כימות התנהגות שחי דגים בתגובה לחשיפה אקוטית של נחושת מהימית באמצעות וידאו בסיוע מחשב דיגיטלי ניתוח תמונה

המטרה הכוללת של הליך זה היא להדגים כיצד לכמת תגובות התנהגותיות בחדקן לבן לחשיפה תת-קטלנית לנחושת מימית. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האקוטוקסיקולוגיה, כגון כיצד חשיפה תת-קטלנית למזהמים משפיעה על התנהגות השחייה של דגים. שיטה זו יכולה לספק מידע חשוב לשימור חדקן לבן.

ניתן ליישם אותו בקלות גם על מיני דגים אחרים, דו-חיים וחסרי חוליות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהתגובה רגישה מאוד, מספקת אינדיקציה מוקדמת לרעילות ורלוונטית להישרדות האורגניזם. בתחילה, שיטה זו עשויה להיות מאתגרת אם האדם אינו מכיר ביצוע מדידות התנהגותיות.

מי שתדגים את הפרוטוקול תהיה שותפתי לכתיבה הולי פוליס. ראשית, הכינו שני ליטר נחושת בדרגת ריאגנט מימי שני סולפט פנטהידרט. לאחר מכן, אזנו את מערכת הדילול ומיכלי החשיפה.

הנח את צינור היניקה ממתקן המזרק האוטומטי לתוך בקבוק תמיסת המלאי. לאחר מכן, הגדר את נפח הספייק של המשאבה האוטומטית למיליליטר אחד, והפעל את המדלל. המערכת מבצעת סדרת דילול של 50% של חמישה ריכוזים ובקרה.

באמצעות מפצל ארבע-כיווני, פתרונות אלה מועברים לארבעת תאי החשיפה המשוכפלים. לאחר מכן, הפעל את המשאבה לערכת הצ'ילר כדי לשמור על אמבט המים על 15 מעלות צלזיוס. כעת, באמצעות הטיימר האוטומטי על המדלל, הגדר אותו למחזור כל 30 דקות.

מפלס המים במיכלים נשמר על ידי ניקוז צינור עומד. הכן את תאי החשיפה על ידי הנחת חור של ארבעה סנטימטרים בצד, וכיסוי החור ברשת נירוסטה 30 מיקרון. הקפידו לבחור תאי חשיפה המכילים לפחות ליטר אחד של מים לכל 10 גרם דגים.

לדוגמה, חדקן לבן בן 89 יום שוקל כ-373 מיליגרם, ולכן ניתן לבדוק אותו בתא בגודל 28 סנטימטר על 13 נקודות חמישה סנטימטרים על 25 סנטימטר מרובע. בהתחלה, בנקודת האמצע ובסיום הניסוי, אסוף 24 דגימות תמיסת בדיקה של מיליליטר לניתוח כימי. השתמש בקשיות לגימה המחוברות למזרקי פלסטיק.

החלף את קש הלגימה במסנן פוליאתרסולפון נקודת אפס ארבע חמישה מיקרון, והוציאו ארבעה מיליליטר מי בדיקה דרך המסנן. השלך את המים האלה. לאחר מכן, סננו את 20 מיליליטר המים הנותרים לבקבוק פוליאתילן מנוקה בחומצה.

החמצת הדגימה עם 16 חומצה חנקתית מולרית ל-1% נפח בנפח. לאחר מכן ניתן לאחסן דגימות אלה עד שלושה חודשים. לאחר אישור חשיפות הבדיקה, מלאי שלושה חדקן בכל תא בדיקה משוכפל לכ-172 מיליגרם דגים לליטר תא.

אוספים את החידקן בעזרת רשת לא שוחקת, ומעבירים אותם לדלי קטן. בסך הכל, דרושים 144 דגים כדי לאסוף נתונים משישה פתרונות בדיקה. במהלך החשיפה של 96 שעות, אין להאכיל את הדגים.

יש לבצע תצפיות יומיות עקביות כדי לנקד תמותה והתנהגות חריגה. הבוקר הוא הזמן הטוב ביותר ביום לעשות זאת, ובאופן אידיאלי הצופה עיוור לתנאי הבדיקה. אובדן שיווי משקל מוגדר כחוסר יכולת של דגים לשמור על מיקום זקוף בתוך עמודת המים.

