Name: כמו תא גזע Xenopus Explants העובריים לחקר תכונות המוקדמות עצבי התפתחותית במבחנה ו In vivo (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: חקור מנגנוני פיתוח עצבי מוקדמים באמצעות ניתוחי גג בלסטוצל וכובע חייתי של Xenopus laevis. שיטות אלו מאפשרות חקר תהליכים תאיים ומולקולריים בתנאי מבחנה ובעובר חי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחבר מודה להוגו ז'ורבר-ג'סלין, מריון ואסף ואן הלן מונסורו-בורק על עזרתם ועצתם, ולמתקן בעלי החיים של מכון קירי. המחבר מודה לפול ג'ונסון על עבודת העריכה של כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי המרכז הלאומי למחקר מדעי (CNRS UMR8197, INSERM U1024) ועל ידי מענקים מ"האגודה למחקר על הסרטן" (ARC 4972 ו-ARC 5115; FRC DOC20120605233 ו-LABEX Memolife) וקרן פייר ז'יל דה ז'אן (FPGG0039).

<ol><li>Nieuwkoop, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IIB%2C+Pattern+formation+in+the+developing+central+nervous+system+%28CNS%29+of+the+amphibians+and+birds+%28English%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Koninklijke+Nederlandse+Akademie+van+Wetenschappen%22%5BJournal%5D)">IIB, Pattern formation in the developing central nervous system (CNS) of the amphibians and birds (English).</a> Proceedings of the Koninklijke Nederlandse Akademie van Wetenschappen. 94, 121-127 (1991).</li>
<li>Nieuwkoop, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neural+induction+process%3B+its+morphogenetic+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The neural induction process; its morphogenetic aspects.</a> Int J Dev Biol. 43, 615-623 (1999).</li>
<li>Harland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Neural induction.</a> Curr Opin Genet Dev. 10, 357-362 (2000).</li>
<li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSive%2C+HL+%22Early+development+of+Xenopus+laevis+%3A+a+laboratory+manual%22">Early development of Xenopus laevis : a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2000).</li>
<li>Hoppler, S., Vize, P. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHoppler%2C+S+%22Xenopus+protocols+%3A+post-genomic+approaches%22">Xenopus protocols : post-genomic approaches</a>. Hoppler, S., Vize, P. D. , Humana Press; Springer. New York. (2012).</li>
<li>Franklin Hughes, W., La Velle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+early+tectal+lesions+on+development+in+the+retinal+gonglion+cell+layer+of+chick+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">The effects of early tectal lesions on development in the retinal gonglion cell layer of chick embryos.</a> J Comp Neurol. 163, 265-283 (1975).</li>
<li>Theveneau, E., Mayor, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beads+on+the+run%3A+beads+as+alternative+tools+for+chemotaxis+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Beads on the run: beads as alternative tools for chemotaxis assays.</a> Methods Mol Biol. 769, 449-460 (2011).</li>
<li>Juraver-Geslin, H. A., Gomez-Skarmeta, J. L., Durand, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+conserved+barH-like+homeobox-2+gene+barhl2+acts+downstream+of+orthodentricle-2+and+together+with+iroquois-3+in+establishment+of+the+caudal+forebrain+signaling+center+induced+by+Sonic+Hedgehog%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The conserved barH-like homeobox-2 gene barhl2 acts downstream of orthodentricle-2 and together with iroquois-3 in establishment of the caudal forebrain signaling center induced by Sonic Hedgehog.</a> Dev Biol. 396, 107-120 (2014).</li>
<li>Green, J. B., New, H. V., Smith, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responses+of+embryonic+Xenopus+cells+to+activin+and+FGF+are+separated+by+multiple+dose+thresholds+and+correspond+to+distinct+axes+of+the+mesoderm%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Responses of embryonic Xenopus cells to activin and FGF are separated by multiple dose thresholds and correspond to distinct axes of the mesoderm.</a> Cell. 71, 731-739 (1992).</li>
<li>Wallingford, J. B., Ewald, A. J., Harland, R. M., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling+during+convergent+extension+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling during convergent extension in Xenopus.</a> Curr Biol. 11, 652-661 (2001).</li>
<li>Kiecker, C., Niehrs, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+morphogen+gradient+of+Wnt%2Fbeta-catenin+signalling+regulates+anteroposterior+neural+patterning+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22DEVELOPMENT%22%5BJournal%5D)">A morphogen gradient of Wnt/beta-catenin signalling regulates anteroposterior neural patterning in Xenopus.</a> DEVELOPMENT. 128, 4189-4201 (2001).</li>
