Name: שיבוט פונקציונלי שימוש Xenopus (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: חקור שיבוט פונקציונלי לזיהוי גנים המשרים תגובה באקטודרם בשיטת חמאת Xenopus. השיטה מאפשרת ניתוח מדויק של תפקודי גנים בביולוגיה התפתחותית באמצעות ביטוי גנים בחמאות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענק פיתוח מקצועי ל-C.Z.P. מקרן אוניברסיטת שפרד. המחברים מבקשים להודות לברט צירקל ומליה דסהוטל על הדיונים המועילים על הפרוטוקולים, ולד"ר קרול הרני על הסיוע הנדיב.

<ol><li>Yergeau, D., Kelley, C., Zhu, H., Kuliyev, E., Mead, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forward+Genetic+Screens+in+Xenopus.+Using+Transposon-Mediated+Insertional+Mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Forward Genetic Screens in Xenopus. Using Transposon-Mediated Insertional Mutagenesis.</a> Methods in Molecular Biology. 917, 111-127 (2012).</li>
<li>Grainger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+tropicalis.+as+a+Model+Organism+for+Genetics+and+Genomics%3A+Past%2C+Present+and+Future%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Xenopus tropicalis. as a Model Organism for Genetics and Genomics: Past, Present and Future.</a> Methods in Molecular Biology. 917, 3-15 (2012).</li>
<li>Nakayama, T., Fish, M., Fisher, M., Oomen-Hajagos, J., Thomsen, G., Grainger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+Efficient+CRISPR%2FCas9-Mediated+Targeted+Mutagenesis+in+Xenopus+tropicalis%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Simple and Efficient CRISPR/Cas9-Mediated Targeted Mutagenesis in Xenopus tropicalis.</a> Genesis. 51, 835-843 (2013).</li>
<li>Ishibashi, S., Cliffe, R., Amaya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+bi-allelic+mutation+rates+using+TALENs+in+Xenopus+tropicalis%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Highly efficient bi-allelic mutation rates using TALENs in Xenopus tropicalis.</a> Biology Open. 1 (12), 1273-1276 (2012).</li>
<li>Zhao, Y., Ishibashi, S., Amaya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+Genetic+Studies+Using+Antisense+Morpholino+Oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Reverse Genetic Studies Using Antisense Morpholino Oligonucleotides.</a> Methods in Molecular Biology. 917, 143-154 (2012).</li>
<li>Smith, W., Harland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injected+Xwnt-8.+RNA+acts+early+in+Xenopus.+embryos+to+promote+formation+of+a+vegetal+dorsalizing+center%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Injected Xwnt-8. RNA acts early in Xenopus. embryos to promote formation of a vegetal dorsalizing center.</a> Cell. 67, 753-765 (1991).</li>
<li>Smith, W., Harland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+cloning+of+noggin.%2C+a+new+dorsalizing+factor+localized+in+the+Spemann+organizer+in+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Expression cloning of noggin., a new dorsalizing factor localized in the Spemann organizer in Xenopus embryos.</a> Cell. 70, 829-840 (1992).</li>
<li>Plautz, C., Zirkle, B., Deshote, M., Grainger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+stages+of+induction+of+anterior+head+ectodermal+properties+in+Xenopus.+embryos+are+mediated+by+transcriptional+cofactor+ldb1%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Early stages of induction of anterior head ectodermal properties in Xenopus. embryos are mediated by transcriptional cofactor ldb1.</a> Developmental Dynamics. 243 (12), 1606-1618 (2014).</li>
<li>Servetnick, M., Grainger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+neural+and+lens+competence+in+Xenopus.+ectoderm%3A+evidence+for+an+autonomous+developmental+timer%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Changes in neural and lens competence in Xenopus. ectoderm: evidence for an autonomous developmental timer.</a> Development. 112, 177-188 (1991).</li>
<li>Nieuwkoop, P., Faber, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNieuwkoop%2C+P+%22Normal+Table+of+Xenopus+laevis+%28Daudin%29%22">Normal Table of Xenopus laevis (Daudin)</a>. , Garland Publishing, Inc. New York and London. (1994).</li>
<li>Lemaire, P., Garrett, N., Gurdon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+cloning+of+Siamois.%2C+a+Xenopus.+homeobox+gene+expressed+in+dorsal-vegetal+cells+of+blastulae+and+able+to+induce+a+complete+secondary+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Expression cloning of Siamois., a Xenopus. homeobox gene expressed in dorsal-vegetal cells of blastulae and able to induce a complete secondary axis.</a> Cell. 81, 85-94 (1995).</li>
