שליטה אופטית של תאי חיים פעילות חשמלית על ידי פולימרים מצומדות

המטרה הכוללת של שיטה זו היא לשלוט בפוטנציאל קרום התא בעת גירוי על ידי פולסי אור נראים לעין. תהליך הפוטו-טרנסדוקציה מתווך על ידי פולימר מצומד רגיש לאור. שיטה זו מספקת כלי חדש בתחום הטכנולוגיות, שכן היא מהווה אלטרנטיבה רבת ערך לשיטות הקיימות כגון אופטוגנטיקה וגירוי תרמי לבקרה אופטית על פעילות תאים חיים.

היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם יכולת האינטגרציה המהירה עם כל סוג אלקטרופיזיולוג, הרזולוציה המיוחדת והזמנית הפוטנציאלית הגבוהה, הם מפחיתים את הפולשניות. יתרה מכך, זה מאפשר להימנע מהעברת גנים הנדרשת על ידי אופטוגנטיקה. השיטה שלנו מתוארת כאן לגירוי פוטו של תרבית תאים במבחנה.

אבל זה עשוי לפתוח גם הזדמנויות מעניינות ליישומים in vivo. המדגימות את ההליך יהיו קטרינה בוסיו וסוזנה ואקרו מוראטה לפוסט-דוקטורנטים מהמעבדות שלנו עם רקע בכימיה ביולוגית ופיזיקלית בהתאמה. כדי להתחיל, הכינו תמיסה של הפולימר המצומד הרגיש לאור על ידי ערבוב P3HT ו-PCBM בכלורובנזין בריכוז יחסי של אחד לאחד.

מערבבים את התמיסה עם מערבל מגנטי למשך ארבע שעות לפחות בחום של 60 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, נקו שקופיות זכוכית מצופות תחמוצת פח אינדיום עם אמבטיות רצופות של 10 דקות של מים נטולי יונים, אצטון ואיזופרופנול בסוניקטור. יבש את החלקות הכיסוי בעזרת אקדח חנקן, ואז טפל במצעים על ידי מנקה פלזמה.

לאחר הניקוי, הנח את המגלשה על הצ'אק של ספינקוטר, הצד המצופה ITO פונה כלפי מעלה. לאחר מכן, הוסף 150 מיקרוליטר של תמיסת P3HT PCBM לשקופית וסובב את הדגימה. לאחר סיום הספינוטר, הסר את הדגימה והשתמש במקלון חדר נקי טבול באצטון כדי לנקות את החלק האחורי של המצע.

עקרו את המצעים הפוטו-אקטיביים על ידי הנחתם במיכל מכוסה עמיד בחום וחימוםם בחום של 120 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. לאחר מכן העבירו את הדגימות למכסה המנוע סטרילי ותנו להן להתקרר. מנקודה זו ואילך, שמור על סטריליות הדגימות.

מניחים את המצעים הפוטו-אקטיביים בצלחת של שש בארות. בהתחשב בהידרופוביות של שכבת הפולימר המצומדת יש ליצור באר פולידימתילסילוקסן כדי לתקן את הדגימה, ולהגביל את התמיסות כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה. לאחר מכן, הנח את המצעים הפוטו-אקטיביים לבארות הצלחת, וכסה את כל פני השטח של כל דגימה ב-500 עד 750 מיקרוליטר של תמיסה של שני מיליגרם לליטר של פיברונקטין ב-PBS.

דגרו את הדגימות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה לפחות. לאחר הדגירה, השתמש בפיפטה מזכוכית כדי להסיר את תמיסת הפיברונקטין ואז שטוף את המצעים פעם אחת עם שני מיליליטר PBS. ראשית, הוסף נפח כולל של 750 עד 1,000 מיקרוליטר של מצע גידול שלם לבאר.

לאחר מכן, צלחת 15,000 תאי AGK293 לסנטימטר רבוע של מצע פוטו-אקטיבי לכל באר. לאחר מכן, דגרו על התאים למשך 24 עד 48 שעות. ניתן לתרבית תאים בקלות על המצעים הפוטו-אקטיביים, בתנאי ששכבת הידבקות מתאימה, כמו פיברונקטין, מופקדת.

כדי להתחיל, הכינו הן את הפתרונות החוץ-תאיים והן את הפתרונות התוך-תאיים כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה. עקר את התמיסות על ידי העברתן דרך פילטר 0.2 מיקרון. לאחר מכן, חממו מראש את התמיסה החוץ-תאית על ידי הכנסתה לאמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

כמו כן, מלאו מזרק מיליליטר אחד בתמיסה התוך תאית וציידו אותו במחט בגודל 34. שמור את התמיסה התוך תאית במגע עם קרח כדי למנוע השפלה של ה-ATP. לאחר מכן, קח מצע מצופה תאים מהחממה והסר בזהירות את ה- PDMS היטב.