<li>Wilson, P. A., Hemmati-Brivanlou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+epidermis+and+inhibition+of+neural+fate+by+Bmp-4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Induction of epidermis and inhibition of neural fate by Bmp-4.</a> Nature. 376, 331-333 (1995).</li>
<li>Afouda, B. A., Hoppler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+explants+as+an+experimental+model+system+for+studying+heart+development%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+cardiovascular+medicine%22%5BJournal%5D)">Xenopus explants as an experimental model system for studying heart development.</a> Trends in cardiovascular medicine. 19, 220-226 (2009).</li>
<li>Afouda, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem-cell-like+embryonic+explants+to+study+cardiac+development%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Stem-cell-like embryonic explants to study cardiac development.</a> Methods Mol Biol. 917, 515-523 (2012).</li>
<li>Milet, C., Monsoro-Burq, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+Xenopus+laevis+neural+crest+for+in+vitro+explant+culture+or+in+vivo+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Dissection of Xenopus laevis neural crest for in vitro explant culture or in vivo transplantation.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. , (2014).</li>
<li>Milet, C., Maczkowiak, F., Roche, D. D., Monsoro-Burq, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pax3+and+Zic1+drive+induction+and+differentiation+of+multipotent%2C+migratory%2C+and+functional+neural+crest+in+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Pax3 and Zic1 drive induction and differentiation of multipotent, migratory, and functional neural crest in Xenopus embryos.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 5528-5533 (2013).</li>
<li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNieuwkoop%2C+PD+%22Normal+table+of+Xenopus+laevis+%28Daudin%29%3A+a+systematical+and+chronological+survey+of+the+development+from+the+fertilized+egg+till+the+end+of+metamorphosis%22">Normal table of Xenopus laevis (Daudin): a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis</a>. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. , Garland Pub. New York. (1994).</li>
<li>Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization%3A+an+improved+whole-mount+method+for+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos.</a> Methods Cell Biol. 36, 685-695 (1991).</li>
<li>Turner, D. L., Weintraub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+achaete-scute+homolog+3+in+Xenopus+embryos+converts+ectodermal+cells+to+a+neural+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Expression of achaete-scute homolog 3 in Xenopus embryos converts ectodermal cells to a neural fate.</a> Genes Dev. 8, 1434-1447 (1994).</li>
<li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removing+the+Vitelline+Membrane+from+Xenopus+laevis+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+protocols%22%5BJournal%5D)">Removing the Vitelline Membrane from Xenopus laevis Embryos.</a> CSH protocols. , (2007).</li>
<li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+Cap+Isolation+from+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+protocols%22%5BJournal%5D)">Animal Cap Isolation from Xenopus laevis.</a> CSH protocols. , (2007).</li>
<li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryo+dissection+and+micromanipulation+tools%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+protocols%22%5BJournal%5D)">Embryo dissection and micromanipulation tools.</a> CSH protocols. , (2007).</li>
<li>Wilson, S. W., Houart, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+Early+Steps+in+the+Development+of+the+Forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Review: Early Steps in the Development of the Forebrain.</a> Developmental Cell. 6, 167-181 (2004).</li>
<li>Juraver-Geslin, H. A., Durand, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+development+of+the+neural+plate%3A+new+roles+for+apoptosis+and+for+one+of+its+main+effectors+caspase-3%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Early development of the neural plate: new roles for apoptosis and for one of its main effectors caspase-3.</a> Genesis. 53, 203-224 (2015).</li>
<li>Heasman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning+the+early+Xenopus+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Patterning the early Xenopus embryo.</a> Development. 133, 1205-1217 (2006).</li>
<li>Rubenstein, J. L., Martinez, S., Shimamura, K., Puelles, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+embryonic+vertebrate+forebrain%3A+the+prosomeric+model%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The embryonic vertebrate forebrain: the prosomeric model.</a> Science. 266, 578-580 (1994).</li>
