סינתזה מיקרוגל מונחה של תחמוצת ברזל חלקיקים עבור איתור מהיר של טרשת עורקים

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא שימוש בטכנולוגיית מיקרוגל לסינתזה מהירה ופונקציונליזציה של ננו-חלקיקי תחמוצת ברזל עם חלק ביספוספונאט לזיהוי מהיר על ידי MRI של טרשת עורקים במודלים של עכברים. השימוש בטכנולוגיית מיקרוגל בסינתזה ופונקציונליזציה של ננו-חלקיקי תחמוצת ברזל עדיין מוגבל. עם זאת, אנו מדגימים כיצד ניתן לפתח ננו-חלקיקים באיכות גבוהה ופרוטוקולים מהירים במיוחד.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שבזמנים קצרים במיוחד, ניתן לייצר ננו-חלקיקים פונקציונליים באיכות גבוהה ולהשתמש בהם לצנתור של רובד טרשת עורקים המכוון למיקרו-הסתיידויות. כדי להתחיל בהליך זה, הוסף 0.5 גרם ברזל 3-אצטילאצטנט, 1.4 מיליליטר חומצה אולאית, 0.6 מיליליטר אולילמין ו -1.19 גרם של 1, 2-Hexadodecanediol לבקבוק מותאם למיקרוגל. הוסף 10 מיליליטר של אתר פניל בזהירות במורד דופן הבקבוק באמצעות פיפטה מדורגת.

לאחר מכן, הנח את הבקבוק בכור מיקרוגל והתחל את פרוטוקול המיקרוגל על ידי טעינת מחקר דינמי במיקרוגל. לאחר השלמת התגובה, והבקבוק התקרר לטמפרטורת החדר, העבירו את תערובת התגובה לבקבוק ארלנמאייר בעזרת פיפטת זכוכית והוסיפו 10 מיליליטר של 98 אחוז אתנול. הניחו את הבקבוק על גבי מגנט בורון ניאודימיום ניוביום והוציאו את הסופרנטנט בעזרת פיפטת זכוכית לאחר 5 דקות.

לאחר מכן, הוסף 10 מיליליטר אתנול לבקבוק. סוניקציה של הדגימה ב-40 קילו-הרץ למשך שתי דקות בטמפרטורת החדר. בסיום, הניחו את הדגימה על המגנט והוציאו את הסופרנטנט.

פזרו את הננו-חלקיקים המצופים בחומצה אולאית ב-30 מיליליטר כלורופורם וסוניקט ב-40 קילו-הרץ למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר סוניקציה, העבירו 0.5 מיליליטר מהננו-חלקיקים בקוביית זכוכית והוסיפו 0.5 מיליליטר כלורופורם. בדוק את הגודל ההידרודינמי ב-zetasizer לפי הוראות היצרן.

בשלב זה, ממיסים 44.3 מיליגרם אשלגן פרמנגנט ו-150.4 מיליגרם של בנזואיל טרימתיל אמוניום כלוריד בתערובת של שלושה עד שניים של מים וכלורופורם. הוסף את התמיסה המתקבלת לאליקווט של 5 מיליליטר של ננו-חלקיקים מצופים חומצה אולאית בבקבוק מותאם למיקרוגל. התחל את פרוטוקול המיקרוגל עבור ננו-חלקיקי חומצה אזלאית על ידי הגדרת הטמפרטורה ל-105 מעלות צלזיוס, הזמן לתשע דקות, הלחץ ל-250 psi וההספק ל-300 וואט.

לאחר מכן, הוסף 10 מיליליטר של מאגר פוספט pH 2.9 לבקבוק. לאחר חזרה על פרוטוקול המיקרוגל, והוצאת הסופרנטנט, הוסיפו 10 מיליליטר מים לבקבוק והעבירו את התערובת לבקבוק ארלנמאייר. השלב הקריטי ביותר הוא טיהור ננו-חלקיקי חומצה אזלאית.

