בנייה של גיליונות מודולרי Hydrogel לאדריכלות סלולרית 3D המוקטן מאקרו micropatterned

המטרה הכוללת של הליך זה היא להדגים את הייצור, המניפולציה וההרכבה הפשוטים של יריעות הידרוג'ל מודולריות למערכת תרבית תאים תלת מימדית. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הנדסת הרקמות כגון כיצד ליצור יותר רקמות מהונדסות פונקציונליות דמויות vivo עם מיקרו-סביבות מתורבתות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן ליצור מבני הידרוג'ל סלולרי ללא כל תוספת יקרה.

תנאי תרבית התאים התלת מימדיים יהיו תלויים בכל יריעת הידרוג'ל מודולרית. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על מבחנים מבוססי תאים משופרים ומחקרים ביולוגיים מכיוון שהטכניקה יכולה לספק גיאומטריות והרכב שונים של סביבות מיקרו ומקרו תאיות תלת מימדיות. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי מבחנים מבוססי תאים במבחנה, ניתן ליישם אותה גם על מערכת אחרת כגון פיגום להשתלה של מודל רקמה תלת מימדי.

התחל בהפקת דפוסי המיקרו-סקאלה הרצויים באמצעות טכניקות פוטוליתוגרפיה סטנדרטיות. הדוגמה המוצגת בסרטון זה תשתמש בתבנית רשת דמוית אונת כבד כמו זו המוצגת כאן. לאחר מכן שקלו 2.5 גרם PDMS ו -2.5 גרם תמיסת חומר הריפוי וערבבו היטב את הרכיבים.

הסר את הגז מהתמיסה בתא ואקום ולאחר מכן מורח את התמיסה המעורבת על פני המיקרו-תבנית של פרוסת הסיליקון באופן שווה בתוך צלחת יציקת נייר כסף. לאחר מכן, רפאו את ה-PDMS על ידי הנחת המנה על המשטח השטוח של צלחת מחוממת של 65 מעלות צלזיוס למשך 90 דקות. לאחר הריפוי, הסר את ה-PDMS מכלי היציקה וקילף אותו בזהירות מפרוסת הסיליקון.

חותכים את קצוות ה-PDMS ומניחים את החלק המעוצב על צלחת פטרי בקוטר 100 מילימטר כך שצד המיקרו-תבנית פונה כלפי מעלה. לאחר מכן, שטפו את ה-PDMS עם 70% אתנול, ואחריו מים מזוקקים, לעיקור ראשוני. לאחר מכן, יבש את ההתקנה לחלוטין במשך 10 דקות בתנור בחום של 65 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, הנח את תבנית ה-PDMS המיקרו-דפוסית לתוך מנקה פלזמה ונקה אותם למשך דקה אחת על מנת ליצור משטח הידרופילי. זה יקל על העמסת נוזלים מימיים. לאחר מכן מצפים את פני השטח של ה-PDMS ב-100 מיליליטר של תמיסת פעילי השטח המפורטת בטבלת החומרים.

דגרו את הדגימות על נדנדה במעבדה למשך שלוש שעות לפחות. לאחר מכן, שטפו את תמיסת פעילי השטח מתבניות ה- PDMS באמצעות מים סטריליים, וייבשו אותם לחלוטין בתנור בחום של 65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר מכן, עקרו כל תבנית מיקרו-דפוסית על ידי חשיפתה לקרינה אולטרה סגולה למשך 30 דקות.

התחל בתרבית תאי hepg2 בטכניקות סטנדרטיות. לאחר שהתאים מתכנסים ב-70% עד 80%, שטפו את התאים פעם אחת באמצעות PBS. לאחר מכן, קצרו את התאים על ידי הוספת מילילטר אחד של 05% טריפסין edta ודגירתם למשך ארבע דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

לאחר הניתוק, אספו את התאים בצינור צנטריפוגה וגלו אותם ב-250 גרם למשך שלוש דקות. הסר את הסופרנטנט ואז השהה מחדש את התאים במילילטר אחד של PBS. ספור את מספר התאים המבוזרים הבודדים ב-PBS באמצעות מונה תאים אוטומטי.

לאחר מכן, גלולה את התאים שוב ב -250 גרם למשך שלוש דקות. הסר את הסופרנטנט PBS והוסף מספיק תמיסת נתרן אלגינט של אחוז אחד לתאים כך שצפיפות הזריעה הסופית תהיה בין חמישה לעשרה מיליון תאים למילילטר. מערבבים את תמיסת התא בעדינות באמצעות פיפטה ולאחר מכן מדגרים את תרחיף ההידרוג'ל של התא באינקובטור לח של חמישה אחוז CO2 בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

בזמן שהתאים דוגרים, הניחו את תבניות ה-PDMS בתבנית מיקרו-דפוס לתוך מנקה פלזמה ונקו אותן למשך דקה אחת ב-85 וואט ליצירת משטח הידרופילי. מערבבים את תרחיף ההידרוג'ל של התא על ידי פיפטינג בעדינות למעלה ולמטה ולאחר מכן טען בהתמדה 7.2 מיקרוליטר מהמתלה בקצה המיקרו-תבנית בתבנית. לאחר מכן, ג'ל את תרחיף ההידרוג'ל של התא על ידי ייצור ערפל של המגיב הצולב עם מכשיר האדים בקצב של 250 מיליליטר לשעה וריסוס אותו על מבשר ההידרוג'ל למשך חמש דקות.