חוסר תנועה מוגדר כחוסר יכולת של דגים לנוע או לשחות אלא אם כן דוחפים אותם. רשום גם כל חריגה אחרת, כגון עייפות, היפראקטיביות, עלייה או ירידה בנשימה, שינויי צבע, רעידות, עוויתות, בטן נפוחה, מיקום בעמוד המים וכל דפוס שחייה חריג אחר. תמיד יש להסיר מיד דגים מתים.

בכל יום, מדוד גם את רמות החמצן המומס עם מד כף יד משתי דגימות מים. בתום 96 שעות החשיפה, הכינו סרטונים לניתוח התנהגות שחייה. מקם את זירת הבדיקה בתוך מיכל חשיפה.

הקפידו לבחור זירת בדיקה גדולה מספיק כדי שהדגים יוכלו לשחות בחופשיות. ישירות מעל כל זירת בדיקה, הגדר מצלמת וידאו כף יד על חצובה. כעת, מבין הדגים המטופלים, בחרו באופן אקראי עד שלושה ניצולים.

העבירו שלושה לזירת הבדיקה באמצעות רשת רשת קטנה. הניחו לדגים להתאקלם בזירה למשך כ-30 דקות. בזמן שהדגים מתאקלמים, מקדו את התמונה, צמצמו את עיוותי הסנוור ממים נעים, ומקסמו את הניגודיות של הדג על הרקע, והתאימו את התצוגה כך שהדג לא יהיה מוסתר.

לאחר שהדג מתאקלם, התחל את ההקלטה ואסוף שתי דקות של נתוני וידאו. לאחר צילום הסרטון, המתת חסד והשליכו את הדגים. לאחר המרת קבצי הווידאו לפורמט הדרוש לתוכנת הניתוח הדיגיטלי, פתח את תוכנת המעקב ובחר ניסוי ברירת מחדל חדש תחת האפשרות צור ניסוי חדש במסך הראשי.

מלא את ההנחיות ולחץ על אישור. לאחר מכן, עבור לאפשרות הגדרות הניסוי תחת הגדרה, ובחר מתוך קובץ וידאו תחת מקור וידאו. הגדר את מספר הזירות לאחת.

הגדר את מספר הנושאים בכל זירה לשלושה. לאחר מכן, בחר זיהוי נקודת מרכז תחת תכונות מעקב ובחר את היחידות הרצויות. כעת, תחת הגדרה, בחר באפשרות רשימת הניסיון ולחץ על הוסף סרטונים בחלק העליון של המסך.

בחר סדר אלפביתי מתיבת הדו-שיח. לחץ על עיון. נווט לתיקיה שבה נמצאים הסרטונים, סמן את הקבצים הרלוונטיים ולחץ על פתח.

כעת, לאחר בחירת קבצי הווידאו, המשך בהגדרת היקף הניסוי בתוכנה. ראשית, לחץ על הוסף משתנה בחלק העליון של המסך והזן ריכוז בתיבת התווית. הזן את ריכוז הנחושת במיקרוגרם לליטר בתיבת התיאור.

לאחר מכן, בחר מספרי מהרשימה הנפתחת עבור סוג. לחץ על תיבת הערכים המוגדרים מראש, ובחר באפשרות הגדר ערכים בודדים מתיבת הדו-שיח. הזן את הריכוזים המשמשים לניסוי, ולחץ על הוסף בין כל חיבור מספר.

לאחר מכן, בטל את הסימון באפשרות אפשר ערכים אחרים ולחץ על אישור. בחר גירסת ניסיון מהתפריט הנפתח בתיבת ההיקף. הזן את הריכוז המתאים לכל ניסוי בתיבות המצורפות.

לחץ/י על ״הוסף משתנה״ בראש המסך. הזן שכפל בתיבת התווית. הזן מספר שכפול בתיבת התיאור.

בחר מספרי מהרשימה הנפתחת עבור סוג. לאחר מכן, לחץ על תיבת הערכים המוגדרים מראש ובחר באפשרות הגדר ערכים בודדים מתיבת הדו-שיח. הזן אחד, שניים, שלושה וארבע, ובטל את הסימון באפשרות אפשר ערכים אחרים.

