הדמית מבני subcellular בעובר דג הזברה החייה

המטרה הכוללת של שיטת הדמיה זו היא לחקור אברונים תת-תאיים בבעל חוליות in vivo. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של תאי העצב, כגון דינמיקה של מיטוכונדריה, או צנטרוזומים בהקשר in-vivo. היתרון העיקרי בטכניקה זו הוא שניתן לבצע את הניסוי כולו בבעל חוליות שלם, ללא צורך בהליך כירורגי כלשהו.

שיטה זו יכולה לספק תובנה לא רק לדינמיקה תת-תאית בתנאים פיזיולוגיים, אלא ניתן ליישם אותה גם במחקרים של מודלים של תזה, כגון מחלת אלצהיימר. לאחר יצירת עוברים המתבטאים באופן ארעי על ידי מיקרו-הזרקה, או השגת עוברים מקווים טרנסגניים יציבים, על פי פרוטוקול הטקסט, בסוף היום הראשון, יש לסנן ביציות מתות או לא מופרות. באמצעות פיפטת העברה מפלסטיק, העבירו את העוברים ברי הקיימא לתמיסה של דניאו המכילה 1x PTU כדי למנוע היווצרות פיגמנט, ושמרו על העוברים בתמיסה של דניאו המכילה 1x PTU עד לבדיקת ביטוי טרנסגנים.

ביום ניסוי ההדמיה, השתמש במיקרוסקופ מנתח פלואורסצנטי כדי לסנן עוברים מורדמים לביטוי טרנסגנים. לאחר מכן העבירו את העוברים שנבחרו לצלחת פטרי נפרדת המכילה את המאגר של דניאו עם 1x PTU ו-1x טריקאין. לאחר שהעוברים הורדמו, יש לזרוק בעדינות כמה לתוך האגרוז בעל ההמסה הנמוכה המכיל 1x PTU ו-1x טריקאין, ולהעביר כמה שפחות נוזלים כדי למנוע דילול האגרוז.

מעבירים את העוברים עם כמות קטנה של אגרוז לצלחת פטרי עם תחתית זכוכית. לאחר מכן, בעבודה מהירה יחסית, השתמש במלקחיים כדי למקם את העוברים בכיוון הרצוי בהתאם למבנה שיש לצלם. העוברים צריכים להיות מכוונים כראוי, למשל, שטוחים בצד להדמיית הרשתית או נוירון רוהון-בירד.

כיוון מדויק יבטיח את איכות ההדמיה הטובה ביותר וייעל את מהירות הרכישה. לאחר שאפשרתם לאגרוז להתמצק למשך 15 דקות לפחות, הוסיפו את המאגר של דניאו עם 1x PTU ו-1x טריקאין כדי לכסות את העוברים. לביצוע מיקרוסקופיה בשדה רחב, לאחר איזון צלחת דגים רכובים בתא חימום בטמפרטורה של 28.5 מעלות צלזיוס, על במת מיקרוסקופ שדה רחב, ובחירת תחום עניין, פתח את תוכנת המיקרוסקופ.

תחת תאורה, לחץ על הגדרות תצורה כדי להגדיר את ערכות המסננים הנכונות עבור אורך הגל המבוקש. תחת הגדרות מצלמה, הזן את זמן החשיפה הנדרש לקבלת תמונה מתאימה. לאחר מכן, בחר מטרת חרוט טבילה במים למרחקים ארוכים, הנעה בין הגדלה של פי 40 ל-100x, בעלת הצמצם המספרי הגבוה ביותר ומתוקנת כרומטית.

לחץ על שידור חי כדי לבחור את שדה הראייה. במקרה של נוירון R-B, דמיין הובלה מיטוכונדריאלית באקסון הגזע, הנובע מגוף התא או בסוכה ההיקפית. לאחר מכן, בתפריט ImageJ, לחץ על כפתור הבחירה המלבני והגדר אזור עניין, או ROI.

ולחץ על החזר ROI בחלון המיקרו-מנהל. לאחר בחירת החזר ה-ROI להדמיה, לחץ על עצור ושמור כדי להקליט את המורפולוגיה העצבית בערוץ YFP. כדי לדמות הובלה מיטוכונדריאלית, לחץ על רכישת Multi-D.

לאחר מכן, בחלון שנקרא רכישה רב-ממדית, בחר את מספר נקודות הזמן ואת המרווח בין נקודות הזמן. בחלון רכישה רב מימדית יש ללחוץ על ערוצים, ולהוסיף ולהגדיר את אורך הגל להדמיה ואת זמן החשיפה. לחץ על שמור תמונות כדי לשמור אוטומטית את הקבצים בתיקייה הספציפית המתוארת במסלול הספרייה.

כעת, לחץ על רכוש בפינה השמאלית העליונה כדי להתחיל בהדמיית זמן-lapse. עבור מיקרוסקופיה קונפוקלית, לאחר הנחת העוברים המורכבים בתא חימום בטמפרטורה של 28.5 מעלות צלזיוס על הבמה הקונפוקלית, פתח את תוכנת המיקרוסקופ ולחץ על Trans Lamp או Epi Lamp. לאחר מכן, באמצעות העיניים של המיקרוסקופ, השתמש באור מועבר או פלואורסצנטי בהתאמה כדי לזהות את אזור העניין.

בחלון הגדרת הרכישה, ודא שהמטרה שנבחרה להדמיה תואמת את המטרה המופיעה בתפריט הנפתח של היעדים הזמינים. לאחר מכן, בחלון בקרת רכישת תמונה, לחץ על כפתור רשימת הצבעים ובחר את הפלואורופורים המתאימים. לחלופין, לחץ על נתיב האור וצבעים כפתור כדי להגדיר ידנית את הפרמטרים.