<li>Puelles, L., Rubenstein, J. L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forebrain+gene+expression+domains+and+the+evolving+prosomeric+model%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Forebrain gene expression domains and the evolving prosomeric model.</a> Trends in Neurosciences. 26, 469-476 (2003).</li>
<li>Martinez-Ferre, A., Martinez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+regionalization+of+the+diencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+In+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Molecular regionalization of the diencephalon.</a> Frontiers In Neuroscience. 6, 73-73 (2012).</li>
<li>Scholpp, S., Lumsden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+Building+a+bridal+chamber%3A+development+of+the+thalamus%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Review: Building a bridal chamber: development of the thalamus.</a> Trends in Neurosciences. 33, 373-380 (2010).</li>
<li>Coffman, C., Harris, W., Kintner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xotch%2C+the+Xenopus+homolog+of+Drosophila+notch%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Xotch, the Xenopus homolog of Drosophila notch.</a> Science. 249, 1438-1441 (1990).</li>
<li>Pera, E. M., Acosta, H., Gouignard, N., Climent, M., Arregi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+signals%2C+gradient+formation+and+regional+specificity+in+neural+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Active signals, gradient formation and regional specificity in neural induction.</a> Exp Cell Res. 321, 25-31 (2014).</li>
<li>Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+induction%3A+old+problem%2C+new+findings%2C+yet+more+questions%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Neural induction: old problem, new findings, yet more questions.</a> Development. 132, 2007-2021 (2005).</li>
<li>Juraver-Geslin, H. A., Ausseil, J. J., Wassef, M., Durand, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barhl2+limits+growth+of+the+diencephalic+primordium+through+Caspase3+inhibition+of+beta-catenin+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Barhl2 limits growth of the diencephalic primordium through Caspase3 inhibition of beta-catenin activation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 2288-2293 (2011).</li>
<li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociation+and+Reaggregation+of+Xenopus+laevis+Animal+Caps%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+protocols%22%5BJournal%5D)">Dissociation and Reaggregation of Xenopus laevis Animal Caps.</a> CSH protocols. , (2007).</li>
<li>Harland, R. M., Grainger, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+research%3A+metamorphosed+by+genetics+and+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Xenopus research: metamorphosed by genetics and genomics.</a> Trends Genet. 27, 507-515 (2011).</li>
<li>Beccari, L., Marco-Ferreres, R., Bovolenta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+logic+of+gene+regulatory+networks+in+early+vertebrate+forebrain+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">The logic of gene regulatory networks in early vertebrate forebrain patterning.</a> Mech Dev. 130, 95-111 (2013).</li>
<li>Pani, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ancient+deuterostome+origins+of+vertebrate+brain+signalling+centres%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ancient deuterostome origins of vertebrate brain signalling centres.</a> Nature. 483, 289-294 (2012).</li>
<li>Holland, L. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+bilaterian+central+nervous+systems%3A+a+single+origin%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Evodevo%22%5BJournal%5D)">Evolution of bilaterian central nervous systems: a single origin?</a> Evodevo. 4, 27(2013).</li>
<li>Pratt, K. G., Khakhalin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+human+neurodevelopmental+disorders+in+the+Xenopus+tadpole%3A+from+mechanisms+to+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+models+%26+mechanisms%22%5BJournal%5D)">Modeling human neurodevelopmental disorders in the Xenopus tadpole: from mechanisms to therapeutic targets.</a> Disease models & mechanisms. 6, 1057-1065 (2013).</li>
<li>Sasai, Y., Ogushi, M., Nagase, T., Ando, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bridging+the+gap+from+frog+research+to+human+therapy%3A+a+tale+of+neural+differentiation+in+Xenopus+animal+caps+and+human+pluripotent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%2C+growth+%26+differentiation%22%5BJournal%5D)">Bridging the gap from frog research to human therapy: a tale of neural differentiation in Xenopus animal caps and human pluripotent cells.</a> Development, growth & differentiation. 50, s47-s55 (2008).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