לאחר מכן, הוסף 5 מיליליטר של 10 אחוז נתרן ביסולפט לבקבוק ארלנמאייר וסוניקט ב-40 קילו-הרץ למשך שתי דקות ב-25 מעלות צלזיוס. לאחר איסוף החלקיקים, והסרת הסופרנטנט, שטפו את הננו-חלקיקים שלוש פעמים נוספות עם אחוז נתרן הידרוקסיד אחד. פזרו מחדש את החלקיקים ב-5 מיליליטר של מאגר פוספט pH 7.2

כדי לבדוק את הגודל ההידרודינמי ואת פוטנציאל הזטה, העבירו 0.7 מיליליטר של ננו-חלקיקי החומצה האזלאית לתא נימי חד פעמי ומקופל והניחו אותו בזטאסייזר לניתוח. הוסף 12 מיליגרם של EDC ו-15 מיליגרם של סולפו-NHS בצינור צנטריפוגה עם אליקווט של 2 מיליליטר של ננו-חלקיקי חומצה אזלאית. מערבל את התערובת בטמפרטורת החדר למשך 35 דקות.

לאחר הנחת מגנט מתחת לצינור הצנטריפוגה כדי לערער את יציבות הננו-חלקיקים, שאפו את הסופרנטנט ושטפו את החלקיקים עם 1.5 מיליליטר של מאגר hepes 1 מילי-מולרי. לאחר מכן, מוסיפים 5 מיליגרם של נרידרונאט ומערבלים את התערובת למשך שעתיים. הפרד את הננו-חלקיקים בעזרת מגנט ושטוף עם מאגר hepes של 1 מילי-מולרי.

לבסוף, פזרו את הננו-חלקיקים הנרידרונאטים ב-2 מיליליטר של מאגר hepes של 1 מילי-מולרי. כדי לבדוק את הגודל ההידרודינמי ואת פוטנציאל הזטה, הוסף 0.7 מיליליטר של ננו-חלקיקי הנרידרונאט לתא נימי מקופל חד פעמי והנח אותו ב-zetsizer לניתוח. כל הננו-חלקיקים הציגו גודל הידרודינמי קטן בהתפלגות גודל צרה מאוד.

החלקיקים מציגים גבישיות מצוינת כפי שמוצג בתמונות TEM. בנוסף, אותן תוצאות עבור גודל והתפלגות הידרודינמיים התקבלו לאחר ארבע חזרות על הסינתזה, מה שמדגים את אחד ההיבטים החשובים ביותר של גישת המיקרוגל, יכולת השחזור שלה. תכונות קשירת יוני הסידן עקב ביספוספונטים הקיימים בננו-חלקיקי הנרידרונאט נבדקו על ידי רלקסומטריה והראו כי זמן ההרפיה של T2 גדל באופן ליניארי עם כמות יוני הסידן וזמן הדגירה עקב היווצרות צבירי ננו-חלקיקים בעוד שננו-חלקיקים ללא יון סידן נותרו יציבים.

ניסויי MRI in vivo בוצעו בעכברי אפו בני 48 שבועות ושעה לאחר ההזרקה, האות מהפלאק היה היפואינטנסיבי בהשוואה לתמונות הבסיסיות. בנוסף, יחס הפלאק לשריר היה שונה באופן משמעותי בין התמונות הבסיסיות לתמונות השעה לאחר ההזרקה. האות בכבד נוטר גם לאחר הזרקת ננו-חלקיקי הנרידרונאט שפונו לחלוטין ממחזור הדם לאחר 20 דקות, מה שאישר את ההצטברות הסלקטיבית של ננו-חלקיקים אלה לעבר רובד טרשת עורקים.

בוצעו הדמיה והיסטולוגיה ex vivo והדמיה של אבי העורקים, עם ובלי ננו-חלקיקים, הראתה הבדלים בעוצמת האות בהתאם לניסויי in vivo. לאחר השליטה, טכנולוגיית המיקרוגל מאפשרת אפיון סינתזה וזיהוי פלאק בזמן כולל של 3 שעות אם היא מבוצעת כראוי. יתרון נוסף של שיטה זו הוא שעם שינוי קטן ניתן לבצע טכניקות הדמיה אחרות, כמו תרמוגרפיה, על מנת לענות על שאלות נוספות כמו כימות טרשת עורקים.

לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הדמיית הלב וכלי הדם לחקור את האבחון המוקדם של טרשת עורקים עם מערך ניסיוני שניתן להתאים בקלות לצרכים קליניים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לייצר ננו-חלקיקי תחמוצת ברזל הידרופיליים עם מיקרוגל ויישומו בהדמיה קרדיווסקולרית. אל תשכח שעבודה עם תנורי מיקרוגל עלולה להיות מסוכנת בהתאם לתנור בו נעשה שימוש, ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון בקרת לחץ של הבור בעת ביצוע הליך זה.