כמו תא גזע

המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא להשתמש בבידודים (explants) של גג הבלסטוקוול או של הכובע האנימלי של x laevis לבחינת המנגנוסים המולקולריים והתהליכים התאיים העומדים בבסיס ההתפתחות העצבית in vitro ו-in vivo. שיטות אלו יכולות לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחומי הביולוגיה ההתפתחותית וביולוגיית תאי הגזע בנוגע לרכישת גורל תאי, נדידה של תאים, והתכונות האוטונומיות והלא-אוטונומיות של תאים עצביים. הטכניקות המוצגות מספקות כלים פשוטים, זולים, ורסטיליים ויעילים לחקר המנגנונים הבסיסיים של התנהגויות מפתח של תאים עצביים.

בדיקות אלו מאפשרות לבחון גורמים קובעי גורל עצבי עבור תכנות מחדש של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים והיווצרות בוגרת של סוגי תאים ממקור עצבי לסריקה מעמיקה יותר. באופן כללי, אנשים שאינם מכירים את השיטה זו יתקלו בקושי שכן הטכניקות דורשות מיומנות ידנית. הרעיון לשיטות אלו עלה בדעתי לראשונה כאשר חשבתי על ניתוח התנהגות של הפרדת תאים.

כדי לבצע הרכבה שטוחה (flat-mount) של צינור עצבי קדמי של xenopus laevis, השתמשו בפיפטת העברה פלסטית כדי להעביר עובר שקובע, הותייבש והורט מחדש אל צלחת פטרי של 60 מילימטר מלאה עד שפתה ב-PBT. לאחר מכן, הכניסו זוג פינצטות עדינות בין העיניים לבין הצינור העצבי בגובה גבעול העין והפרידו את העיניים. לאחר מכן, הכניסו בזהירות את הפינצטות מתחת לאקטודרמה המכסה את הצינור העצבי מאחורי הראש וקלפו בעדינות את האקטודרמה.

לאחר ביצוע תיוג היברידיזציה NC2 המתאים, העבירו את העובר לצלחית פטרי חדשה בנפח 60 מיליליטר מלאה ב-PBT, והשתמשו בפינצטה עדינה כדי לבודד באופן גס את צינור העצבים הקדמי מהעובר. לאחר מכן, הסירו בזהירות את הנוטוכורד (chorda dorsalis) המחובר באופן רופף מתחת לצינור העצבים. במידת הצורך, הסירו גם את שלפוחיות השמיעה (otic vesicles) ואת שאר חלקי המזודרם.

לאחר שכל נספחי צינור העצבים נכרתו, הפרידו את צינור העצבים הקדמי מהעובר. לאחר מכן, העבירו את צינור העצבים המבודד לשפופרת קונוסית של 1.5 milliliter המלאה ב-50%glycerol ו-PBS לטיפול למשך לילה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר טיפול שני למשך לילה ב-90%glycerol, העבירו את צינור העצבים לזכוכית מיקרוסקופ בכמות קטנה של glycerol והשתמשו במחטי Tungsten כדי ל dissection של צינורות העצבים לאורך קווי האמצע הגביים והבטני.

לאחר מכן, השתמשו בטבעות חיזוק המכוסות בזכוכית כיסוי כדי להרכיב את שני צדדיו של צינור העצבים ב-90% glycerol וב-PBS. כדי להכין חרוזים להשראת מנחלי כיפת החי (animal cap explants), השתמשו במיקרופיפיה P200 כדי להעביר חצי ממנת חרוזי שרף שעברו טיפול ב-BSA לשפופרת חדשה של 1.5 מיליליטר. לאחר מכן, החליפו את המים המזוקקים הסטריליים בשפופרת החדשה ב-200 מיקרוליטר של מצע המכיל את המולקולה הניסיונית רצויה למשך שעתיים בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.

