שיטה פשוטה למיצוי שלב המוצק האוטומטי של דגימות מים לניתוח החיסוני של מזהמים קטנים
1 בינואר 2016
מוצג פרוטוקול למיצוי וריכוז מראש של אסטרדיול מדגימות מים באמצעות מערכת אוטומטית וממוזערת.
המטרה הכללית של שיטת הכנת דגימה זו היא ריכוז מוקדם של מזהמים אורגניים קטנים מדגימות מים, באופן ידידותי למשתמש, חסכוני ואוטומטי. שיטה זו יכולה להחליף תהליכי SPE סטנדרטיים בעת חקר זיהום של דגימות מים באמצעות שיטות זיהוי אימונולוגי, כגון בדיקות אימונו-סריי (immunoassays) בלוחית בארות או חיישנים ביולוגיים (biosensors). היתרונות המרכזיים של טכניקה זו הם שפעולת ה-SPE היא אוטומטית, בעוד ששטח הפנים והעלות של המכשירים נמוכים בהשוואה לגישות מסורתיות.
בנוסף, ביצועי תהליך ההעשרה תואמים את דרישות הניתוח של בדיקות אימונו-סמיות (immunoassays), הן מבחינת תכולת ממס נמוכה והן מבחינת יעילות הריכוז המוקדם. ראשית, סננו דגימת מים בנפח 100 millimeter באמצעות מסנן בעובי נקבוביות של 0.2 micrometer. העבירו את הדגימה המסוננת לבקבוק זכוכית עם הברגת GL 45.
הכינו 300 microliters של אלואנט על ידי דילול של methanol במים דה-יוניים, לריכוז של 50 אחוזי נפח בתוך מבחנה אטומה. לאחר מכן, הכינו תרחיף של 20 milligram per milliliter של חלקיקי סורבנט מסוג octadecyl silica על ידי הוספת 1,600 microliters של methanol ולאחריו 400 microliters של מים דה-יוניים ל-40 milligrams של סורבנט פאזה הפוכה בתוך בקבוק זכוכית. סגרו את המכסה היטב, וערבבו באמצעות מערבל וורטקס.
הניחו ממברנת ניילון עם גודל נקבים של 11 micrometers על שכבה כפולה של נייר סופג נטול אבק. חללו שני חלקים קטנים בממברנה באמצעות מחלץ בקוטר של 3 millimeter. לאחר מכן, אחזו באחת הממברנות הקטנות בעזרת פינצטה שטוחה למסננים, והניחו אותה בצד אחד של העמודה.
לאחר מכן, הברגו את מחבר התחתית השטוחה אל הצינור והדקו אותו. לאחר מכן, שרטטו חץ על גוף העמודה, המצביע לכיוון הקצה שבו הוצבה הממברנה. בשלב זה, קבעו את העמודה על התושבת כאשר החץ מצביע כלפי מטה.
חברו מזרק חד-פעמי ריק של 10 milliliter לקצה צינור העמודה באמצעות מחברי הנעילה התחתונים. ערבבו את תרחיף הסורבנט בעזרת מיקסר וורטקס, והעבירו במהירות 100 microliters למרכז העמודה באמצעות פיפטה. בזמן ההזרקה, שאבו בעדינות את התמיסה מהפיפטה דרך הממברנה בעזרת המזרק ביד השנייה.
הכנת עמודת ה-SPE היא חשובה מאוד. עליך לוודא שאתה שואב את התמיסה כראוי דרך הממברנה באמצעות המזרק תוך כדי הזרקת תרחיף החלקיקים לעמודה. אחרת, החלקיקים לא ייארזו בצפיפות.
חזור על התהליך הקודם פעמיים נוספות, תוך ערבוב של תמיסת המלאי בין כל שלבי הפיפטור, כדי להבטיח סספנסיה הומוגנית של החלקיקים בתמיסה. לאחר שכל הסספנסיה הועמסה והובשה באמצעות שאיבה במזרק, השאר את המזרק במקומו והנח את ממברנת הניילון השנייה מעל, בעזרת פינצטה ביד השנייה. לאחר מכן, הברג את המחבר השני עם צינור והשלך את המזרק.
בשלב זה, הדק את העמודה על מכשיר ה-SPE באמצעות מחברי הנעילה התחתונים. חבר את הבקבוק המכיל את הדגימה למכשיר על ידי הברגת מכסה הבטיחות GL 45 המצורף עליו. טען 200 µL של אלואנט (eluent) למאגר האלואנט.
