הודעת הטור derivatization שימוש ביצועים גבוהים תזרים תגובת עמודות נוזלת כרומטוגרפיה

המטרה הכוללת של שיטה זו היא לשפר את היעילות והרגישות של נגזרת לאחר עמודה (post column derivatization), או שיטת PCD, בכרומטוגרפיה נוזלית בעוצמה גבוהה (HPLC), באמצעות שימוש בעמודת זרימה ריאקטיבית. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובה לשאלות מפתח בתחומים כגון מדעי הרוקחות, הביו-רפואה ומדעי הסביבה, שבהם מנותחים תרכובות בעלות תגובה נמוכה לגלאי HPLC. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שאין צורך בסלילי תגובה.

מכיוון שערבוב התוצר היוצא מהעמוד עם ריאגנט הנגזרת מתבצע ביעילות רבה יותר מאשר בשיטות קונבנציונליות, שיטה זו שימשה למתן תובנות לגבי נוגדי חמצון, חומצות אמינו ופנולים. ניתן ליישמה גם לסוגי תרכובות אחרים, כגון תיולים, מתכות, אנטיביוטיקה ורעלים.

למרות שלא כל הדגימה עוברת נגזרת (derivatization), בשל הרחבת פס (band broadening) נמוכה יותר, ריכוז האנליט בזרם השפכים גבוה יותר מאשר בניתוח נגזרת רגיל לאחר העמוד (post column derivatization). כדי להתחיל בהליך זה, הכין את מכשיר ה-HPLC עם 100% water בקו A ו-100% methanol בקו B כפאזה ניידת, תוך שטיפה (purging) של המשאבות בהתאם לדרישות היצרן. הגדר את רכיבי ה-HPLC ואת משאבת הנגזרת הנוספת.

לאחר מכן, הגדירו את גלאי ה-UV/VIS לניתוח באורך גל של 520 ננומטר. חברו את הכניסה של עמודת זרימת התגובה, או RF, למכשיר ה-HPLC. חברו יציאת פריפריה לגלאי ה-UV/VIS באמצעות צינור בקוטר פנימי של 0.13 מילימטר ובאורך של 15 סנטימטר.

בשלב הבא, חברו את קו המשאבה של ה-DPPH ליציאה היקפית (peripheral port) בפתח היציאה של עמודת ה-RF. חסמו את היציאה ההיקפית שאינה בשימוש בפתח היציאה של עמודת ה-RF באמצעות פקק לעמודה. חברו צינור באורך 15 סנטימטרים וקוטר פנימי של 0.13 מילימטר לפתח היציאה המרכזי של עמודת ה-RF.

הגדירו את קצב הזרימה של משאבת ה-HPLC ל-1 mm/min ב-100% methanol. לאחר מכן, השביגו את העמודה עם 100% methanol למשך 10 דקות. בשלב זה, הכינו תמיסת DPPH במתנול בריכוז 0.1 mg/mL.

בצע סוניקציה לבקבוק המכיל את ריאגנט ה-DPPH למשך 10 דקות. פurge (נקה) את משאבת ה-DPPH עם ריאגנט ה-DPPH שהוכן, בהתאם לדרישות היצרן. לאחר מכן, קח שני כלים נקיים ויבשים וסמן אחד כ-"מרכזי" (central) והשני כ-"היקפי" (peripheral). שקול את שני הכלים בדיוק.

אספו את השפכים היוצאים מהפתח המרכזי אל הכלי המסומן "central" למשך דקה אחת. לאחר שקילה חוזרת של כלי הפתח המרכזי, חשבו את משקל הזרימה מהפתח המרכזי. חזרו על השלבים הקודמים עבור השפכים היוצאים מה-UV/VIS המחובר לפתח ההיקפי של עמודת ה-RF.

חשב את המשקל עבור כלי הנמל ההיקפי. לאחר מכן, חשב את אחוז הזרימה המגיעה מהנמלים המרכזי וההיקפי. חזור על השלבים הקודמים עד שיחס הזרימה יהיה נכון, ולאחר מכן הגדר את קצב הזרימה של משאבת ה-DPPH ל-0.5 milliliters per minute.

בסיום ההרצה, הפסיקו את זרימת משאבת ריאגנט הגזירה (derivatization). הוציאו את קו משאבת ריאגנט ה-DPPH מהפתח ההיקפי וסגרו את הפתח באמצעות פקק. שווו את העמוד עם הפאזה הניידת שבה הוא אמור להישמר, תוך מתן אפשרות לפאזה הנייदित לעבור דרך העמוד בקצב של 1 millimeter per minute למשך 10 דקות.

לאחר מכן, הפסיקו את זרימת משאבת שלב הבועות במכשיר ה-HPLC. לבסוף, החליפו את ריאגנט ה-DPPH במתנול ושטפו את המשאבה הנוספת. כאן מוצגים שני כרומטוגרמים של דגימת קפה ריסטרטו, שעברה נגזרת עם רדיקל DPPH באמצעות מכשור PCD קונבנציונלי ו-RF-PCD.

גבולות הכימות והגילוי המחושבים עבור כל אחת מחומצות האמינו שנבדקו הן במצב RF-PCD והן במצב PCD קונבנציונלי רשומים כאן. כרומטוגרמה של ארבע חומצות האמינו שנבדקו באמצעות שיטת ה-PCD הקונבנציונלית, שיטת ה-RF-PCD והזרם ללא נגזרת משיטת ה-RF-PCD מוצגת כאן. השוואה של האותות שהתקבלו עבור הפסגות של glycine ו-leucine באמצעות שיטות ה-PCD הקונבנציונלית וה-RF-PCD מוצגת כאן.

כאן מוצגת השוואה של רוחב הפיסג של פיסגת הטריפטופאן בעת ניתוח באמצעות שיטת ה-PCD הקונבנציונלית, שיטת ה-RF-PCD, והזרם ללא נגזרת משיטת ה-RF-PCD. דגימת בדיקה בעלת 21 רכיבים, שהכילה רכיבים מסוימים המראים תגובה לסכימת הגזירה וחלק שאינם מראים תגובה, הופרדו, עברו גזירה וזוהו. לצורך השוואה, אותה תערובת הופרדה וזוהה ללא גזירה.

השוואה בין צורת הפיס של para-Cresol, הן לאחר נגזרת באמצעות עמודת RF-PCD והן ללא נגזרת, מוצגת כאן. ברגע שהטכניקה תשלט, ניתן להגדירה באותו זמן שנדרש לניתוח נגזרת רגיל לאחר העמודה. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להיצמד ככל האפשר ליחסי הזרימה שהוגדרו.

בעקבות פרוצדורה זו, ניתן להשתמש בריאגנטים אחרים לנגזרת לאחר העמודה, כגון OPA, ninhydrin או הלוגנים, כדי לנתח תרכובים אחרים. לאחר צפייה בסרטון זה, צריכה להיות לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו מגדירים ומכוונים עמודת זרימה לתגובה.