בסיום הדגירה, העבירו את העוברים בשלב הבלסטולה או בשלב מוקדם מאוד של הגסטרולה ל-PBS עם סידן ומגנזיום בתוספת 0.2% BSA. לאחר מכן, תחת מיקרוסקופ סטריאומיקרוסקופ, צבטו את קרום הוויטלין בעזרת זוג פינצטות אחד, והשתמשו בזוג פינצטות שני כדי לקלף לאט את הקרום מהצד הווגטלי של העובר, תוך הקפדה לא לפגוע בצד האנימלי. לאחר מכן, בעזרת פינצטות עדינות, גזרו ריבוע קטן מהקטב האנימלי של כל עובר.

באמצעות טיפ פפטה מצופה BSA, העבירו את הכובעים לבארים נפרדות של פלטת Terasaki רב-בארים ב-0.5X modified Barth's saline, כאשר הצד של החיה הפיגמנטית נמצא במגע עם התחתית העגולה של הבאר. בעזרת מיקרופפטה P20, בחרו את החרוזים בצבע הוורוד הכהה ביותר מתוך מבחנת הטיפול והניחו חרוז אחד על כל כובע, תוך שימוש בפינצטה למרכוז החרוזים על הכובעים. לאחר הנחת החרוז האחרון, הניחו את הפלטה מעל ניירות ספוגים במים וכסו אותה במכל פלסטיק לפני הדגירה.

כדי להכין תרביות של קפ פולו (animal cap) מופרדות ומאוחדות מחדש, בודדו 15 עד 30 קפ פולו כפי שהודגם כעת. השתמשו בפינצטה עדינה כדי לגזור ריבוע קטן של רקמה מהקטבים העליונים (animal poles). העבירו את הקפ פולו לבאר מצופה אגרוז ג'ל ומלאה בתמיסת סלין Holtfreter נטולת סידן, כאשר הצדדים הפיגמנטריים פונים כלפי מעלה.

לאחר מספר דקות, ניתן להבחין בפירוק (disaggregation). השתמשו בפינצטה עדינה כדי להפריד את השכבות הפיגמנטיות משאר הרקמה. לאחר מכן, השתמשו במיקרופיפט P20 כדי להסיר את הפיגמנט.

כאשר רוב השכבות הפיגמנטיות הוסרו והתאים התנתקו לחלוטין, סובב את הצלחת כדי לרכז את התאים והשתמש במיקרופיפט P1000 כדי להסיר כמה שיותר מהתווך, תוך הקפדה לא לגעת בתאים. לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד של תמיסת מלח Holtfreter עם סידן לבאר. העבר את כיפות החי (animal caps) המנותקות לשפרוֹרת של 1.5 מיליליטר.

לאחר סבב הצנטריפוגה של התאים, השתמש במיקרופיפט P1000 כדי להסיר בזהירות את הנוזל העליון (supernatant) ותלה את המשקע (pellet) ב-20 µL של תמיסת מלח Holtfreter עם סידן. אפשר לתאים להתאגד מחדש למשך שלוש עד שש שעות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הוסף לאט 1 mL של 3/4 NAM כדי לנתק בזהירות את התרביות (explants) מהקרקעית של המבחנה, והשתמש בפיפטת העברה מפלסטיק כדי לחלק את התרביות לפלטות בודדות שאינן מצופות.

כדי להשתיל רקמות של כיפת בעלי חיים (animal cap) על לוחות עצביים של xenopus laevis, יש ראשית לצפות צלחות פטרי בקוטר 60 מילימטר ב-3% agarose וב-3/4 NAM, וליצור בהן חורים קטנים. לאחר מכן, העבירו עוברים בשלב נוירולת מוקדם ל-PBS עם סידן ומגנזיום בתוספת 0.2% BSA לצורך הסרת הקרום הוויטליני. לאחר מכן, מלאו את צלחת הדיסקציה המצופה באגרוז ב-3/4 NAM טרי והעבירו את העוברים לצלחת הדיסקציה כאשר הצד הגבי פונה כלפי מעלה.