לאחר מכן הסר את מצע הגידול בעזרת פיפטה מזכוכית ושטוף את הדגימה לאט בתמיסה חוץ-תאית כדי למנוע ניתוק תאים. הוסף שלושה מיליליטר של תמיסה חוץ-תאית לכל באר ואז העביר את הצלחת למחזיק הדגימה של תחנת האלקטרופיזיולוגיה. לאחר שנמצאת במקומה, הכנס את אלקטרודת הייחוס לבאר המיועדת לבדיקה.

לאחר מכן, הכינו מיקרופיפטה מזכוכית טרייה לתיקון מהדק באמצעות מושך מיקרופיפטה. מלאו מחצית מהפיפטה בתמיסה תוך תאית. השתמש במיקרומניפולטור כדי למקם את פיפטת התיקון בסמיכות לקרום התא שנבחר.

במהלך המיקום, הפעל לחץ יתר על הפיפטה על מנת למנוע לכלוך להידבק בקצה. כשהפיפטה כמה מיקרונים מעל התא, התחל להוריד את הפיפטה לכיוון קרום התא תוך כדי התמודדות עם התנגדות הפיפטה בתוכנת בקרת התיקון. כאשר התנגדות הפיפטה עולה בערך מגה-אוהם, הסר את לחץ היתר והפעל יניקה עדינה על מנת ליצור את הג'יגה-סיל בין הפיפטה לקרום התא.

לאחר מכן, החל פוטנציאל שלילי של 40 מילי-וולט שלילי על הפיפטה כדי לסייע בייצוב החותם. לפצות על הארעיות הקיבולית עקב קיבול הפיפטה עם הפקודות היחסיות במגבר התיקון ו/או בתוכנת בקרת התיקון. הפעל דחף יניקה קצר ואינטנסיבי על הפיפטה על מנת לשבור את הממברנה ולאפשר גישה חשמלית לציטופלזמה של התא.

לאחר מכן, הגדר את מגבר התיקון למצב מהדק זרם כך שלא יוזרק זרם לתא. במצב מהדק נוכחי, עקוב אחר פוטנציאל קרום התא והמתן מספר דקות עד שהוא יתייצב. לאחר התייצבות, החל את פרוטוקול ההארה הרצוי על התא על ידי הארת הממברנה הפוטו-אקטיבית מתחת לתא באור בטווח של 450 עד 600 ננומטר.

רשום את השפעת האור על פוטנציאל הממברנה. פולסים קצרים של אור בסביבות 10 עד 20 מילישניות גורמים לדפולריזציה חולפת של התא, בעוד שעם תאורה ממושכת בסדר גודל של מאות אלפיות שנייה נשמרת, נצפית היפרבוליזציה עד לכיבוי האור. גירוי אופטי של תאים בתיווך המצעים הפוטו-אקטיביים יכול לגרום להשפעות שונות על קרום התא, בהתאם למשך גירוי האור.

זינוק מהיר, כמו זה שמוצג כאן, מלווה בדפולריזציה חולפת בסדר גודל של עשרות אלפיות השנייה. עבור פולסים קצרים של אור כאשר האור כבוי, נצפית התנהגות הפוכה. אותות אלה יוחסו לשונות בקיבול הממברנה עקב חימום מקומי בעקבות ספיגת אור.

להארה ממושכת, הדפולריזציה הראשונית הופכת להיפרפולריזציה של תאים. לתופעה זו יש שוב מקור תרמי, אך במקרה זה, היא קשורה לשינוי בפוטנציאל שיווי המשקל של הממברנה עקב שינוי במוליכות תעלת היונים הנגרמת על ידי הטמפרטורה המוגברת. חשוב לציין שטכניקה זו גמישה למדי וניתנת להתאמה לצרכים הספציפיים של ניסוי ספציפי, למשל, על ידי שינוי הפולימר הפוטוקסי, תהליך הייצור או פרוטוקול התאורה.

עם זאת, לפני שינוי הפרוטוקול, יש לוודא תחילה את התכונות החשובות של הפולימר הפעיל כמו ההתאמה הביולוגית שלו, התאמתו לתהליך הסטריליזציה, יציבות אלקטרוכימית וטמפורלית. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לממש ממשק היברידי בין פולימרים מחברים לתאים חיים וכיצד להשתמש בו לבקרה אופטית על פעילות התא. אנו מאמינים שטכניקה זו מבטיחה גם להפוך לכלי משלים במדעי המוח לחקירות חוץ גופיות וגם לפתוח פרספקטיבה חדשה ביישומי in vivo.

עם זאת, כדי לחדד את הפרוטוקול, מאמץ חזק ומשותף של מדעני חומרים ומדעני מוח, פיזיקאים ורופאים הוא חובה.