פרוטוקולים לניתוח תפקידם של תאי פנט התחדשות Murine המעי באמצעות מותנה Cre-לקס מודלי עכבר
21 בנובמבר 2015
תאי אפיתל במעי גזע (ISCs) מתערבבים עם תאי פנט. תאים אלה נבדלים צאצאים של ISC, התומך בISCs ולספק הגנה אנטי-בקטריאלי. כאן אנו מדגימים כיצד אנו השתמשנו במודלי עכבר מהונדסים מותנים לקבוע כי תאי פנט לשחק תפקיד מכריע בשמירה על epithelia המעיים.
המטרה הכוללת של הליך דיסקציה זה היא להדגים כיצד לבודד ולהכין את מעי העכבר לטכניקות האפיון הבאות. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לחקור את יכולתם של תאי גזע במעי לאכלס מחדש את המעי לאחר הליך ניסיוני. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן להשתמש בה בכל טכניקה או כל הליך או לאחר מניפולציה גנטית שימוש בטכנולוגיית מנעולי קריי התחל בהנחת עכבר בוגר שעבר המתת חסד במצב שכיבה והרטבת הפרווה באתנול 70%.
לאחר מכן בעזרת מספריים, פתח את החלל התוך-צפקי לאורך קו האמצע ואבטח את הבטן בעזרת מלקחיים. לאחר מכן, נתקו את החיבור לוושט ומשכו בעדינות את הקיבה כדי להסיר את המעי הדק עד לתוספתן. לאחר מכן משוך בעדינות את התוספתן כדי להסיר את המעי הגס עד פי הטבעת.
לאחר בידוד המעיים, הסר את הקיבה בתוספתן והשתמש במזרק המצויד בקצה פיפטה קהה כדי לשטוף את המעיים עם PBS מיד לאחר השטיפה, חתוך את המעי לשלושה חלקים שווים בגודלם, פרוקסימלי, אמצעי ודיסטלי. לאחר מכן חותכים כל חלק לחתיכות של סנטימטר אחד ומניחים שלושה עד חמישה שברים של הרקמה על אמצע פיסת סרט כירורגי בגודל שניים על שני סנטימטרים. בתצורת פירמידה, כאשר כל הרקמות מחוברות, אטמו את הסרט סביב החלקים לאורך ויוצרים ערימת בולי עץ.
לאחר מכן הנח את הסרט בכלי קיבול עם תחתית שטוחה המכיל לפחות פי 10 מנפח ניטרלי, חוצץ, פורמלי ומקבע לנפח הרקמה, ואחסן את הדגימות בארבע מעלות צלזיוס לפני ההטבעה והחתך. לאחר הקיבוע, העבירו את הרקמה לכלי קיבול תחתון שטוח המכיל לפחות פי 10 מנפח 70% אתנול כנפח הרקמה כדי לקבע את הרקמה ב-Metcon מיד לאחר השטיפה. חותכים את המעי לשלושה חלקים שווים בגודל כפי שהודגם זה עתה.
לאחר מכן הניחו כל חלק זה לצד זה על פיסת נייר סינון בגודל 15 על 15 ס"מ והשתמשו במספריים קפיציים כדי לפתוח את החלקים ב-FOSS כאשר כל החלקים פוצלו. העבירו את נייר הסינון לכלי זכוכית המכיל מטקון טרי שהוכן למשך שלוש עד 24 שעות בטמפרטורת החדר בתום הקיבוע, השתמשו במלקחיים כדי לאסוף את הקצה של כל אחת מחתיכות המעי אחת בכל פעם, וסובבו את הרקמות סביב המלקחיים ליצירת גלילים שוויצריים בודדים. אבטח כל גליל על ידי פתיחה קלה של המלקחיים והחדרת מחט בגודל 25 דרך הרקמה.
לאחר מכן הנח את הרקמות המגולגלות לתוך כלי קיבול עם תחתית שטוחה המכיל לפחות פי 10 מהנפח של פורמולה ניטרלית מאגר וקיבוע כמו הרקמות למשך שעה אחת לפחות לפני העיבוד להדמיה רפויה של הרקמה כולה. יוצקים שעווה גולמית מותכת מעורבבת בשמן מינרלי לצלחות פטרי בגודל 15 סנטימטר. לאחר מכן, מיד לאחר שטיפת המעיים ב-PBS קר כקרח, יש לשטוף את הרקמות עם 25 מיליליטר של קיבוע קר כקרח.
לאחר הקיבוע, חותכים את המעיים לשלושה עד חמישה חלקים שווים ומניחים כל חלק על אחת מצלחות השעווה המצוננות. הצמד כל קצה כך שהחלקים יימתחו מעט עם הקווים המזנטרים בחלק העליון של הלוחות. חתוך כל מזנטריה עודפת.