בחלון Acquisition Setting, התאימו את גורם הזום ואת יחס הגובה-רוחב של התמונה הסרוקה כדי לקבל את גודל הפיקסלים הדרוש לפתרון מיטבי של המבנים המצולמים. הגדר את גודל הפיקסלים כמחצית מהרזולוציה התיאורטית של המטרה, ובכך לעקוב אחר קריטריוני הדגימה של נייקוויסט. כדי לקבוע את גודל הפיקסלים של תמונה שנרכשה, בחלון בקרת רכישת תמונות, לחץ על כפתור I.

לאחר מכן, הגדר את מהירות הסריקה למהירה ביותר האפשרית. לאחר מכן, בחלון בקרת רכישת תמונה, לחץ על ממוצע קו קלמן והגדר לפקטור של שניים או שלושה כדי להפחית את הרעש. כדי לבחור מצב סריקה רציף להדמיית פלואורופורים עם ספקטרום חופף, לחץ על רציף וקו.

לאחר מכן, התאם את תפוקת הכוח של קווי הלייזר הרלוונטיים. כדי לסרוק באופן רציף את האזור שנבחר תוך התאמת הגדרות הגלאי עבור כל ערוץ, לחץ על XY Repeat או על Focus x2 או Focus x4. לאחר מכן, התאם את HV, Gain ו-Offset עבור כל ערוץ כדי לקבל תמונות בעלות הטווח הדינמי הגבוה ביותר של ערכי אפור.

כעת, לחץ על Control plus H כדי לדמיין את התמונות שנרכשו באמצעות טבלת חיפוש המזהה פיקסלים לא רוויים בכחול, ופיקסלים רוויים יתר על המידה באדום, שיש להימנע משניהם. הערך מחדש את תפוקת הכוח של קווי הלייזר הרלוונטיים, ואת הגדרות הגלאי. כדי להגדיר את הגבולות העליונים והתחתונים של עוצמת הקול שיש לצלם, בהגדרת רכישה לחץ על כפתור סיום הגדר בגבול העליון ולאחר מכן התמקד בגבול התחתון ולחץ על התחל הגדר.

כדי לבדוק את רזולוציית Z של המטרה, בבקרת רכישת תמונה, לחץ על הסמל I. לאחר מכן בחר גודל צעד שהוא מחצית מרזולוציית Z עבור המטרה הנתונה. בחלון המשנה TimeScan, הזן את התדירות שבה יש לרכוש ערימות Z, ואת מספר הפעמים שיש לרכוש את התמונות, כדי להגדיר סדרת זמן המתאימה לדינמיקה של המבנה התת-תאי שיש לצלם.

לחץ על כפתורי העומק והזמן כדי לאשר ש-Z-stack וסדרת הזמן יירכשו. לבסוף, לחץ על כפתור XY Zt כדי להתחיל לרכוש תמונות זמן-lapse. לאחר רכישת התמונה, בממשק התוכנה, לחץ על סדרה בוצעה.

ושמור את התמונות בפורמט OIB כדי להקליט את התמונות והמטא נתונים המשויכים. איור זה מציג אברונים ונוירוני R-B הממוקמים על פני העובר באמצעות שדות רחבים ומיקרוסקופיה קונפוקלית. כאן, נעשה שימוש בהדמיית זמן-lapse במיקרוסקופ שדה רחב כדי לעקוב אחר תנועתו של מיטוכונדריום בודד בסוכה ההיקפית של נוירון R-B.

הדמיה קונפוקלית איטית משמעותית ועלולה להוביל להערכת חסר של הדינמיקה של אירועים תת-תאיים ספציפיים. תמונות של תאי רשתית שנרכשו על ידי מיקרוסקופיה בשדה רחב סובלות מניגודיות גרועה, שכן אותות פלואורסצנטיים מנפח גדול של רקמה מסתירים פרטים במישור המוקד. כאן, יכולת החיתוך האופטי של מיקרוסקופיה קונפוקלית משפרת באופן ניכר את הניגודיות.

התוספות מציגות פרטים על אזור בשכבת הגרעין הפנימית, עם תיוג של ממברנות התאים והמיטוכונדריה. מונע על ידי מניע Gau-4 ספציפי של נוירון חושי, ביטוי הפסיפס מהזריקות של UAS-mito-CFP ו-UAS MAY-FP מאפשר מעקב אחר תאים בודדים לאורך ימים, כפי שניתן לראות בנוירון חושי R-B זה יומיים ושלושה לאחר ההפריה. בנוסף למיטוכונדריה, ניתן לסמן אברונים תת-תאיים אחרים כגון צנטרוזומים, באופן פלואורסצנטי.

בדוגמה זו, שתי קלטות כטב"מים על מבנה רציף יחיד הניעו את הביטוי של YFP ממוקד צנטרוזום, וצרוליאן ממוקד ממברנה בתאי רשתית. הכניסות מציגות תא בשלב M. כל ההליך הזה דורש מספר ימים מההזדווגות, איסוף הביציות, זריקות, ולבסוף הדמיה שלושה או ארבעה ימים לאחר ההפריה.

ניסוי ההדמיה בפועל במיקרוסקופ יכול להימשך מספר דקות עד יום שלם. בעקבות הליך זה, ניתן לתייג ולדמות אברונים אחרים כמו מיקרו-צינורות או פרוקסיזומים על מנת להבין את הדינמיקה שלהם in vivo. אל תשכח ש-PTU הוא מסרטן ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון לבישת כפפות בעת ביצוע הליך זה.