התפתחות עצבית היא בניצוחו של גומלין מורכב בין תוכניות סלולריות התפתחותיים ואותות מהרקמות הסובבות (נבדקו ב3,31,32). כאן אנו מתארים קבוצה של פרוטוקולים שניתן להשתמש בX. laevis עובר לחקור חיצוני וגורמים פנימיים מעורבים בקביעת גורל עצבית והמורפוגנזה עצבית במבחנת in vivo. פרוטוקולים אלה יכולים לשמש ככזה על X. עוברי tropicalis, לעומת זאת X. עוברי tropicalis ארבע פעמים קטנות יותר אז X. laevis עובר. שני המל...

מערכת העצבים של בעלי החוליות עולה מהצלחת העצבית כשכבת אחידה של תאי neuroepithelial. הבנה כיצד תוכניות התפתחותיות מושרות, מקודדות, והוקמו במהלך אזורית של הצלחת העצבית היא, כיום, מטרה עיקרית בביולוגיה התפתחותית. בהשוואה למערכות אחרות, עובר Xenopus ניסוי נוח הוא מודל של בחירה לניתוח שלבים מוקדמים של התפתחות עצבית 1,2. זה קל להשיג מספר גדול של עוברים, ופיתוח חיצוני נותן גישה לצעדים הראשונים של neurulation 3. כלים רבים זמינים כדי לתפעל באופן ניסיוני Xenopus laevis (laevis X.) התפתחות עוברית. מיקרו הזרקה של mRNAs או morpholinos (MO), כוללים שיטות פעולה מושרה, יחד עם כלים ביוכימיים ותרופתיים, מאפשר מבוקר רווח של פונקציה (GOF) ואובדן התפקוד (LOF) ושינוי ספציפי של מסלולי איתות 4,5. בלההאאקטודרם גג stocoel, הממוקם סביב קוטב החיה של blastula, או עובר gastrula בשלב מוקדם מאוד, ומכונה &quot;בעלי החיים קאפ &#39;(AC), הוא מקור לתאי pluripotent שניתן לתכנת על ידי מניפולציה של ביטוי גנים לפני explants הכנה. בכתב יד זה הם פרוטוקולים מפורטים לשימוש X. explants laevis AC לבדוק במבחנה ובמנגנונים מולקולריים vivo ותהליכים תאיים התפתחות עצבית בסיסית. טכניקה מוצגת, המאפשרת תצפית יפה של דפוסי ביטוי גנים בצינור עצבי ראשן צפרדעים, צעד ראשוני בזיהוי רמזי נחישות גורל. בעוד התצפית של רקמות רכוב שטוחות נפוצה במחקר של עובר חומוס 6, זה לא תואר כראוי בצפרדעים. מניפולציה של ביטוי גנים על ידי הזרקת mRNA או MO סינטטיים ללסטומרים של 2 או 4 עובר שלב תא מאפשרת תכנות של ACexplants 4. לדוגמא עיכוב של מסלול חלבון העצם המוךפו&quot;גנטי (BMP) על ידי ביטוי של אנטי-BMP גורם הבחור!, נותן זהות עצבית לתאי AC 3. הפרוטוקול מפורט לביצוע חשיפה מבוקר זמן ומקומי של explants AC לרמזים חיצוניים באמצעות מגע ישיר עם חרוז שרף אניוני. לבסוף טכניקה מתוארת לבדיקת תכונות ההתפתחותי של אבות עצביים in vivo על ידי השתלה של explants המעורב הוכן מהתאים נפרדים מתוכנת ניתקו וקשורים-מחדש. עובר הצפרדע הוא מודל רב עוצמה כדי לחקור את ההתפתחות עצבית חוליות מוקדמות. שילוב מניפולציה של ביטוי גנים לexplant תרבויות במבחנה מספק מידע חשוב בחקר האזורי neuroepithelium, התפשטות, והמורפוגנזה 7-12. תכנות של explants AC מותר פיתוח של לב פונקציונלי vivo לשעבר 13,14. השימוששל explant השתלת 15 הובילו לזיהוי של בורר תעתיק המינימלי התרמה תכנית בידול הרכס העצבי 16. Limitans Zona intrathalamica (ZLI) הוא מרכז איתות שמפריש סוניק קיפוד (ששש) כדי לשלוט על הצמיחה ואזורית של המוח הקדמי הזנב. כאשר נחשפו ברציפות שלשש, תאי neuroepithelial coexpressing גני שלושה שעתוק גורם - כמו-barH homeobox-2 (barhl2), orthodenticle-2 (otx2) וIroquois-3 (irx3) - רכישת שני מאפיינים של תא ZLI: הסמכות ל להביע את ששש, ואת היכולת להפריד מתאי צלחת עצביים קדמי. כמערכת מודל, האינדוקציה של גורל ZLI לתאי neuroepithelial יוצג 8. פרוטוקולים אלה מכוונים למתן וכלים פשוטים, זולים, יעילים לביולוגים התפתחותיים וחוקרים אחרים לחקור את MEC הבסיסיhanisms של התנהגויות תא עצביות מרכזיות. פרוטוקולים אלה הם מגוונים מאוד ומאפשרים החקירה של מגוון גדול של רמזי נחישות עצביים חיצוניים ופנימיים. זה מאפשר לטווח ארוך בניתוח vivo של מחויבות עצביות שושלת, אינטראקציות אינדוקטיביים והתנהגויות תא.

<table><tbody><tr><td>פרפורמלדהיד</td><td>VWR</td><td>&nbsp; 20909.290</td><td></td></tr><tr><td>חרוזי שרף חילופי אניונים</td> רעילים <td>Biorad</td><td>140- 1231</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר&nbsp;</td><td>SIGMA</td><td>A-7888</td><td>לתרבית של כמוסה מן החי pH 7.6</td></tr><tr><td>Gentamycine&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>15751-045&nbsp;</td><td>אנטיביוטי</td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין</td><td>SIGMA</td><td>A7906</td><td>&nbsp; להכנת חרוזים</td></tr></tbody></table>

כמו תא גזע<em&gt; xenopus</em&gt; explants העובריים לחקר תכונות המוקדמות עצבי התפתחותית<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; in vivo</em