לאחר מכן השתמש במספריים קפיציים כדי לחתוך את המעיים להצמדה לאורך כשהם נפתחים כאשר כל החלקים מוצמדים. הציפו את הצלחות במספיק קיבוע xal כדי לכסות את כל הרקמות לאחר שעה לפחות בארבע מעלות צלזיוס. השתמש בפיפטה של 25 מיליליטר או במזרק כדי להסיר את הקיבוע ולשטוף את הרקמות פעם אחת עם 30 מיליליטר PBS.
לאחר מכן מכסים את החלקים ב -30 מיליליטר של תמיסה מאחדת DTTD למשך 30 עד 60 דקות דגירה בטמפרטורת החדר עם נדנדה. בתום הדגירה, הסר את תמיסת האלוהות בעזרת פיפטה או מזרק של 25 מיליליטר, והציף את הרקמות בעוד 30 מיליליטר PBS. לאחר מכן השתמש בפיפטה אחורית כדי להסיר את הריר עם ה-PBS לאחר הכביסה.
החלף את ה- PBS ב -30 מיליליטר xal לכתם לילה בטמפרטורת החדר בחושך עם תסיסה עדינה על משטח נדנדה למחרת בבוקר. אם החלקים פיתחו כתם ירוק כחול, החלף את ה- xal ב -30 מיליליטר PBS. לאחר שלוש דקות של תסיסה עדינה, הכינו גלילים שוויצריים כפי שהודגם זה עתה והניחו את הרקמות בכלי קיבוע רחב עם תחתית שטוחה המכיל לפחות פי 10 מנפח הקיבוע המתאים מנפח הרקמה בארבע מעלות צלזיוס למשך 24 שעות לפחות לפני ההטבעה והחיתוך.
באמצעות ROSA 26 R Laxy Conditional Reporter, ניתן לצפות ברקומבינציה של 100% שלושה ימים לאחר האינדוקציה במעי הדק באמצעות DNA המופק מהעריסות המשולבות מחדש. QPCR עבור האללים המשולבים מחדש הראה עלייה לא משמעותית ברקומבינציה בתוך מערכת הקמטים VI, פוטנציאלית עקב הרקומבינציה בתאי פאנת' שלא נצפתה. באמצעות מערכת קמט ah באמצעות מדווח הרפיון, שתי המערכות הדגימו גם אובדן מוחלט של תאים משולבים מחדש שלושה ימים לאחר הזירוז.
נתוני הגובה התאי של המיטוזה והקריפטה K הצביעו על כך שמערכת ah H Cree יכולה להתאושש ככל הנראה עקב אכלוס מחדש על ידי תאי גזע מעיים לא משולבים. בניגוד גמור, הנבל קרי לא הצליח להתאושש למרות ששמר על תאי קריפטה אפיתליים. יתר על כן, תאי הקריפטה בעכברי vi Cree Cantin B לא היו מתרבים וחסרו ביטוי של סמן תאי הגזע במעי.
EM ארבע. בניגוד לקריפטות בעכברי ה-ah cre באופן דומה, תאי PTH עברו אפופטוזיס לאחר מחיקת Caden b רק בתוך מערכת VI Cree. לאחר השליטה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך כ-10 דקות.
חשוב למזער את העיכובים כדי למנוע הידרדרות רקמות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להסיר את המעי מעכבר לצורך ניתוח במורד הזרם.
סקירה כללית
מאמר זה דן בבידוד ובהכנת מעי עכבר לצורך טכניקות של אפיון, תוך התמקדות בתאי גזע של אפיתל המעי (ISCs) ובאינטראקציה שלהם עם תאי פנת'. המחקר מדגיש את חשיבותם של תאי פנת' בשמירה על אפיתל המעי ואת המתודולוגיה לחקירת התאווררות של ISCs.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של תאי גזע
- גסטרואנטרולוגיה
רקע
- תאי גזע אפיתליאליים של המעי (ISCs) חיוניים לתחזוקת המעי.
- תאי פנת (Paneth cells) תומכים בתאי ה-ISCs ומספקים הגנה אנטי-בקטריאלית.
- הבנת תפקידיהם עשויה לסייע לרפואה רגנרטיבית ולבריאות מערכת העיכול.
- מודלים של עכברים טרנסגניים משמשים לחקר אינטראקציות אלו.
מטרת המחקר
- לבידוד והכנה של מעי עכבר עבור אנליזות המשך.
- לבחינת היכולת של תאי גזע של המעי (ISCs) לאכלס מחדש את המעי.
- להדגמת תפקידם של תאי פנתי (Paneth cells) בבריאות המעי.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- ניתוח של מעי עכבר באמצעות פרוצדורה סטנדרטית.
- שטיפה של המעיים ב-PBS וקיבוע בפורמלין.
- טמינה וחיתוך של הרקמה לצורך אנליזה.
- שימוש במערכות רב-דוחיות מותנות (conditional reporter systems) לצפייה ברקומינציה ב-ISCs.
תוצאות עיקריות
- בידוד מוצלח של רקמות מעי לצורך אנליזה.
