דגם פסגת כריתת עכבר כדי ללמוד התחדשות לב יונקים מוקדמת
23 בינואר 2016
פרוטוקול וידאו שלב אחר שלב של כריתה אפיקלית מודגם במחקר זה. כריתה אפיקלית היא גישה כירורגית שהודגשה לאחרונה במחקר התחדשות לב של יונקים. מחקר זה עשוי לקדם את היישום של כריתה אפיקלית כמתודולוגיה סטנדרטית במחקר על המנגנון העומד בבסיס התחדשות הלב.
המטרה הכללית של הליך זה היא להשתמש בכריתה של חוד הלב (apical resection) בעכברים רך-הולדים כדי לחקור רגנרציה מוקדמת של הלב ביונקים. נושא זה עשוי לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום רגנרציית הלב, כגון מהם המנגנונים המולקולריים והתאיים העומדים בבסיס רגנרציה לבבית מוקדמת ביונקים. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שדגם העכברים עם כריתת חוד הלב מספק גישה פשוטה וישירה יחסית לחקר רגנרציה מוקדמת של הלב ביונקים.
לפני תחילת הפרוצדורה, העבירו את כל גורי ה-C57 black six ביום postnatal day one מאמם המניקה לכלוב עכברים נקי עם מצע טרי וחומרי קינון. לאחר מכן, עבור כל גור בתורו, העבירו את הגור ממיטת קרח לאזור הניתוח וקבעו את הזרועות, הרגליים והזנב בתנוחה שכיבה (supine). חטאו את החזה באמצעות betadine ולאחריו ניקוי עדין עם פד אלכוהול 70%.
כעת, בצעו חתך עור להעברה לאורך אזור הצלע הרביעית הפנימית של חלל בית החזה. השתמשו במספרי קפיץ כדי לבצע חתך בשיא הלב (apex). כדי להגיע ללב, השתמשו במספרי קפיץ כדי לבצע חתך בשיא הלב, ולאחריו דיסקציה קהה של שרירי הצלעות הפנימיים.
השתמשו בתפרי 6-0 סטריליים כדי לסגור את הצלעות והשרירים יחדיו. השתמשו בדבק עור כדי לסגור בזהירות את החתך בעור ואפשרו ל新生-נולד להתאושש תחת מנורת חימום למשך כשלוש דקות. לאחר מכן, השתמשו בפד עם 70% alcohol כדי לנקות את כל שאריות הדם והדבק מהגור והחזירו את בעל החיים למשכב עם חברי השלשייה שלו.
לאחר ביצוע כל הניתוחים, ערבבו את הגורים עם המצע וההפרשות של האם לפני החזרת הגורים הניונוטליים לקן של האם. יום אחד לאחר הניתוח, ספרו את מספר הגורים מקבוצת השאם והגורים מקבוצת הניתוח כדי לקבוע את שיעור ההישרדות בכל קבוצה. בנקודת הזמן המתאימה לאחר הניתוח, עבור כל חיה בתור, נקו את החזה ב-70% ethanol ובצעו חתך בקו האמצע של עור ושרירי החזה.
הוציאו את הלב כולו מחלל בית החזה וקבעו את הרקמה ב-4% פאראפורמאלדהיד למשך לילה בטמפרטורת החדר. למחרת, העבירו את הדגימות ל-70% ethanol למשך עד שבוע לפני הטמעה בפראפין. לאחר השגת חתכי פראפין בעובי של חמישה מיקרומטר לאורך כל הפרונטריקולר, צבעו את הדגימות ב-hematoxylin, ו-Eocene, וב-Masson's trichrome כדי לבחון את החלפת השריר ואת התגובות הפיברוטיות בלבבות שהוסרו, בהתאמה.