לאחר מכן, טענו 800 µL של מים דה-יוניים למאגר הדילול. ודאו שווסת הלחץ נמצא במצב סגור על ידי סיבובו נגד כיוון השעון עד שלא ניתן להניעו יותר. לאחר הפעלת האב-טיפוס, הזינו את הערכים 580 עבור pset ו-30 עבור delta pset.
כדי לכוונן את ווסת הלחץ, הפעילו את המשאבה. לאחר מכן, סובבו ידנית את ווסת הלחץ עד שהערך הנקרא עבור preg יהיה נמוך אך קרוב ל-320 millibar. לאחר עצירת המשאבה, התחילו את הליך ה-SPE על ידי לחיצה על start בפינת המצב האוטומטי.
עם סיום הליך ה-SPE, סגרו את מבחנת הדגימה הקטנה ואחסנו אותה בטמפרטורה של ארבע עד חמש מעלות Celsius בחושך, עד לביצוע ניתוח ELISA. כדי לנקות את המערכת, הכינו תמיסה של 10 milliliter של 70% methanol בנפח בבקבוק זכוכית עם הברגת GL 45. נתקו את עמודת ה-SPE, ואטמו את הצינורות באמצעות מחברים.
במצב האוטומטי, בחרו את קובץ הניקוי (Cleaning) והפעילו אותו עם אותן הגדרות לחץ ששימשו קודם ל-pset, delta pset ו-preg. השחזוריות של אריזת הסופח הוערכה על ידי ייבוש ושקילה של הסופח שהועבר בפיפטה למבחנות זכוכית. השחזוריות של זמן ההזרקה נבדקה עבור דגימות של 100 milliliter.
הריכוזים של הדגימות הראשוניות והדגימות המרוכזות שהוספו להן חומרים נקבעו באמצעות ערכת ELISA מסחרית של 17 beta-estradiol. מעקומות הכיול עולה בבירור כי יחס המתנול מהדגימה המועשרת אינו משפיע על הרגישות של הבדיקה האימונולוגית. שיעורי התשואה שחושבו היו 128, פלוס או מינוס 22%, עבור מים דה-יוניים ו-107 פלוס או מינוס 6% עבור מי ים מלאכותיים, בהתאמה.
במקום שבו השליטה בטכניקה כבר הושגה, ניתן לבצע את הכנת עמודת ה-SPE בפחות מחמש דקות, אם היא מבוצעת כראוי. את כל הליך ה-SPE ניתן להשלים בפחות משעה אחת. לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום מדעי הסביבה לחקור את פיתוחן של שיטות Immunodetection לניטור של מזהמים אורגניים קטנים.
לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן הכנת דגימות מים באמצעות המכשיר האוטומטי והחסכוני שלנו לניתוח מזהמים באמצעות בדיקות אימונו-סמיות (immunoassays). זכרו כי עבודה עם מזהמים אורגניים וממסים עלולה להיות מסוכנת, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון חבישת כפפות מתאימות והגנה על העיניים באמצעות משקפי מגן בעת ביצוע תהליך זה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול למיצוי ואריכה אוטומטית של estradiol מדגימות מים. השיטה נועדה להגביר את היעילות של חקר מזהמים אורגניים במים באמצעות טכניקות של זיהוי אימונולוגי.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי הסביבה
- כימיה אנליטית
- הערכת איכות המים
רקע
- שיטות מסורתיות של מיצוי פאזה מוצקה (SPE) עלולות להיות תובעניות מבחינת כוח אדם ויקרות.
- מערכות אוטומטיות יכולות לייעל את תהליך המיצוי.
- שיטות של זיהוי אימונולוגי דורשות הכנת דגימות יעילה לקבלת תוצאות מדויקות.
- תכולת ממס נמוכה היא קריטית עבור אנליזה סביבתית.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה חסכונית וידידותית למשתמש לריכוז מוקדם של estradiol מדגימות מים.
- אוטומציה של תהליך המיצוי להפחתת העבודה הידנית.
- שיפור היעילות של שיטות זיהוי אימונולוגי בניטור סביבתי.
שיטות שהשתמשו בהן
- סינון של דגימות מים באמצעות מסנן בעל גודל נקבים של 0.2 micrometer.
- שימוש בבקבוק זכוכית עם הברגת GL 45 לאחסון הדגימות.
- הטמעה של מערכת מיניאטורית אוטומטית לצורך מיצוי.
- השוואה בין השיטה החדשה לתהליכי SPE מסורתיים.
תוצאות עיקריות
- השיטה האוטומטית עומדת בדרישות הביצועים עבור בדיקות אימונו-סיי (immunoassays).
- הושג תכולת ממס נמוכה במהלך תהליך המיצוי.
- הטכניקה הדגימה יעילות ריכוז מקדים גבוהה.