- הוכחת התפקיד המכריע של תאי Paneth בשמירה על שלמות המעי.
- תצפית על הבדלים בהתאוששות של אוכלוסיות ISC בהתבסס על מניפולציה גנטית.
- זיהוי אפופטוזיס בתאי Paneth תחת תנאים ספציפיים.
מסקנות
- השיטה מאפשרת מחקר יעיל של תאי גזע של המעי.
- תאי פנת (Paneth cells) חיוניים לתחזוקת תאי גזע של המעי ולבריאות המעי.
- מחקר נוסף יכול להשיל אור על מנגנונים של רגנרציה של המעי.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך ניהולי
הבנת השילוב הדינמי בין תאי גזע מעיים לבין מרכיבי הנישה שלהם, כגון תאי Paneth, היא קריטית להפחתת הסיכונים באסטרטגיות של רפואה רגנרטיבית. מערכת מודל זו מאפשרת בחינה מכניסטית של התלות בין תאי הגזע לנישה, ובכך תומכת בתיקוף של מטרות בפתופיזיולוגיה של מערכת העיכול. תובנות ממניפולציה מותנית של Cre-lox מספקות ביטחון חיזוי בגישות טיפוליות השואפות להגביר את תיקון הרקמות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן תלויות תפקודיות בין תאי גזע לתאים תומכי-נישה, כגון תאי פנאת (Paneth cells).
- ערך תפעולי: מאפשר דליציה גנטית (genetic ablation) של אוכלוסיות תאים ספציפיות כדי להעריך את נחיצות הנישה.
- ערך אסטרטגי: תומך בהפחתת סיכונים של מטרות טיפוליות על ידי הבהרת הדרישות התאיות לרגנרציה המתווכת על ידי תאי גזע.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מספק זרימת עבודה סטנדרטית להכנת רקמה לצורך אנליזה היסטולוגית ומולקולרית בהמשך.
- ערך תפעולי: מבטיח בידוד וקיבוע הדירים של מקטעי מעי לצביעה ודימיון עקביים.
- ערך אסטרטגי: מאפשר השגת דגימות מוכנות לבדיקה לצורך הערכת התאוששות תאי גזע ושלמות הנישה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: ממדל רגנרציה המושרית על ידי פגיעה ובחן את הצורך בתאי Paneth עבור התאוששות של תאי גזע.
- ערך תפעולי: משתמש במערכות גנטיות מותנות כדי לשלוט באופן זמני במחיקת גנים בשושלות תאים ספציפיות.
- ערך אסטרטגי: מאפשר הערכה פרה-קלינית של טיפולים המכוונים לנישה עבור תיקון רירית.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline & Workflow Integration)
השיטה תומכת בביולוגיה של גילוי על ידי מתן אפשרות למחיקה מותנית של גנים באוכלוסיות של תאי גזע או בנישות, במטרה לבחון את יכולת ההתחדשות.
- ביולוגיה של גילוי: מאפשרת בחינה של השערות לגבי אינטראקציות בין תאי גזע לנישה באמצעות דרייברים של Cre ספציפיים לשושלת.
- סריקה: מייצרת חתכי רקמה מקובעים המתאימים לאימונוהיסטוכימיה ולניתוח מורפומטרי של דינמיקת הקריפטות.
- אנליטיקה: מאפשרת כימות של פעילות מיטוטית, גובה הקריפטה וביטוי של סממני תאי גזע לאחר פגיעה.
- מחקר תרגומי: מקשר בין תפקוד הנישה למודלים פרה-קליניים של התחדשות ושיקום של המעי.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה ניתנת לשימוש חוזר לחקר תלויות של תאי גזע במודלים של מחלות שונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית בבקרת תאי גזע על ידי בידוד תרומותיהם של משתני הנישה.
- ערך תפעולי: מתקנן את הדיסקציה והקיבוע של המעי לצורך הדירות (reproducibility) רב-אתרית.
- ערך אסטרטגי: מספק בסיס להחלטות המשך (go/no-go) בתוכניות רגנרטיביות על ידי תיקוף נחיצותם של תאי המטרה.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בהשקעה מותאמת סיכונים בטיפולים למודולציית נישה על בסיס ראיות מכניסטיות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בגנטיקה של עכברים, במערכות Cre-lox מותנות ובדיסקציה של מעי.
- תלוי בגישה לדיווחים פלואורסצנטיים (fluorescent reporters), לתשתיות קיבוע ולציוד לחיתוך דגימות.
- מחייב סטנדרטיזציה בין צוותים עבור כיוון הרקמה, פרוטוקולי צביעה והדמיה.
- שיקולי התאמה כוללים ספציפיות משתנה של דריבר Cre ויעילות רקומבינציה שונה באזורי המעי השונים.
- מגבלות מעשיות כוללות שונות בחדירות (penetrance) של Cre ומנגנוני פיצוי פוטנציאליים במודלים של אבלציה של נישה.