באמצעות סורק שקופיות, השג ידנית לפחות שלושה מוקדים לכל דגימה. לאחר מכן, נתח את תמונות הדגימות בהגדלה של 40X בהתאם להוראות היצרן ובשימוש בפרמטרים ברירת המחדל של הסורק. בעקבות כריתה אפקלית מוצלחת, בתוך יום אחד מהכריתה האפקלית, קריש דם נוצר ביעילות כדי לאטום את החדר השמאלי.
לאחר מכן נצפה ספיגה הדרגתית של קריש הדם ופיברוזה לבבית מוקדמת, עם החלפתם המדורגת ברקא מיוקרדית עד להתחדשות מלאה של השריר הלבבי 21 ימים לאחר הכריתה. למעשה, שלושה שבועות לאחר הניתוח, לא נראה הבדל בין הלבבים שעברו כריתה לאלו שעברו ניתוח דמה (sham) בניתוח מורפולוגי. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לשמור על תנאים סטריליים.
בעקבות הליך זה, ניתן לבצע מדדים אחרים כגון סימון ובדיקה ליניארית כדי לענות על שאלות נוספות בנוגע לשגשוג תאי שריר לב (cardiomyocyte) וכריתה של קודקוד הלב (apical resection). לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה טובה של אופן ביצוע כריתת קודקוד הלב בעכברים בניו נטאלים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג פרוטוקול וידאו שלב-אחר-שלב לכריתה של חוד הלב (apical resection), גישה כירורגית במחקר של התחדשות לב ביונקים. הטכניקה נועדה להגביר את ההבנה של המנגנונים העומדים בבסיס התחדשות הלב.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- החדשה לבבית
- טכניקות כירורגיות בעכברים רכשבים
- מנגנונים מולקולריים של תיקון הלב
רקע
- הסתה של הלב היא תחום מחקר קריטי בקרדיולוגיה.
- כריתה אפקלית (Apical resection) היא טכניקה חדשנית לחקר תיקון לבבי.
- הבנת שלבי הרגנרציה המוקדמים עשויה להוות בסיס לאסטרטגיות טיפוליות.
- מחקר זה משתמש בעכברים בניו נאטליים כאורגניזם מודל.
מטרת המחקר
- לחקור את המנגנונים התאיים והמולקולריים של התחדשות הלב.
- לבסס את כריתת הקודקוד (apical resection) כמתודולוגיה סטנדרטית במחקר.
- לספק גישה פשוטה לבדיקת התחדשות לבבית.
שיטות שנמצאו בשימוש
- העברה של גורי C57 black six ביום הראשון לאחר הלידה לכלוב נקי.
- קיבוע של הרכים למשך הפרוצדורות הכירורגיות.
- חיטוי של אזור החזה לפני הניתוח.
- ביצוע כריתה של חוד החלוד (apical resection) לצורך חקר התחדשות הלב.
תוצאות עיקריות
- הדגמה של טכניקת כריתה של הקודקוד (apical resection) בעכברים ניאונטליים.
- אספקת פרוטוקול ברור ליישומים מחקריים עתידיים.
- תובנות על השלבים המוקדמים של התחדשות הלב.
- פוטנציאל לסטנדרטיזציה של מתודולוגיות במחקרי התחדשות הלב.
מסקנות
- כריתה אפיקלית היא טכניקה בעלת ערך לחקר התחדשות הלב.
- מחקר זה עשוי להקל על מחקרים נוספים במנגנונים של תיקון שריר הלב.
- סטנדרטיזציה של שיטה זו עשויה לשפר את השחזוריות במחקר.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ביסוס של מודלים ניתנים לשחזור של התחדשות לב מוקדמת ביונקים נותן מענה לפער קריטי במחקר ופיתוח קרדיווסקולרי, שבו יכולת התחדשות מוגבלת מעכבת פיתוח טיפולי. מודל עכבר של כריתה של קודקוץ הלב (apical resection) מאפשר הפחתת סיכונים מכניסטית של מסלולי תיקון לבבי במהלך תיקוף של מטרות בשלב הפרה-קליני. דבר זה תומך בביטחון ניבוי בזיהוי של מודולטורים של proliferacy של cardiomyocyte ושל רזולוציית פיברוזיס.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות הקשורות לשגשוג תאי שריר הלב (cardiomyocytes) ולהיווצרות צלקות.