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

הבנת התוכניות הגנטיות העומדות בבסיס ההתפתחות העצבית היא מטרה חשובה של ביולוגיה התפתחותית ותאי גזע. בבלסטולה הדו-חיים, תאים מגג הבלסטוקואל הם פלוריפוטנטיים. ניתן לבודד תאים אלה, ולתכנת אותם ליצור רקמות שונות באמצעות מניפולציה של ביטוי גנים או אינדוקציה על ידי מורפוגנים. בכתב יד זה מתוארים פרוטוקולים לשימוש באקספלנטים של Xenopus laevis blastocoel explants כמערכת בדיקה לחקירת תכונות מפתח in vivo ו-in vitro של התפתחות עצבית מוקדמת. פרוטוקולים אלה מאפשרים לחקור רכישת גורל, התנהגויות נדידת תאים ותכונות אוטונומיות ולא אוטונומיות של תאים. ניתן לגדל את האקספלנטים של גג הבלסטוקואל במדיום מוגדר ללא סרום ולהשתיל אותם בעוברים מארחים. השתלה זו בעובר מאפשרת לחקור את מחויבות השושלת ארוכת הטווח, התכונות האינדוקטיביות והתנהגות התאים המושתלים in vivo. ניתן לנצל בדיקות אלה כדי לחקור מנגנונים מולקולריים, תהליכים תאיים ורשתות ויסות גנים העומדים בבסיס ההתפתחות העצבית. בהקשר של רפואה רגנרטיבית, בדיקות אלו מספקות אמצעי ליצירת סוגי תאים שמקורם בעצבים במבחנה שניתן להשתמש בהם בבדיקת תרופות.

בהתבסס על שיקולים מורפולוגיים במינים שונים, מניפולציות עובריות, ואת דפוס הביטוי של גני רגולציה, מודל רעיוני גורס כי הצלחת העצבית מחולקת למגזרים רוחביים ואורך המגדירים רשת התפתחותית יצירת שדות histogenic מובחנים. בצלחת העצבית, primordia של המוח הקדמי, המוח התיכון, למוח האחורי וחוט השדרה כל כבר הוקם לאורך ציר Antero-אחורי (AP) במהלך gastrulation (שנסקר ב23-25). במהלך neurulation, ניתן לאתר שדות histogenic כתחומים מוגבלים במרחב של ביטוי גני...

בעוברי קסנופוס, תאים מגג הבלסטוקואל הם פלוריפוטנטיים וניתן לתכנת אותם ליצירת רקמות שונות. כאן, אנו מתארים פרוטוקולים לשימוש בצמחי גג בלסטוקואל דו-חיים כמערכת בדיקה לחקירת תכונות מפתח in vivo ו-in vitro של התפתחות עצבית מוקדמת.