לאחר מכן, לחץ על אישור. כעת, בחר באפשרות הניסיון מהתפריט הנפתח בתיבת ההיקף. הזן את מספר השכפול המתאים עבור כל גירסת ניסיון.

המשימה הבאה היא להקים את חללי הזירה. התחל בבחירת הגדרות הזירה תחת לשונית ההגדרה, ותן שם להגדרה הראשונה כהגדרה ניסיון. מתיבת הדו-שיח, בחר באפשרות לתפוס תמונת רקע ולחץ על עיון.

אתר את קובץ הווידאו לניסיון אחד ולחץ לפתוח. לאחר הופעת הסרטון, לחץ לתפוס בתיבת הדו-שיח לתפוס תמונת רקע. לאחר מכן, לחץ על סמל העיגול הלבן ליד החלק העליון של המסך תחת הגדרות זירה, ותפעל את העיגול שנראה כמקיף את אזור השחייה.

לאחר מכן, לחץ על סמל סולם הכיול תחת הגדרות זירה. השתמש בתנועת לחיצה-החזקה-גרירה כדי לבחור את שטח הזירה. כעת, תחת תיבת המרחק בעולם האמיתי במרחק הכיול, הזן 10 נקודה חמש.

לאחר מכן, לחץ על אישור. במידת הצורך, כוונן את קו הכיול כך שישתרע על כל קוטר הזירה המעגלית. לחץ על האפשרות אמת הגדרות זירה בתיבת הגדרות הזירה וטפל בבעיות בהגדרות שלא אומתו.

כעת, חזור על תהליך זה עד שיוגדרו כל הזירות לכל משפט. לאחר מכן, הגדר את הפרמטרים לזיהוי דגים. ראשית, בחר הגדרות זיהוי תחת אפשרות ההגדרה מסרגל הכלים של חקר הניסוי בצד שמאל של המסך.

לאחר מכן, בחר חיסור דינמי מהתפריט הנפתח תחת שיטה בתיבת הדו-שיח של הגדרות הזיהוי אחת. כמו כן, בחר צבע מילוי עבור כל נושא תחת זיהוי נושא בתיבת הדו-שיח. לאחר מכן, בחר בחר סרטון ואתר את הסרטון לניסיון אחד.

בהגדרות הזיהוי דיאלוג אחד, מלא את תיבת קצב הדגימה תחת וידאו עם חמש נקודה תשע תשע ארבע אחת. באותה תיבה, לחץ על הגדרות עבור אפשרות תמונת ההפניה תחת זיהוי. לאחר מכן, לחץ על האפשרות התחל ללמוד C בתיבת הדו-שיח של תמונת ההתייחסות.

לאחר שהתמונה בתיבת הדו-שיח של תמונת ההתייחסות מופיעה ללא חיות, לחץ על השתמש בתמונת הפניה דינמית תחת הגדרות רכישה בתוך תיבת הדו-שיח וסגור תיבת דו-שיח זו. כעת, בחר כהה יותר מהתפריט הנפתח עבור הנושא נמצא בזיהוי בתיבת הדו-שיח של הגדרות הזיהוי אחת. עבור הניגודיות הכהה תחת זיהוי, הגדר את המספר הקטן יותר ל-33 ואת המספר הגדול יותר ל-153.

לאחר מכן, לחץ על שמור שינויים בפינה השמאלית התחתונה. כעת, ודא שהתוכנה עוקבת בהצלחה אחר בעלי חיים, בניגוד לצללים או פסולת. לחץ על כפתור ההפעלה בתיבת הדו-שיח של בקרת ההפעלה והתאם את המספרים לניגודיות כהה לפי הצורך.

הקפד לשמור את כל ההתאמות שבוצעו. התוכנה מוגדרת כעת לאסוף נתונים מהסרטון, כך שהמשימה הבאה היא לעקוב אחר הדגים בכל ניסוי. ראשית, בחר רכישה תחת אפשרות ההתקנה מסרגל הכלים של סייר הניסויים בצד שמאל של המסך.

לאחר מכן, לחץ על עקוב אחר הניסיון המתוכנן הבא בתיבת הדו-שיח של הגדרות הרכישה, ואשר שהגדרות הניסיון, הווידאו והזירה הנכונות מוצגות כולן תחת ההגדרות בתיבת הדו-שיח של הגדרות הרכישה. לאחר מכן, סמן את הזיהוי קובע מהירות אפשרות בתיבת הדו-שיח של בקרת הרכישה. לחץ על הכפתור עם העיגול הירוק המוקף בריבוע לבן כדי להתחיל בתהליך הרכישה.

