Air-שנדגמו ניתוח סינון עבור אנדוטוקסינים ותוכן DNA

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לתאר כיצד לנתח במדויק את תכולת האנדוטוקסין וה-DNA של חלקיקים הנישאים באוויר שנדגמו על מסננים. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח במחקר של אירוסולים ביולוגיים בחללים סגורים ובחוץ, כגון הבנת סיבות בריאותיות. את פרוצדורת הדגימה על המסנן ידגים ינון מזר, סטודנט לתואר מתקדם מהמעבדה שלי.

לדגימה בנפח גבוה, השתמשו במסננים העשויים מסיבי קוורץ. לחלופין, בחרו את סוג המסנן הספציפי ואת גודל נקבוביות הסינון המתאימים ביותר לצרכי המחקר. בצעו חימום מקדים (Prebake) למסננים המיועדים לדגימה של תרכובות אורגניות וביולוגיות, כאשר ראשית עטפו כל מסנן בנפרד בנייר אלומיניום.

לאחר מכן יש לאפות אותם בתנור מעבדה בטמפרטורה של 450 °C למשך חמש שעות לפחות. פעולה זו תסלק שאריות אורגניות קיימות. יש לאחסן את המסננים האופים בטמפרטורה של 20 °C עד למועד השימוש בהם לדגימה.

בשלב הבא, נקה וחטא את הדוגם לנפח גבוה, כזה המתואר בפרוטוקול הטקסט המצורף. לאחר מכן, הנח את המסנן שנאפה מראש במארז המסננים והפעל את הדוגם בהתאם להוראות היצרן כדי לאסוף דגימה מתאימה. בתוך מabilis בטיחות ביולוגית מסוג class two, גזור 22 חלקיקים מעגליים של חומר מסנן נקי שנאפה מראש, באמצעות מקדח שעם נקי בקוטר 1.12 centimeter.

השתמש בחלקים אלו כדי להכין סדרה של מסננים עם תוספת אנדוטוקסין שישמשו כביקורות. לאחר מכן, חתוך את המסננים המכילים את הדגימה שנאספה באמצעות שואב שעם נקי בקוטר 1.12 centimeter והעבר כל דגימה לשפופרת נפרדת של 2 milliliter נקייה מפיירוגנים. כמו כן, העבר את המסננים המיובשים עם תוספת האנדוטוקסין לשפופרות נפרדות של 2 milliliter נקיות מפיירוגנים.

הוסף מיליליטר אחד של מים נקיים מפירוגנים (pyrogen free water) לכל מבחנה. נער אותם במשך 60 דקות בטמפרטורת החדר באמצעות מנער מעבדה. לאחר מכן, סבב את מבחנות הדגימה במיקרוצנטריפוגה ב-375 ×g למשך 10 דקות.

לאחר מכן, העבירו את העליון המכיל את האנדוטוקסינים למבחנה חדשה של 2 מיליליטר נקייה מפירוגנים. הכינו פלטה של 96 בארות בעלת תחתית שטוחה ומכסה, נקייה מפירוגנים, עבור בדיקת האנדוטוקסינים, על ידי קביעת מיקומי הדגימות תחילה.

בשלב הבא, הפעל את קורא המיקרופלטית ותכנת אותו לתגובה קינטית בטמפרטורה של 37 °C עם ניעור כל חמש דקות. לאחר מכן, בצע מדידות באורך גל של 405 nm. חזור על פעולת הניעור של חמש הדקות ועל קריאת הפלטה 18 פעמים.

טען את הדגימות לתוך המגש על ידי הוספת 50 µL של תמיסות סטנדרט אנדוטוקסין, ששימשו קודם לביצוע ה-spike למסננים, לשורות A1 עד A10 ו-B1 עד B10. מקם את הביקורות הריקות (blanks) ב-A11, A12, B11 ו-B12. לאחר מכן, הוסף את העלייה (supernatant) מתוך תמצית המסנן עם ה-spike שעברה סרצ'יפוגציה ואת הביקורות הריקות שלה לשורות C ו-D. לבסוף, הוסף את העליות מהדגימות הניסיוניות ומהביקורות הריקות לבארות הנותרות לפי הצורך.

כדי להפעיל את הבדיקה, הוסיפו במהירות 50 µL של תמיסת limulus amebocyte glycate לכל באער. נערה את הפלטה בעדינות באופן אופקי, לפני הרמתה לקורא הפלטות ותחילת ההרצה הניסויית.

עם סיום התהליך, הוצא את הפלטה מקורא הפלטות. קבע את רמת האנדוטוקסין בכל דגימה באמצעות עקומת הסטנדרט, וחשב גם את היעילות שבה חולצו האנדוטוקסינים מהמסננים של הדגימה. ראשית, הכן את המסננים שהושלב בהם DNA כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה.