כמו תא גזע<em&gt; Xenopus</em&gt; Explants העובריים לחקר תכונות המוקדמות עצבי התפתחותית<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; In vivo</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא להשתמש בבידודים (explants) של גג הבלסטוקוול או של הכובע האנימלי של x laevis לבחינת המנגנוסים המולקולריים והתהליכים התאיים העומדים בבסיס ההתפתחות העצבית in vitro ו-in vivo. שיטות אלו יכולות לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחומי הביולוגיה ההתפתחותית וביולוגיית תאי הגזע בנוגע לרכישת גורל תאי, נדידה של תאים, והתכונות האוטונומיות והלא-אוטונומיות של תאים עצביים. הטכניקות המוצגות מספקות כלים פשוטים, זולים, ורסטיליים ויעילים לחקר המנגנונים הבסיסיים של התנהגויות מפתח של תאים עצביים.בדיקות אלו מאפשרות לבחון גורמים קובעי גורל עצבי עבור תכנות מחדש של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים והיווצרות בוגרת של סוגי תאים ממקור עצבי לסריקה מעמיקה יותר. באופן כללי, אנשים שאינם מכירים את השיטה זו יתקלו בקושי שכן הטכניקות דורשות מיומנות ידנית. הרעיון לשיטות אלו עלה בדעתי לראשונה כאשר חשבתי על ניתוח התנהגות של הפרדת תאים.כדי לבצע הרכבה שטוחה (flat-mount) של צינור עצבי קדמי של xenopus laevis, השתמשו בפיפטת העברה פלסטית כדי להעביר עובר שקובע, הותייבש והורט מחדש אל צלחת פטרי של 60 מילימטר מלאה עד שפתה ב-PBT. לאחר מכן, הכניסו זוג פינצטות עדינות בין העיניים לבין הצינור העצבי בגובה גבעול העין והפרידו את העיניים. לאחר מכן, הכניסו בזהירות את הפינצטות מתחת לאקטודרמה המכסה את הצינור העצבי מאחורי הראש וקלפו בעדינות את האקטודרמה.לאחר ביצוע תיוג היברידיזציה NC2 המתאים, העבירו את העובר לצלחית פטרי חדשה בנפח 60 מיליליטר מלאה ב-PBT, והשתמשו בפינצטה עדינה כדי לבודד באופן גס את צינור העצבים הקדמי מהעובר. לאחר מכן, הסירו בזהירות את הנוטוכורד (chorda dorsalis) המחובר באופן רופף מתחת לצינור העצבים. במידת הצורך, הסירו גם את שלפוחיות השמיעה (otic vesicles) ואת שאר חלקי המזודרם.לאחר שכל נספחי צינור העצבים נכרתו, הפרידו את צינור העצבים הקדמי מהעובר. לאחר מכן, העבירו את צינור העצבים המבודד לשפופרת קונוסית של 1.5 milliliter המלאה ב-50%glycerol ו-PBS לטיפול למשך לילה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר טיפול שני למשך לילה ב-90%glycerol, העבירו את צינור העצבים לזכוכית מיקרוסקופ בכמות קטנה של glycerol והשתמשו במחטי Tungsten כדי ל dissection של צינורות העצבים לאורך קווי האמצע הגביים והבטני.לאחר מכן, השתמשו בטבעות חיזוק המכוסות בזכוכית כיסוי כדי להרכיב את שני צדדיו של צינור העצבים ב-90% glycerol וב-PBS. כדי להכין חרוזים להשראת מנחלי כיפת החי (animal cap explants), השתמשו במיקרופיפיה P200 כדי להעביר חצי ממנת חרוזי שרף שעברו טיפול ב-BSA לשפופרת חדשה של 1.5 מיליליטר. לאחר מכן, החליפו את המים המזוקקים הסטריליים בשפופרת החדשה ב-200 מיקרוליטר של מצע המכיל את המולקולה הניסיונית רצויה למשך שעתיים בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.בסיום הדגירה, העבירו את העוברים בשלב הבלסטולה או בשלב מוקדם מאוד של הגסטרולה ל-PBS עם סידן ומגנזיום בתוספת 0.2% BSA. לאחר מכן, תחת מיקרוסקופ סטריאומיקרוסקופ, צבטו את קרום הוויטלין בעזרת זוג פינצטות אחד, והשתמשו בזוג פינצטות שני כדי לקלף לאט את הקרום מהצד הווגטלי של העובר, תוך הקפדה לא לפגוע בצד האנימלי. לאחר מכן, בעזרת פינצטות עדינות, גזרו ריבוע קטן מהקטב האנימלי של כל עובר.באמצעות טיפ פפטה מצופה BSA, העבירו את הכובעים לבארים נפרדות של פלטת Terasaki רב-בארים ב-0.5X modified Barth's saline, כאשר הצד של החיה הפיגמנטית נמצא במגע עם התחתית העגולה של הבאר. בעזרת מיקרופפטה P20, בחרו את החרוזים בצבע הוורוד הכהה ביותר מתוך מבחנת הטיפול והניחו חרוז אחד על כל כובע, תוך שימוש בפינצטה למרכוז החרוזים על הכובעים. לאחר הנחת החרוז האחרון, הניחו את הפלטה מעל ניירות ספוגים במים וכסו אותה במכל פלסטיק לפני הדגירה.כדי להכין תרביות של קפ פולו (animal cap) מופרדות ומאוחדות מחדש, בודדו 15 עד 30 קפ פולו כפי שהודגם כעת. השתמשו בפינצטה עדינה כדי לגזור ריבוע קטן של רקמה מהקטבים העליונים (animal poles). העבירו את הקפ פולו לבאר מצופה אגרוז ג'ל ומלאה בתמיסת סלין Holtfreter נטולת סידן, כאשר הצדדים הפיגמנטריים פונים כלפי מעלה.