חזור על תהליך זה עד למעקב אחר כל הניסויים. כעת, ניתן לנתח את האובייקטים הנמצאים במעקב שהם הדגים. ראשית, לחץ על פרופילי נתונים תחת אפשרות הניתוח מסרגל הכלים של סייר הניסויים בצד שמאל של המסך.

לאחר מכן, בחר זמן תחת אפשרות הקינון בסרגל הכלים של הרכיבים. תחת ההגדרה בחר מרווח זמן רצועה בתיבת הדו-שיח זמן, התאם את הערך ל לשתי דקות ולחץ על אישור. לאחר מכן, גרור את תיבת הקן בין תיבת ההתחלה לתיבה התוצאה אחת באזור פרופילי הנתונים בצד ימין של המסך.

מסרגל הכלים של סייר הניסויים בצד שמאל של המסך, הסתכל תחת אפשרות הניתוח ולחץ על פרופיל ניתוח. לאחר מכן, בסרגל הכלים של המשתנים התלויים, תחת מהירות הלחיצה על כיוון המרחק והזמן. לחץ על הוסף, ותחת הכותרת מרחק וזמן בסרגל הכלים משתנים תלויים, לחץ על מרחק שהועבר.

לאחר מכן, לחץ על הוסף בתיבת הדו-שיח מרחק שהועבר, ותחת הכותרת התנהגות בודדת בסרגל הכלים משתנים תלויים, לחץ על תנועה. בתיבת הדו-שיח תנועה, הבט מתחת לכותרת המסנן החריג והתאם את מרווח הזמן הממוצע לאחד. לאחר מכן, תחת כותרת הסף, כוונן את מהירות ההתחלה לשתי נקודות אפס אפס והתאם את מהירות העצירה לנקודה אחת שבע חמש.

תחת חישוב סטטיסטיקה עבור כיוון, סמן את שתי התיבות עבור תנועה ואי תנועה. לאחר מכן, לחץ על הוסף, ותחת אפשרות התוצאות בסרגל הכלים של סייר הניסויים בצד שמאל של המסך לחץ על פלט ניתוח. כעת, לחץ על חשב.

לאחר חישוב המשתנים התלויים, לחץ על ייצוא בחלק העליון של המסך. בחר את תיקיית היעד מתיבת הדו-שיח פלט ניתוח ייצוא ובחר Excel מהתפריט הנפתח של סוג הקובץ. לאחר מכן, לחץ על אישור.

לבסוף, לחץ על שמור ניסוי תחת הכרטיסייה קובץ בחלק העליון של המסך. סגור את תוכנת המעקב הדיגיטלית. ייבא את הנתונים לקובץ גיליון אלקטרוני, ונתח אותם באמצעות חבילת תוכנה מסחרית לניתוח סטטיסטי.

לאחר 72 שעות בלבד של חשיפה לריכוזי נחושת שונים, יומיים לאחר הבקיעה הראה חדקן חריגות רבות שניתן להבחין בהן. הייתה השפעה ברורה על התנהגות השחייה. נתוני וידאו סייעו בהגדרת ליקוי התנהגותי זה.

בבדיקות נוספות, חדקן 30 יום לאחר הבקיעה הוכיח רגישות לחשיפה לנחושת של 96 שעות. מהירות השחייה, זמן התנועה והמרחק שנסע, כולם פחתו משמעותית עם העלייה בריכוזי הנחושת. מסלולי השחייה הצטמצמו גם הם עם עלייה בריכוזי הנחושת.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לכמת התנהגות בבדיקת רעילות. טכניקה זו יכולה לספק למנהלי סביבה אמצעי לשימוש בקריטריונים המוגדרים התנהגותית כדי לתעד פגיעה סביבתית ולהנחות שיקום. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להיות עקביים בעת רישום תצפיות התנהגותיות.

התנהגויות אחרות, כגון האכלה ותוקפנות, ניתנות לכימות על ידי ביצוע הליך זה על מנת לענות על שאלות נוספות לגבי ההשפעות ארוכות הטווח של חשיפה למזהמים על ההישרדות.