עבור כל דגימת מסנן, הכין תערובת של חרוזי זכוכית שטופים בחומצה בתוך מבחנות סטריליות של 0.5 מיליליטר, הכוללת 0.1 גרם חרוזים בעלי קוטר של 425 עד 600 מיקרומטר ו-0.3 גרם חרוזים בעלי קוטר של 106 מיקרומטר או פחות. לאחר מכן, גזור שלוש חתיכות מעגליות ממיקומים שנבחרו באופן אקראי מכל דגימת מסנן, באמצעות שואב שעם (cork borer) מחומצם בעל קוטר של 1.12 סנטימטר. הנח את דגימות המסנן למבחנות נפרדות עם מכסה הברגה בנפח של שני מיליליטר.

לאחר מכן, הוסיפו את תערובת חרוזי הזכוכית לכל מבחנה יחד עם 60 µL של בופר לליזיס תאים (cell lysis buffer) המסופק עם ערכה להפקת DNA. סגרו את המבחנות והניחו את הדגימות במכשיר ה-bead beater. השתמשו ב-bead beater כדי לפרק את התאים המסוננים באופן מכני למשך דקה אחת, ולאחר מכן קררו את הדגימות על ידי הנחתן על קרח למשך דקה נוספת.

חזרו על מחזור זה חמש פעמים. המשיכו לפי הפרוטוקול של ספק הערכה ובצעו מיצוי של ה-DNA מהתאים שעברו ליזה. לאחר האלוציה, העבירו שוב את הדגימה המאולוצית דרך עמודת המיצוי פעם שנייה כדי לשפר את תנובת ה-DNA.

הפעל את מכשיר ה-quantitative PCR מראש כדי לאפשר לו זמן לחימום. בקובץ תוכנית חדש, הזן את פרטי הרצת ה-quantitative PCR בתוכנת ההפעלה של המכשיר. לאחר מכן, חטא את משטח העבודה באמצעות חומר להסרת זיהומי DNA ממשטחים ועבוד אך ורק עם מבחנות, טיפים וריאגנטים סטריליים.

בנוסף, הניחו דלי קרח לצד שולחן העבודה והניחו את תערובת ה-tac polemoraris בתוך הדלי. הכינו את תערובת התגובה ל-quantitative PCR כפי שמתואר בטבלה 4 בפרוטוקול הטקסט המצורף. שמרו את תערובת התגובה בחושך ועל קרח עד לשימוש.

בשלב הבא, הניחו מיקרופלטה נקייה בתוך מחזיק פלטות כדי למנוע ממנה לגעת במשטח העבודה ולשמור על ניקיונה. הוסיפו מיקרוליטר אחד של DNA סטנדרטי, DNA של דגימה או מים נקיים מנוקלאז (nuclease-free water), לתוך בארות מיקרופלטת ה-quantitative PCR בשלוש חזרות. לאחר מכן, הוסיפו תשעה מיקרוליטרים של תערובת ריאקציה מאסטר (master reaction mix) לכל בארת ריאקציה.

בסיום, כסו את הפלטה בסרט דביק אופטי ואטמו אותה היטב מכל הצדדים. סובבו את הפלטה בצנטריפוגה המצוידת במחזיקי פלטות למשך דקה אחת במהירות של 1000 ×g, לפני הנחתה בטרמוסייקלר. לבסוף, הפעילו והריצו את תוכנית ה-quantitative PCR שהוכנה.

במהלך הפקת האנדוטוקסין, דגימות מסוננות מסובבבות בצנטריפוגה כדי להפיק את האנדוטוקסין מהמסנן. מהירויות צנטריפוגה שונות מובילות ליעילויות הפקה משתנות, במיוחד בריכוזי אנדוטוקסין גבוהים יותר.

יש לבצע בדיקה ראשונית של יעילות המיצוי עבור המסנן הספציפי שנבחר והפרוטוקול שבוצע. יעילות מיצוי גבוהה יותר מושגת מהוספת תסמין למסננים נקיים בהשוואה למסנני קוורץ שנבדקו, ושתי יעילויות אלו נמוכות מזו המושגת באמצעות גילוי ישיר של תמיסת הסטנדרט. לאחר השליטה בשיטה, ניתן לבצע את אנליזת האנדוטוקסין תוך שלוש שעות וחצי, במידה והיא מבוצעת כהלכה.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון ריצוף DNA כדי לענות על שאלות נוספות בנוגע להעברה של אורגניזמים באטמוספירה. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להפיק ביעילות אנדוטוקסינים ו-DNA ממסנני דגימות אוויר ולנתח אותם באופן מדויק.