לאחר מספר דקות, ניתן להבחין בפירוק (disaggregation). השתמשו בפינצטה עדינה כדי להפריד את השכבות הפיגמנטיות משאר הרקמה. לאחר מכן, השתמשו במיקרופיפט P20 כדי להסיר את הפיגמנט.כאשר רוב השכבות הפיגמנטיות הוסרו והתאים התנתקו לחלוטין, סובב את הצלחת כדי לרכז את התאים והשתמש במיקרופיפט P1000 כדי להסיר כמה שיותר מהתווך, תוך הקפדה לא לגעת בתאים. לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד של תמיסת מלח Holtfreter עם סידן לבאר. העבר את כיפות החי (animal caps) המנותקות לשפרוֹרת של 1.5 מיליליטר.לאחר סבב הצנטריפוגה של התאים, השתמש במיקרופיפט P1000 כדי להסיר בזהירות את הנוזל העליון (supernatant) ותלה את המשקע (pellet) ב-20 µL של תמיסת מלח Holtfreter עם סידן. אפשר לתאים להתאגד מחדש למשך שלוש עד שש שעות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הוסף לאט 1 mL של 3/4 NAM כדי לנתק בזהירות את התרביות (explants) מהקרקעית של המבחנה, והשתמש בפיפטת העברה מפלסטיק כדי לחלק את התרביות לפלטות בודדות שאינן מצופות.כדי להשתיל רקמות של כיפת בעלי חיים (animal cap) על לוחות עצביים של xenopus laevis, יש ראשית לצפות צלחות פטרי בקוטר 60 מילימטר ב-3% agarose וב-3/4 NAM, וליצור בהן חורים קטנים. לאחר מכן, העבירו עוברים בשלב נוירולת מוקדם ל-PBS עם סידן ומגנזיום בתוספת 0.2% BSA לצורך הסרת הקרום הוויטליני. לאחר מכן, מלאו את צלחת הדיסקציה המצופה באגרוז ב-3/4 NAM טרי והעבירו את העוברים לצלחת הדיסקציה כאשר הצד הגבי פונה כלפי מעלה.כעת, העבירו נתח (explant) של כיפה בעירה (animal cap) שעבר ר-אגרגציה לצלחת הדיסקציה, ואפשרו לנתח לשקוע לאט לתוך הצלחת בעזרת כוח המשיכה ברגע שקצה הפיפטה חדר את פני השטח של ה-NAM. לאחר מכן, תחת מיקרוסקופ סטריאואופטי, השתמשו בפינצטה מעוגלת כדי להחזיק את העובר במקומו, ובמקביל השתמשו במחט טונגסטן כדי לבצע חתך בלוח העצבי עבור הנתח. גזרו חתיכה קטנה מנתח כיפת בעירה שעבר ר-אגרגציה באמצעות פינצטה מעוגלת וסכין גב (eyebrow knife).השתמשו בפיסת הרקמה כדי לקבוע את גודל פיסת השתיל (explant) עבור ההשתלה. איור זה מציג צינורות עצביים קדמיים של X laevis ו-X tropicalis המופרסים (flat-mounted) כפי שהודגם זה עתה בשלבים 30, 32 ו-35 לאחר היברידיזציה כפולה של NC2 בשיטת whole mount. כפי שנראה בתמונות אלו, ביטוי של sonic hedgehog של xenopus מזוהה בתאים שנמצאים במגע עם חרוזיים שהושרו במדיום מותנה (conditioned medium) שנוסף לו הקצה הסופי של הגן sonic hedgehog, אך לא בתאים שנמצאים במגע עם חרוזיים שטופלו במדיום בקרה.לאחר דיסוציאציה ורי-אגרגציה כפי שהודגם כעת, אקספלנטים אלו עם תאי כיפה אנימלית שעברו אנטריוריזציה עורבבו עם תאי כיפה אנימלית שעברו אנטריוריזציה ומבטאים Otx2. כפי שניתן לראות, תאים אלו המבטאים Otx2 לא התנתקו מהתאים שאינם מבטאים Otx2. שני סוגי התאים התערבבו בחופשיות לאורך כל האקספלנט.לעומת זאת, בנתחים שבהם תאים המבטאים Otx2 עורבבו עם BAR HL-2, Otx2 ותאים המבטאים IRX3, התאים המבטאים מספר גנים יצרו רقعות קוהזיביות שלא התפשטו באופן אחיד בתוך הנתח שעבר ר-אגרגציה. כאשר הושתלו בלוחית העצבית הקדמית של עוברי x laevis כפי שהודגם זה עתה, נתחים מעורבבים המורכבים מתאים המבטאים במשותף BAR HL-2, Otx2 ו-IRX3 שעורבבו עם תאים המבטאים N-terminus sonic hedgehog, הראו ביטוי אנדוגני של sonic hedgehog והיפרדו מהתאים האפיתליאליים העצביים הקדמיים. לעומת זאת, כאשר נתחים מעורבבים המורכבים מתאים המבטאים Otx2 ו-N-terminus sonic hedgehog הושתלו בלוחית העצבית של x laevis, התאים המושתלים לא ביטאו sonic hedgehog ולא היפרדו משכניהם.לאחר השליטה בטכניקה, השתלת נתח של כיפת החי (animal cap explant) על לוחות עצביים עובריים יכולה להתבצע בשעתיים עד שלוש שעות, בהתאם למספר העוברים המושתלים. זוהי טכניקה חסונה מאוד ומספקת מאוד. בעת ביצוע הליך זה, חשוב להיות זהירים ביותר לגבי זיהומים חיידקיים ופטריות.בעקבות הליכי ההשתלה, ניתן לבצע שיטות נוספות, כגון היברידיזציה באתר (in situ hybridization) של דגימות שלמות, כדי לעקוב אחר הגורל וההתנהגות של התאים המשתלים. תוכניות ההתפתחות העומדות בבסיס האורגנוגנזה של צינור העצבים הן שמורות במידה רבה, במיוחד בחולייתנים. לפיכך, מידע שנרכש בדו-מינתיים קידם את הבנתנו לגבי התהליכים התאיים והמולקולריים העומדים בבסיס התפתחות חולייתנים.