כעת, העבירו נתח (explant) של כיפה בעירה (animal cap) שעבר ר-אגרגציה לצלחת הדיסקציה, ואפשרו לנתח לשקוע לאט לתוך הצלחת בעזרת כוח המשיכה ברגע שקצה הפיפטה חדר את פני השטח של ה-NAM. לאחר מכן, תחת מיקרוסקופ סטריאואופטי, השתמשו בפינצטה מעוגלת כדי להחזיק את העובר במקומו, ובמקביל השתמשו במחט טונגסטן כדי לבצע חתך בלוח העצבי עבור הנתח. גזרו חתיכה קטנה מנתח כיפת בעירה שעבר ר-אגרגציה באמצעות פינצטה מעוגלת וסכין גב (eyebrow knife).

השתמשו בפיסת הרקמה כדי לקבוע את גודל פיסת השתיל (explant) עבור ההשתלה. איור זה מציג צינורות עצביים קדמיים של X laevis ו-X tropicalis המופרסים (flat-mounted) כפי שהודגם זה עתה בשלבים 30, 32 ו-35 לאחר היברידיזציה כפולה של NC2 בשיטת whole mount. כפי שנראה בתמונות אלו, ביטוי של sonic hedgehog של xenopus מזוהה בתאים שנמצאים במגע עם חרוזיים שהושרו במדיום מותנה (conditioned medium) שנוסף לו הקצה הסופי של הגן sonic hedgehog, אך לא בתאים שנמצאים במגע עם חרוזיים שטופלו במדיום בקרה.

לאחר דיסוציאציה ורי-אגרגציה כפי שהודגם כעת, אקספלנטים אלו עם תאי כיפה אנימלית שעברו אנטריוריזציה עורבבו עם תאי כיפה אנימלית שעברו אנטריוריזציה ומבטאים Otx2. כפי שניתן לראות, תאים אלו המבטאים Otx2 לא התנתקו מהתאים שאינם מבטאים Otx2. שני סוגי התאים התערבבו בחופשיות לאורך כל האקספלנט.

לעומת זאת, בנתחים שבהם תאים המבטאים Otx2 עורבבו עם BAR HL-2, Otx2 ותאים המבטאים IRX3, התאים המבטאים מספר גנים יצרו רقعות קוהזיביות שלא התפשטו באופן אחיד בתוך הנתח שעבר ר-אגרגציה. כאשר הושתלו בלוחית העצבית הקדמית של עוברי x laevis כפי שהודגם זה עתה, נתחים מעורבבים המורכבים מתאים המבטאים במשותף BAR HL-2, Otx2 ו-IRX3 שעורבבו עם תאים המבטאים N-terminus sonic hedgehog, הראו ביטוי אנדוגני של sonic hedgehog והיפרדו מהתאים האפיתליאליים העצביים הקדמיים. לעומת זאת, כאשר נתחים מעורבבים המורכבים מתאים המבטאים Otx2 ו-N-terminus sonic hedgehog הושתלו בלוחית העצבית של x laevis, התאים המושתלים לא ביטאו sonic hedgehog ולא היפרדו משכניהם.

לאחר השליטה בטכניקה, השתלת נתח של כיפת החי (animal cap explant) על לוחות עצביים עובריים יכולה להתבצע בשעתיים עד שלוש שעות, בהתאם למספר העוברים המושתלים. זוהי טכניקה חסונה מאוד ומספקת מאוד. בעת ביצוע הליך זה, חשוב להיות זהירים ביותר לגבי זיהומים חיידקיים ופטריות.

בעקבות הליכי ההשתלה, ניתן לבצע שיטות נוספות, כגון היברידיזציה באתר (in situ hybridization) של דגימות שלמות, כדי לעקוב אחר הגורל וההתנהגות של התאים המשתלים. תוכניות ההתפתחות העומדות בבסיס האורגנוגנזה של צינור העצבים הן שמורות במידה רבה, במיוחד בחולייתנים. לפיכך, מידע שנרכש בדו-מינתיים קידם את הבנתנו לגבי התהליכים התאיים והמולקולריים העומדים בבסיס התפתחות חולייתנים.