- ערך תפעולי: מספק מערכת ישירה in vivo לתיקוף פונקציונלי של מסלולים הקשורים לרגנרציה.
- ערך חזוי: תומך במיון פורטפוליו על ידי הבחנה בין תרכובות המקדמות רגנרציה מיוקרדיאלית אמיתית לבין כאלה המקדמות פיברוזיס.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר נקודות קצה היסטולוגיות כמותיות (למשל, עובי השריר הלבבי, שטח פיברוזיס) לצורך סריקת תרכובות.
- ערך תפעולי: הליך כירורגי סטנדרטי מבטיח הדירות בין מעבדות ובנקודות זמן שונות.
- יכולת הרחבה (Scalability): מקל על הכנת חתכי רקמה מתוקפים עבור תהליכי עבודה של דימוג וניתוח בעלי תוכן גבוה (high-content imaging).
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: ממדל את חלון הרגנרציה הפוסט-נטאלי המוקדם הרלוונטי לקרדיולוגיה התפתחותית ולאסטרטגיות לתיקון מומים מולדים.
- ערך תפעולי: מאפשר הערכה אורך של תיקון רקמות, החל מפירוק הקריש ועד לשחזור השריר הלבבי (myocardium) עד ליום ה-21.
- הלימה תרגומית: תומך בגילוי סממנים ביולוגיים (למשל, דינמיקה של המטריצה extracelluar) הישימים למודלים של פגיעות לבבית באדם.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
מודל הכריתה האפיקלית (apical resection) משתלב ברצף הגילוי, החל מבדיקת השערות לגבי מטרה ועד להערכת יעילות פרה-קלינית, ובכך מספק מערכת רלוונטית למחלה לצורך הפחתת סיכונים מכניסטיים.
- ביולוגיה של גילוי: בוחן השפעות ספציפיות למסלולים על מחזור התחדשות של קרדיומיוציטים ותגובה פיברוטית לאחר פגיעה.
- סריקה: מספק תוצאות היסטולוגיות כמותיות המאפשרות ניתוח של תגובה למספר (dose-response) ופרופיל זמני של תרכובות רגנרטיביות.
- אנליזה: מייצר פלטים מורפומטריים ומבוססי צביעה (H&E, Masson’s trichrome) להשוואה אובייקטיבית בין תנאים שונים.
- מחקר טרנסלציונלי: מקשר בין מנגנוני רגנרציה מוקדמים לתיקוף פרה-קליני באמצעות אבני דרך זמניות ומורפולוגיות מוגדרות.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה כירורגית סטנדרטית וניתנת לשימוש חוזר לתיקוף מטרות קרדיווסקולריות במסגרת מספר פרויקטים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית במחקרי התחדשות של הלב באמצעות לוחות זמנים מוגדרים של פגיעה והחלמה.
- ערך תפעולי: משפר את השחזור באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים של הרדמה, ניתוח וטיפול לאחר ניתוח.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) על ידי הבהרה האם המועמדים מניעים התחדשות או רק מדכאים פיברוזיס.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מטרות מותאם סיכון בהתבסס על פוטנציאל התחדשותי במערכת יונקים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול בעקברי newborns ובטכניקות של מיקרו-כירורגיה.
- תלוי בסטריליזציה של מכשירים כירורגיים, בחוטי תפירה ובתשתית לעיבוד רקמות.
- מחייב סטנדרטיזציה בין צוותים של ההרדמה, הטיפול לאחר הניתוח והניתוח ההיסטולוגי.
- התאמה למודלים אחרים חייבת להתחשב ביכולת התחדשות ספציפית למין ובסימיות כירורגית.
- מגבלות מעשיות כוללות שונות בין גורי העכברים ותלות שיעור ההישרדות בעקביות הפרוצדורלית.
