הודעת הטור derivatization שימוש ביצועים גבוהים תזרים תגובת עמודות נוזלת כרומטוגרפיה

המטרה הכוללת של שיטה זו היא לשפר את היעילות והרגישות של כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים לאחר נגזרת עמודה, או שיטת PCD, באמצעות שימוש בעמודת זרימת תגובה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומים כמו מדעי התרופות, הביו-רפואה והסביבה, שבהם מנותחים תרכובות בעלות תגובה נמוכה לגלאי HPLC. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאין צורך בסלילי תגובה.

מכיוון שערבוב של שפכי העמודה ומגיב נגזרת מתרחש בצורה יעילה יותר משיטות קונבנציונליות. שיטה זו שימשה כדי לספק תובנות לגבי נוגדי חמצון, חומצות אמינו ופנולים. ניתן ליישם אותו גם על תרכובות מסוג אחר, כגון תיולים, מתכות, אנטיביוטיקה ורעלים.

למרות שהמדגם כולו אינו נגזר, עקב הרחבת פס נמוך יותר, ריכוז האנליט בזרם זרימת הקולחין גבוה יותר מאשר בניתוח נגזרת פוסט עמודה קונבנציונלי. כדי להתחיל בהליך זה, הכן את מכשיר ה-HPLC עם 100% מים בקו A ו-100% מתנול בקו B כשלב הנייד, תוך טיהור המשאבות בהתאם לדרישות היצרן. הגדר את הרכיבים האינסטרומנטליים של HPLC ואת משאבת הנגזרת הנוספת.

לאחר מכן, הגדר את גלאי ה-UV/VIS לניתוח באורך גל של 520 ננומטר. חבר את הכניסה של עמודת זרימת התגובה, או RF, למכשיר HPLC. חבר יציאה היקפית לשקע לגלאי UV/VIS באמצעות צינור באורך 15 ס"מ בקוטר פנימי של 0.13 מילימטר.

לאחר מכן, חבר את קו משאבת ה-DPPH ליציאה היקפית בשקע עמוד ה-RF. חסום את היציאה ההיקפית שאינה בשימוש ביציאה של עמוד ה-RF באמצעות פקק עמוד. חבר צינור באורך 15 ס"מ בקוטר פנימי של 0.13 מילימטר ליציאה המרכזית של עמוד ה-RF.

הביאו את קצב הזרימה של משאבת ה-HPLC למילימטר אחד לדקה ב-100% מתנול. לאחר מכן אזנו את העמודה עם 100% מתנול למשך 10 דקות. בשלב זה, הכינו תמיסה של 0.1 מיליגרם למיליליטר של DPPH ומתנול.

סוניקציה של הבקבוק המכיל את מגיב ה-DPPH למשך 10 דקות. נקה את משאבת ה-DPPH עם מגיב ה-DPPH המוכן בהתאם לדרישות היצרן. לאחר מכן, קחו שני כלים יבשים ונקיים וסמנו אחד כמרכזי והשני כהיקפי"שקלו במדויק את שני הכלים.

אסוף את השפכים היוצאים מהנמל המרכזי לכלי המסומן "מרכזי" למשך דקה אחת. לאחר שקילה מחדש של כלי הנמל המרכזי, חשב את משקל הזרימה מהנמל המרכזי. חזור על השלבים הקודמים עבור הקולחין היוצא מה-UV/VIS המחובר ליציאה ההיקפית של עמודת ה-RF.

חשב את המשקל עבור כלי הנמל ההיקפי. לאחר מכן, חשב את אחוז הזרימה המגיעה מהנמלים המרכזיים וההיקפיים. חזור על השלבים הקודמים עד שיחס הזרימה נכון, ולאחר מכן הגדר את קצב הזרימה של משאבת DPPH ל-0.5 מיליליטר לדקה.

לאחר סיום הריצה, הפסק את זרימת משאבת המגיב הנגזרת. הסר את קו משאבת המגיב DPPH מהיציאה ההיקפית ועצור את היציאה. אזנו את העמודה עם השלב הנייד בו היא מיוחסנת, ואפשרו לשלב הנייד לעבור דרך העמודה במהירות של מילימטר לדקה למשך 10 דקות.

לאחר מכן, עצור את זרימת משאבת שלב הבועות במכשיר ה-HPLC. לבסוף, החלף את מגיב ה-DPPH במתנול וטהר את המשאבה הנוספת. שתי כרומטוגרמות של דגימת קפה ריסטרטו, שנגזרו עם רדיקל DPPH באמצעות מכשור PCD ו-RF-PCD קונבנציונלי, מוצגות כאן.

הגבולות המחושבים של כימות וזיהוי עבור כל אחת מחומצות האמינו שנותחו הן במצבי RF-PCD והן במצבי PCD קונבנציונליים מפורטים כאן. כרומטוגרמה של ארבע חומצות האמינו שנותחו בשיטת PCD הקונבנציונלית, שיטת RF-PCD והזרם הלא נגזר משיטת RF-PCD מוצגת כאן. השוואה של האותות המתקבלים עבור הפסגות עקב גליצין ולאוצין באמצעות שיטות PCD ו-RF-PCD הקונבנציונליות מוצגת כאן.

השוואה של רוחב השיא של שיא הטריפטופן בעת ניתוח בשיטת PCD קונבנציונלית, שיטת RF-PCD והזרם הלא נגזר משיטת RF-PCD מוצגת כאן. מדגם בדיקה בן 21 רכיבים שהכיל כמה רכיבים המראים תגובה לסכימת הנגזרת וחלקם לא הופרדו, נגזרו וזוהו. אותה תערובת הופרדה גם היא והתגלתה ללא נגזרת להשוואה.

השוואה של צורת השיא של para-Cresol, שניהם נגזרים באמצעות העמודה RF-PCD ולא נגזרים, מוצגת כאן. לאחר שליטה, ניתן להגדיר טכניקה זו במקביל לניתוח נגזרות פוסט עמודות קונבנציונאלי. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להיות קרוב ככל האפשר ליחסי הזרימה שנקבעו.

בעקבות הליך זה, ניתן להשתמש בריאגנטים אחרים לנגזרת לאחר עמודה, כגון OPA, נינהידרין או הלוגנים על מנת לנתח תרכובות אחרות. לאחר צפייה בסרטון זה, אמור להיות לך מושג טוב כיצד להגדיר ולכוון עמודת זרימת תגובה.