ודא שהליך זה מכסה את המשטח הטופוגרפי של תבנית ה-PDMS בטווח של חמישה סנטימטרים. לאחר תהליך הקישור הצולב, כבה את מכשיר האדים ומלא את תבנית ה-PDMS ב-PBS. בעזרת פיפטה של 200 מיקרוליטר, מחלקים PBS בעדינות סביב קצה יריעות ההידרוג'ל המוקשות על מנת לנתק כל אחד מההידרוג'לים.

לאחר מכן, הרם כל יריעת הידרוג'ל צפה, באמצעות קצה פיפטה חתוך קצה, 1,000 מיקרוליטר. העבירו כל יריעה של ההידרוג'ל לבארות בודדות של צלחת בת 12 בארות המכילה מיליטר אחד של DMEM מחומם מראש כך שהם יצופו על פני המדיה. תרבית התאים כך במשך שבוע אחד, והחלפת מדיום התרבית כל יומיים.

לאחר מכן, צור מסגרת PDMS, המכילה מבני עמודים בגובה 170 מיקרון במשטח התחתון כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה. במהלך הייצור, הניחו תבנית פוליקרבונט מיוחדת על פרוסת הסיליקון למסגרת ה-PDMS ליצירת מסגרת פנימית ברוחב של שמונה מילימטרים, גובה של תשעה מילימטרים ועומק של שני מילימטרים. לאחר העיקור, הנח את מסגרת ה-PDMS על רבע פיסת נייר סינון ניילון המונחת בצלחת פטרי בגודל 60 מילימטר.

הסר את יריעות ההידרוג'ל מהחממה והעביר את יריעות ההידרוג'ל המודולריות הראשונות לתוך החלק הפנימי של מסגרת ה-PDMS באמצעות קצה פיפטה של 1,000 מיקרוליטר בחיתוך קצה. יישר את קצה יריעת ההידרוג'ל המודולרית עם מסגרת ה-PDMS באמצעות קצה פיפטה ריק בנפח 200 מיקרוליטר. חזור על תהליך זה עם יריעות הידרוג'ל נוספות עד לקבלת ערימה של ארבע עד שש שכבות.

לאחר מכן, הסר את מדיום התרבות על ידי הזרמתו דרך מבני העמודים בתחתית מסגרת ה-PDMS. לאחר מכן, הוסף שני מיקרוליטר של תמיסת אלגינט של שני אחוזים בפינה אחת של המבנה הרב-שכבתי. בעזרת מכשיר אדים, רססו ערפל של המגיב הצולב בקצב של 250 מילליטר לשעה על המבנה הרב-שכבתי למשך שלושים שניות כדי לחבר את הקצוות של כל שכבה יחד.

לאחר מכן, שטפו את המבנה הרב-שכבתי בעדינות עם 400 מיקרוליטר DMEM והסר את מסגרת ה-PDMS באמצעות פינצטה. לאחר מכן, הוסף ארבעה מיליליטר נוספים של DMEM. נתק את המבנה הרב-שכבתי עם נייר הסינון על ידי ניגובו בעדינות עם מרים תאים ולאחר מכן השתמש בנייר סינון כדי להעביר אותו לצלחת בת שש בארות המכילה שלושה מיליליטר DMEM.

תרבית התאים בצורה צפה עם מבנה הידרוג'ל כפיגום סלולרי רב-קנה מידה בצלחת שש הבארות למשך שבוע לפחות. החליפו את מדיום התרבות כל יומיים. התוצאה של הרכבה שכבה אחר שכבה של יריעות הידרוג'ל דמויות אונת כבד מוצגת כאן, כאשר תאי קרצינומה של כבד אנושי בצבע ירוק ופיברובלסטים NIH-3T3 זוהרים באדום גודלו יחד בתרבית משותפת על רשת משולבת.

באמצעות הטכניקה המוצגת כאן, ניתן ליצור וריאציות דפוס רבות, כולל עמודים משושים, רשתות דקות, מערכים שלמים ומיקרו-סיבים מרובים דמויי מיקרו-מסרק בצורת מבנה הידרוג'ל דק בסדר גודל של 100 עד 200 מיקרומטר. מבנים אלה מספקים סביבת תרבית תלת-ממדית עשירה עבור סוגי תאים רבים ושונים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ליצור יריעות הידרוג'ל סלולריות להנדסה במערכות תרבית תלת מימד דמויות vivo מלמטה למעלה.