפטה או מזרק של 25 milliliter, והחדירו לרקמות 30 milliliters נוספים של PBS. לאחר מכן, השתמשו בפיפטה אחורית כדי להסיר את הריר יחד עם ה-PBS לאחר השטיפה.החליפו את ה-PBS ב-30 milliliters של xal לצביעה למשך לילה בטמפרטורת החדר, בחושך ובערבוב עדין על פלטפורמת נדנדה, עד למחרת בבוקר. אם הפלטים פיתחו גוון כחול-ירוק, החליפו את ה-xal ב-30 milliliters של PBS. לאחר שלוש דקות של ערבוב עדין, הכינו "גלילי שוויץ" (Swiss rolls) כפי שהודגם זה עתה, והניחו את הרקמות במיכל רחב פה בעובי שטוח המכיל מכשיר קיבוע מתאים בנפח הגדול פי 10 לפחות מנפח הרקמה, בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלסיוס למשך 24 שעות לפחות לפני הש embedding והחיתוך.באמצעות השימוש במדווח המותנה ROSA 26 R Laxy, ניתן להבחין ב-100% רקומבינציה שלושה ימים לאחר ההשראה במעי הדק, באמצעות DNA שהוצא מהתאים שעברו רקומבינציה. בדיקת QPCR עבור האללים שעברו רקומבינציה הראתה עלייה שאינה מובהקת ברקומבינציה בתוך מערכת ה-VI crease, שייתכן ונובעת מכך שרקומבינציה בתאי פנת (paneth cells) לא נצפתה. בשימוש במערכת ah crease עם המדווח laxy, שתי המערכות הראו גם הן אובדן מוחלט של תאים שעברו רקומבינציה שלושה ימים לאחר ההשראה.הנתונים על המיטוזה וגובה התאים בקריפטה העלתה כי מערכת ah H Cree יכלה להשתקם, ככל הנראה בשל אישוב מחדש על ידי תאי גזע של המעי שלא שולבו. בניגוד מוחלט לכך, מערכת villain Cree נכשלה בהשתקמות למרות ששמרה על תאי קריפטה אפיתליאליים. יתרה מכך, תאי הקריפטה בעכברי vi Cree Cantin B היו לא-פרוליפרטיביים והראו היעדר ביטוי של סמן תאי הגזע של המעי.EM ארבע. בניגוד לקריפטות בעכברי ah cre, באופן דומה, תאי PTH עברו אפו פטוזי לאחר מחיקת Caden b רק בתוך מערכת VI Cree. לאחר השליטה בטכניקה, ניתן להשלימה בתוך כ-10 דקות.חשוב לצמצם את העיכובים כדי למנוע דגרדציה של הרקמה. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה של אופן הסרת המעי מעכבר לצורך אנליזות המשך.

protocols-for-analyzing-role-paneth-cells-regenerating-murine

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

בסרטון זה, אנו מתארים הליך כירורגי ליצירת לולאת מעי גס פרוקסימלית של עכבר או קטע pcLoop ואחריו הזרקה intraluminal של סמנים פלואורסצנטיים לתוך קטע כדי לחקור את חדירות אפיתל המעי.

יצירת מודל לולאת מעי גס פרוקסימלי של עכבר: הליך כירורגי ליצירת לולאת מעי גס פרוקסימלית ומדידת חדירות המעי על ידי זיהוי סמנים פלואורסצנטיים בסרום לאחר הזרקה תוך לומינלית

זיהוי מדויק ומיקום של תאי אפיתל לאורך רירית רירית המעי חיוני להגדיר שושלות תאים שונות. הדמיה תקינה של רקמות מעי היא קריטית לזיהוי דפוסי ביטוי חלבון עם רזולוציה מקסימלית. מחקר זה נועד להתוות שיטות האופטימליות ותנאי רקמות מעי עכבר עיבוד.

טכניקה Swiss-מתגלגל משופר עבור הכנת רקמת המעי עבור immunohistochemical ו ניתוח Immunofluorescent

שקופים C. elegans המעי יכול לשמש"ויוו הרקמה תא" ללמוד apicobasal להן קרום ו לומן ברמה תא בודד, subcellular במהלך multicellular tubulogenesis. פרוטוקול זה מתאר כיצד לשלב תיוג סטנדרטי, אובדן-של-פונקציה גנטית/RNAi וגישות מיקרוסקופיים לנתח תהליכים אלה ברמה המולקולרית.

