הכנת Thermoresponsive Nanostructured משטחי הנדסת רקמות

המטרה הכוללת של שיטת Langmuir-Schaefer זו עם קו-פולימרים בלוקית היא לייצר גילי תאים תחת תנאים שונים של משטח תגובתי לטמפרטורה, על ידי בקרת עוצמת ההיצמדות והקישור של התאים. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הביומטריאלים, כגון חומרים תואמים ביולוגית, משטחים לתרבית תאים והפרדה ביולוגית. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן לשלוט באינטראקציה בין המשטח התגובתי לטמפרטורה לבין התאים, וניתן למטב את תנאי השינוי עבור התאוששות של גילי התאים.

אף ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי האינטראקציה בין תא למשטח, ניתן להחיל אותה גם על מערכות אחרות כגון הפרדה ביולוגית וביופילם. ראשית, המיס styrene, ECT ו-ACVA ב-40 milliliters של 1, 4-Dioxane. הקפא את התמיסה בחנקן נוזלי תחת ואקום למשך 15 עד 20 דקות כדי להסיר מינים ריאקטיביים.

לאחר הפשרה הדרגתית של התמיסה בטמפרטורת החדר, חזרו על מחזור ההקפאה, השאיבה, ההפשרה וניקוי הגזים שלוש פעמים. הפקו את הפוליסטירן כסוכן macro-RAFT באמצעות פולימריזציה ב-70 °C למשך 15 שעות באמבט שמן. שקיעו את סוכן ה-macro-RAFT של הפוליסטירן ב-800 milliliters של אתר, ויבשו בוואקום (in vacuo).

בשלב הבא, המיסו את מונומר ה-IPAAm, סוכן macro-RAFT של פוליסטירן ו-ACVA בארבעה מיליליטר של 1, 4-Dioxane. הסירו את החמצן מהתמיסה באמצעות מחזורי ניתוק גזים של הקפאה, שאיבה והפשרה (freeze, pump, thaw), כפי שבוצע קודם לכן. בצעו פולימריזציה בטמפרטורה של 70 °C למשך 15 שעות באמבט שמן לאחר ניתוק הגזים.

לבסוף, השג את מולקולת ה-St-IPAAm המסנתזת באותו אופן שבו הושג סוכן ה-macro-RAFT של הפוליסטירן. שטוף מצעי זכוכית בעודף של אצטון ואתנול, ובצע סוניקציה למשך חמש דקות להסרת מזהמי פנים. ייבש את המצעים בתנור בטמפרטורה של 65 °C למשך 30 דקות.

לאחר מכן, השתמש בפלזמה של חמצן כדי להפעיל את פני השטחים של התשתיות בטמפרטורת החדר. טבול את התשתיות בטולואן המכיל 1% hexatrimethoxysilane למשך לילה בטמפרטורת החדר כדי לבצע סילנזציה (sylanisation) לתשתית. לאחר מכן, שטוף את התשתיות שעברו סילנזציה בטולואן וטבול אותן באצטון למשך 30 דקות כדי להסיר את הסוכנים שלא הגיבו.

בצעו חישול (Anneal) לתשתיות במשך שעתיים בטמפרטורה של 110 degrees Celsius כדי לקבע את הפני השטח באופן יסודי. לבסוף, חתכו את התשתיות שעברו סילניזציה באמצעות חותך זכוכית לגודל של 25 millimeters על 24 millimeters כדי שיתאימו לצלחות תרבית התאים. מקמו את מכשיר סרט הלנגמיר (Langmuir film) בתוך ארון כדי למנוע הצטברות של אבק.

יש לשטוף את אמבסיית לנגמיר (Langmuir trough) ואת המחסומים במים מזוקקים ובאתנול כדי להסיר מזהמים. ייבשו את האמבסייה ואת המחסומים על ידי ניגוב עם מגבת נטולת סיבים. לאחר מכן, מלאו את האמבסייה בכ-110 milliliters של מים מזוקקים, והניחו את המחסומים משני צדי האמבסייה.