- העלות ושטח המעמדות של המערכת היו נמוכים משמעותית מאשר בשיטות מסורתיות.
מסקנות
- שיטת המיצוי האוטומטית מהווה חלופה יעילה ל-SPE המסורתי.
- היא משפרת את ניתוח המזהמים האורגניים בדגימות מים.
- גישה זו יכולה לסייע בניטור סביבתי יעיל יותר.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מיצוי פאזה מוצקה (solid phase extraction) אוטומטי מאפשר ריכוז מוקדם יעיל של מזהמי אורגניים בעקבות מדגימי מים, ובכך תומך בתהליכי עבודה של זיהוי אימונולוגי במחקר רעילות סביבתית. השיטה מפחיתה את העבודה הידנית ואת תפיסת השטח של המכשור תוך שמירה על תאימות לזיהוי מבוסס ELISA, מה שמאפשר סריקה של מזהמים בתפוקה גבוהה יותר. גישה זו מסייעת בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי אספקת הכנה אמינה של דגימות עבור בדיקות רלוונטיות לסמנים ביולוגיים בהערכת בטיחות פרה-קלינית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של השפעות תרכובות משבשות אנדוקריניות על מסלולים הורמונליים באמצעות השבה של אנליט מטוהר.
- ערך תפעולי: תומך בהכנה שחזירה של דגימות לקבלת תוצאות עקביות של בדיקות אימונו-סיי (immunoassay) במחקרי מעורבות מטרה (target engagement).
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מספק דגימות מרוכזות מראש עם תכולת ממס נמוכה, ובכך שומר על רגישות הבדיקה האימונולוגית לזיהוי מולקולות קטנות.
- ערך תפעולי: מבצע אוטומציה של שלבי המיצוי, מה שמשפר את התפוקה ומפחית את השונות במסע סריקה של תרכובות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מספק מטריצות דגימה רלוונטיות למחלה לצורך הערכת השפעת מזהמים על ביטוי של סמנים ביולוגיים במודלים פרה-קליניים.
- ערך תפעולי: מאפשר תהליך עבודה סטנדרטי על פני סוגי דגימות מימיים, ובכך תומך ביכולת השוואה בין מחקרים בפארמקולוגיה של בטיחות.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
השיטה משתלבת בתהליכי גילוי מוקדמים באמצעות הכנת דגימות מבוססות מים לניתוח אימונולוגי, ובכך מגשרת בין דגימה סביבתית לבדיקות תיקוף של מטרות (target validation assays).
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בבדיקת השערות על אינטראקציות בין מזהמים לסמנים ביולוגיים באמצעות מיצוי נקי של האנליט.
- סריקה: מספקת תמציות מוכנות לבדיקה עם התאוששות עקבית, המאפשרת הערכה מהימנה של ספריית תרכובות.
- אנליטיקה: מייצרת תוצרים כמותיים מרוכזים התואמים לקריאות ELISA לצורך ניתוח השוואתי.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין מודלים של חשיפה סביבתית לניטור השפעות פרה-קליניות באמצעות הכנה סטנדרטית של הדגימות.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה לשימוש חוזר עבור מיצוי אוטומטי במגוון מטריצות של דגימות מימיות בסריקות רעילות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון חיזוי בתוצאות של בדיקות אימונו-סיי (immunoassay) באמצעות הסרה יעילה של הפרעות מטריצה והעשרה של האנליט.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה ושחזוריות באמצעות אריזה אוטומטית של עמודות ופרמטרים מבוקרים של אלוציה.
- ערך אסטרטגי: שיפור בקבלת החלטות של go/no-go בסינון רעילות מוקדם על ידי הפחתת תוצאות שליליות שגויות הנובעות ממיצוי לא יעיל.
- השפעה על הפורטפוליו: תיעדוף תרכובות מבוסס סיכון על בסיס זיהוי מהימן של מזהמים בריכוז נמוך במטריצות של מים.
שיקולי יישום
- מומחיות טכנית בתאימות של בדיקות אימונו-ספיי (immunoassay) ובעקרונות של מיצוי פאזה מוצקה (solid phase extraction).
- גישה למערכות אוטומטיות לטיפול בנוזלים המסוגלות לעבד דגימות בלחץ נמוך.
- סטנדרטיזציה של פרוטוקולי הכנת הסורבנט והאלוציה בין צוותי מעבדה.
- שיקולי התאמה לנפחי דגימה משתנים ומאפיינים פיזיקו-כימיים של מזהמים.
- מגבלות מעשיות כוללות שלבי הרכבה ידנית של עמודות לפני האוטומציה ודרישות תיקוף עבור זוגות אנליט-סורבנט חדשים.