stem-cell-like-xenopus-embryonic-explants-to-study-early-neural

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

הרקמה העוברית הדמיה בזמן אמת הוא מאתגר לאורך תקופות זמן ארוכות. כאן אנו מציגים assay לניטור שינויים הסלולר משנה הסלולר בחוט השדרה חומוס לתקופות ארוכות עם רזולוציה גבוהה במרחב ובזמן. טכניקה זו יכולה להיות מותאם לאזורים אחרים של מערכת העצבים בעובר המתפתח.

ברזולוציה גבוהה הדמיה חיה של התנהגות התא ב Neuroepithelium פיתוח

שליטה על ההתפשטות של תאי גזע הסומטיים היא גורם מרכזי פוגעות המחקר והשימוש בטיפול שלהם. כאן אנו מתארים מערכת באופן זמני להרחבת שליטה עצבית גזע תאים במהלך ההתפתחות ובגרות, אשר ניתן להשתמש כדי להגדיל את מספר הנוירונים שנוצרו במוח העכבר.

התרחבות של תאי גזע עצביים עובריים ומבוגרים על ידי<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation או הזרקת Stereotaxic ויראלי

תרבויות Explant עצביות מן<em&gt; Xenopus laevis</em

גורלו של תא עוברי אדם יכול להיות מושפע על ידי מולקולות ירושה ו / או על ידי אותות מתאים שכנים. ניצול מפות גורלו של עובר Xenopus שלב המחשוף, לסטומרים בודדים ניתן לזהות לתרבות בבידוד כדי להעריך את התרומה של מולקולות ירושה לעומת אינטראקציות תא סלולרי.

Explants Blastomere לבדיקת מחויבות גורל תא במהלך התפתחות עוברית

פרוטוקול זה מתאר הליך explant משופר...

לשעבר הרחם electroporation וexplants חצי כדור שלם: שיטה ניסיונית פשוטה למחקרים בהתפתחות קליפת מוח הקדומה

פרוטוקול זה מתאר כיצד לנתח פסגת premigratory גולגולת עצבית (NC) מneurulas laevis Xenopus. יכול להיות מצופה explants אלה בפיברונקטין ותרבית במבחנה, או מורכב בחזרה לעוברי מארח. טכניקה זו מאפשרת חקר המנגנונים של מעבר NC האפיתל לmesenchyme, הגירה, ובידול.

Dissection של<em&gt; Laevis Xenopus</em&gt; העצבי קרסט עבור<em&gt; במבחנה</em&gt; Explant תרבות או<em&gt; In vivo</em&gt; השתלות

עובר Xenopus laevis ממשיך להיות שימושי במיוחד בחקר ההתפתחות המוקדמת בשל גודלו הגדול וקלות המניפולציה שלו.   מסופק פרוטוקול פשוט לפרוטוקול הכלאה של הרכבה שלמה באתרו שניתן להשתמש בו בזיהוי איברים ספציפיים במערכת מודל זו.

הבנת organogenesis המוקדם שימוש פשוטה<em&gt; באתר</em&gt; הכלאת פרוטוקול ב<em&gt; Xenopus</em

מאמר זה מציג שיטה נוחה ומהירה המאפשר הדמיה אוכלוסיות תאים עצביים שונים במערכת העצבים המרכזית של עוברי Xenopus באמצעות מכתים immunofluorescent על ​​הסעיפים.

הערכת Neurogenesis יסודי<em&gt; Xenopus</em&gt; עוברים באמצעות Immunostaining

אנו מציגים פרוטוקול דו-חלקי המשלב הדמיה של סידן פלורסנט עם היברידיזציה באתרו, ומאפשר לניסויים לתאם דפוסים של פעילות הסידן עם פרופילי ביטוי גנים ברמה של תא אחד.

סידן פלואורסצנטי הדמיה ובעקבות היברידיזציה באתרו לאפיון עצבי בלתי מבשר בקספוס זריזה

explants blastoderm דגי זברה נוצרים על ידי בידוד תאים עובריים ממרכזי איתות אנדוגני בתוך העובר המוקדם, ומייצרים אשכולות תאים נאיביים יחסית מניפולציה בקלות ו ex vivoתרבית . מאמר זה מספק הוראות להכנת explants כאלה ומדגים את התועלת שלהם על ידי חקירת תפקידים עבור נודל איתות במהלך gastrulation.

דור של מסלקי בלסטודרם נאיביים מעוברי דגי זברה

חקור מנגנוני פיתוח עצבי מוקדמים באמצעות ניתוחי גג בלסטוצל וכובע חייתי של Xenopus laevis. שיטות אלו מאפשרות חקר תהליכים תאיים ומולקולריים בתנאי מבחנה ובעובר חי.

כמו תא גזע

גלה סרטונים נוספים