C. elegans המעי כמו המודל עבור המערכת לומן מורפוגנזה ו Vivo ב מקוטב ממברנה להן ברמה תא בודד: תיוג על ידי נוגדנים מכתים, ניתוח אובדן RNAi-של-פונקציה והדמיה

תא צורב מעיים תרבויות הוקם מתוך כל כוכים, ואינם מאפשרים הניתוח של התחדשות עצמית ובידול באופן ספציפי תא. פרוטוקול זה מתאר הכינון של גזע ממוינת (Lgr5+), נישה (Paneth) תאים, אשר להצמיח organoids תוך מתן אפשרות שינוי הביוכימי, גנטית מוקדמת שלהם, אנליזה פונקציונלית.

וזמינותו שיחזור תא צורב (אורה) לניתוח פונקציונלי של מעיים גזע ותאים נישה

תוך ניצול של מיקרוסקופ תוך-ויטאל, השיטה המוצגת כאן מאפשרת הדמיה בזמן אמת של שפיכת תאי אפיתל במעיים בבעלי חיים חיים. לכן, רירית מעיים מוכתמת topically (acriflavine ו rhodamineB-dextran) של עכברים מרדימים הוא תמונה עד רזולוציה של תא יחיד באמצעות מיקרוסקופית confocal.

גישה תוך-ויטאלית המבוססת על מיקרוסקופיה להערכת חמלה במעיים וביצועי שפיכת תאים אפיתל

תפקוד מחסום אפיתל מעיים Dysregulated ותגובות חיסוניות הם סימני היכר של מחלות מעי דלקתיות שנותרו נחקרות בצורה גרועה בשל מחסור במודלים פיזיולוגיים. כאן, אנו מתארים מודל לולאת מעיים של עכברים המעסיק מקטע מעיים בעל כלי דם וחיצוניים כדי לחקור חלחיליות רירית וגיוס לויקוציטים ב- vivo.

הערכה תפקודית של חלחיליות מעיים ונדידה טרנס-אפיתלית נויטרופילית בעכברים באמצעות מודל לולאת מעיים מתוקננת

בפרוטוקול זה, אנו מתארים כיצד ליצור מונוליירים אפיתל ראשוניים של אפיתל ישירות מקריפטות מעיים. אנו מספקים גישות ניסיוניות כדי ליצור monolayers confluent על מסננים חדירים, monolayers confluent לריפוי פצעי גירוד ומחקרים ביוכימיים, ו monolayers דליל ונוח לניתוח כשל חיסוני.

דור של מונוליירים אפיתל המעי הגס הראשי מורין מקריפטות מעיים

פרוטוקול זה מציע הוראות מפורטות לביסוס אורגנואידים של המעי הדק של מורין, בידוד תאי לימפואידים מולדים מסוג 1 מהלמינה פרופריה של המעי הדק מורין, והקמת תרביות משותפות תלת-ממדיות (3D) בין שני סוגי התאים כדי לחקור אינטראקציות דו-כיווניות בין תאי אפיתל במעי לבין תאי לימפואידים מולדים מסוג 1.

תרבית משותפת של אורגנואידים אפיתליאליים של המעי הדק של מורין עם תאי לימפה מולדים

מערכת העיכול היא אחד האיברים הרגישים ביותר לפגיעה בטיפולי סרטן רדיותרפיים. זוהי בו זמנית מערכת איברים עם אחת מיכולות ההתחדשות הגבוהות ביותר בעקבות עלבונות כאלה. הפרוטוקול המוצג מתאר שיטה יעילה לחקר יכולת ההתחדשות של אפיתל המעי.

התחדשות אפיתל המעי בתגובה לקרינה מייננת

כאן, אנו מציגים שיטה לקבלת תמונות של המעי על פצע המושרה בלייזר. על ידי חשיפת מעי העכבר ללייזר מולטיפוטון, אובדן של קריפט(ים) בודדים או מרובים מושרה באופן מקומי. על ידי הדמיה חוזרת ונשנית של האזור הפגוע במשך חודשים, נלכדת הדינמיקה בזמן אמת של התאוששות המעי.

אבלציה בלייזר ומיקרוסקופ תוך חיוני לחקר עיצוב מחדש של המעי

אנו מתארים פרוטוקול המפרט את הבידוד של קריפטים המעי הגס מורין לפיתוח קולונואידים תלת ממדיים. לאחר מכן ניתן להתמיין באופן סופני בין הקולונואידים המבוססים כדי לשקף את ההרכב התאי של אפיתל המארח לפני קבלת אתגר דלקתי או הפניה להקמת חד-שכבה אפיתליאלית.

חקר ההשפעות האפיתליאליות של דלקת מעיים במבחנה על קולונואידים מורינים מבוססים

למדו לבודד ולהכין מעי עכבר לניתוח תאי גזע אפיתליים ותאי פנת'. השיטה מאפשרת לחקור התחדשות אפיתל המעי ותפקיד תאי הפנת' בשמירה על שלמות המעי.

פרוטוקולים לניתוח תפקידם של תאי פנט התחדשות Murine המעי באמצעות מותנה

גלה סרטונים נוספים