בשלב הבא, חממו פלטת Wilhelmy פלטינה המשמשת לניטור מתח הפנים, באמצעות מבער גז, עד שהפלטה הופכת לאדומה. לאחר מכן, שטפו את הפלטה במים מזוקקים כדי להסיר מזהמים. תלו את פלטת ה-Wilhelmy על חוט המחובר למכשיר למדידת לחץ פנים.

אפס את מכשיר מדידת לחץ הפנים בהתאם לפרוטוקול היצרן. דחוס את הממשק בין האוויר למים באמירה באמצעות המחסומים משני צידי האמירה, עד שהממשק יגיע לשטח של כ-50 square centimeters ללא טיפות פולימר. שאב מזהמים קטנים עד שלחץ הפנים יהיה קרוב לאפס millinewtons per meter.

מקם מחדש את המחסומים משני הצדדים, והוסף מים מזוקקים כדי לפצות על הירידה בכמות המים המזוקקים. לאחר מכן, המס 5 mg של מולקולת St-IPAAm המסונתזת ב-5 mL של תמיסת פיתוח של כלורופורם. לאחר מכן, טפטף בעדינות 27 µL של St-IPAAm המומס בכלורופורם אל תוך האמבט באמצעות מיקרו-מזרק או מיקרו-פיפטה.

לאחר המתנה של חמש דקות כדי לאפשר התאיידות מלאה של הכלורופורם, הזיזו את שני המחסומים אופקית כדי לדחוס את מולקולת ה-St-IPAAm על פני השטח. שמרו על קצב דחיסה של המחסומים של 0.5 millimeters per second עד להגעה לשטח היעד של 50 square centimeters. מדדו את איזותרמות הלחץ השטחי Pi-A באמצעות לוחית פלטינה של Wilhelmy המחוברת למכשיר למדידת לחץ שטחי במהלך הדחיסה, בהתאם לפרוטוקול היצרן.

לאחר הגעה לגודל שטח המטרה, השהה את הפנימה למשך חמש דקות כדי לאפשר למולקולות ה-St-IPAAm להירגע. המולקולות אינן מגיעות לשיווי משקל מיד לאחר הדחיסה. לאחר מכן, העבר את סרט ה-Langmuir לתשתית זכוכית שעברה שינוי הידרופובי באמצעות מכשיר העברה למשך חמש דקות כדי לספוג את הסרט בצורה חזקה.

קבעו את מצע הזכוכית ההידרופובית במקביל על המכשיר. חברו את המכשיר לבמה ליישור והזיזו אותו בניצב. הרימו את המצע באופן אופקי באמצעות מכשיר ההעברה וייבשו למשך יום אחד בדסיקטור.

להכנת תרחיפי תאים, תרבתו תאי אנדותל של עורק התרדמה בבקר, או BAECs, עד להגעה ל-1/3 צפיפות (confluence) בטמפרטורה של 37 degrees Celsius ב-5%CO2 ו-95%air, על פוליסטירן לתרבית רקמה עם DMEM, המכיל FBS ו-Penicillin. לאחר הגעה לצפיפות הרצויה, טפלו את ה-BAECs באמצעות שלושה מיליליטרים של 0.25%trypsin EDTA למשך שלוש דקות בטמפרטורה של 37 degrees Celsius ב-5%CO2 ו-95%air. בטלו את פעילות ה-trypsin EDTA על ידי הוספת 10 מיליליטרים של DMEM המכיל 10%FBS.

ואספו את תלי התאים לשפופרת קונית של 50-milliliter. לאחר סבוב במערך צנטריפוגה במהירות של 120 times g למשך חמש דקות, שאבו את הנוזל העליון (supernatant) והשעיו שוב את התאים ב-10 milliliters של DMEM. זרעו את התאים שהופקו על משטחי ה-St-IPAAm בריכוז של 10,000 תאים לסנטימטר רבוע, כפי שנספר באמצעות המוציקומר (hemocytometer) חד-פעמי.

בחן את התאים על פני השטח באמצעות מיקרוסקופ המצויד באינקובטור בטמפרטורה של 37 degrees Celsius עם 5%CO2 ו-95%air. לאחר מכן, עקר את משטחי ה-St-IPAAm באמצעות אור ultraviolet המותקן בתוך מנקה מעבדה (clean bench). הקלט תמונות timelapse של BAECs נ adherent למשך כ-24.5 שעות בטמפרטורה של 37 degrees Celsius באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה (phase-contrast) בהגדלה של 10x.

לאחר היצמדות ה-BAECs, תיעדו את ניתוק ה-BAECs מפני השטח של ה-St-IPAAm בטמפרטורה של 20 °C למשך כ-3.5 שעות. לאחר אופטימיזציה של היצמדות התאים והניתוק שלהם מפני השטח שעליו הועבר סרט הלנגמיר (Langmuir film), הכינו את גליונות התאים על ידי תרבית של BAECs כפי שבוצע קודם לכן. זרעו סך של 100,000 תאים לסמ"ר על פני השטח של ה-St-IPAAm.

ודגרו למשך שלושה ימים ב-37 °C ב-5% CO2. תאי BAECs שהגיעו לקונפלואנציה התנתקו באופן ספונטני ב-20 °C. הכנת משטח עם סרט Langmuir המועבר והמגיב לטמפרטורה מוצגת כאן.

מحلול ה-St-IPAAm המסונתז בכלורפורם טפטף בעדינות על ממשק אוויר-מים. נעשה שימוש בשני מחסומים כדי לדחוס את מולקולות ה-St-IPAAm על הממשק עד שהושג שטח יעד של 50 square centimeters. לחץ הפנימה נמדד במהלך הדחיסה כדי לזהות פגמים כלשהם בסרט ה-Langmuir.

לאחר הדחיסה, מצע זכוכית לכיסוי שעבר מודיפיקציה הידרופובית הוצב אופקית על הממשק באמצעות במה ליישור. המצע הועלה באופן אופקי ויובש במשך יום אחד. לאחר שלב זה, משטחי St-IPAAm היו מוכנים לשימוש בניסויי תרביות תאים.

כאן מוצגות תוצאות מייצגות של תמונות טופוגרפיות במיקרוסקופיית כוח אטומי (AFM) של משטחי St-IPAAm. נבנו ננו-מבנים על שני משטחי ה-St-IPAAm. הגודל והצורה של הננו-מבנים היו תלויים באופן חזק ב-AM ובהרכב של St-IPAAm.

כאן מוצגת תמונה מאקרוסקופית של שכבת תאים שהופקה ממשטח המועבר באמצעות סרט Langmuir עם St-IPAAm 480, ושטח מולקולה (AM) של 40 square nanometers per molecule. התאים הגיעו לקונפלואנס לאחר שלושה ימים של תרבית על משטחי St-IPAAm 170 ו-St-IPAAm 480 בטמפרטורה של 37 degrees Celsius. ושכבת התאים הופקה במהירות לאחר הורדת הטמפרטורה מ-37 ל-20 degrees Celsius.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן הייצור, תכנון ההרכב המולקולרי של פולימר, ייצור והעברה של סרט Langmuir, בקרת היצמדות והסרה של תאים, והשבה של גילי תאים. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים בתחומי הביומטריאלים והנדסת הרקמות לחקור אינטראקציות בין תאים למשטחים ואסטרטגיות לתרבית תאים לשימוש ברפואה דגנרטיבית. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות עד לטיפולים בהשתלת תאים, כיוון שלטכניקה זו יש פוטנציאל לייצר גילי תאים מסוגים שונים, המופקים מהמטופלים עצמם.