<li>Lustig, K., Kroll, K., Sun, E., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+cloning+of+a+Xenopus+T.-related+gene+%28Xombi.%29+involved+in+mesodermal+patterning+and+blastopore+lip+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Expression cloning of a Xenopus T.-related gene (Xombi.) involved in mesodermal patterning and blastopore lip formation.</a> Development. 122, 4001-4012 (1996).</li>
<li>Hsu, D., Economides, A., Wang, X., Eimon, P., Harland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Xenopus.+dorsalizing+factor+Gremlin+identifies+a+novel+family+of+secreted+proteins+that+antagonize+BMP+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The Xenopus. dorsalizing factor Gremlin identifies a novel family of secreted proteins that antagonize BMP activities.</a> Molecular Cell. 1 (5), 673-683 (1998).</li>
<li>Lustig, K., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+an+oocyte+expression+assay+to+reconstitute+inductive+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Use of an oocyte expression assay to reconstitute inductive signaling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92, 6234-6238 (1995).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Molecular+Cloning%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE+Science+Education+Database%22%5BJournal%5D)">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning.</a> JoVE Science Education Database. , (2015).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Restriction+Enzyme+Digests%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE+Science+Education+Database%22%5BJournal%5D)">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Restriction Enzyme Digests.</a> JoVE Science Education Database. , (2015).</li>
<li>Viczian, A., Zuber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+Determination+Using+the+Animal+Cap+Transplant+%28ACT%29+Assay+in+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis.</a> J. Vis. Exp. (39), e1932(2010).</li>
<li>Sive, H., Grainger, R., Harland, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSive%2C+H+%22Early+development+of.Xenopus+laevis.%3A+A+laboratory+manual%22">Early development of.Xenopus laevis.: A laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor. New York. (2000).</li>
<li>Zygar, C., Cook, T., Grainger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+activation+during+early+stages+of+lens+induction+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Gene activation during early stages of lens induction in Xenopus.</a> Development. 125, 3509-3519 (1998).</li>
<li>Medina-Martinez, O., Jamrich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foxe+view+of+lens+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Foxe view of lens development and disease.</a> Development. 134, 1455-1463 (2007).</li>
<li>Amin, N., Tandon, P., Osborne, N. E., Conlon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-seq+in+the+tetraploid+Xenopus.laevis.+enables+genome-wide+insight+in+a+classic+developmental+biology+model+organism%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">RNA-seq in the tetraploid Xenopus.laevis. enables genome-wide insight in a classic developmental biology model organism.</a> Methods. 66, 398-409 (2014).</li>
<li>Gilchrist, M., Zorn, A., Voigt, J., Smith, J., Papalopulu, N., Amaya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+a+large+set+of+full-length+clones+from+a+Xenopus+tropicalis+EST+project%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Defining a large set of full-length clones from a Xenopus tropicalis EST project.</a> Developmental Biology. 271, 498-516 (2004).</li>
<li>Karpinka, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenbase%2C+the+Xenopus.+model+organism+database%3B+new+virtualized+system%2C+data+types+and+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Xenbase, the Xenopus. model organism database; new virtualized system, data types and genomes.</a> Nucleic Acids Research. 43, D756-D763 (2015).</li>
<li>Zhang, S., Li, J., Lea, R., Amaya, E., Dorey, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Functional+Genome-Wide+In+Vivo+Screen+Identifies+New+Regulators+of+Signaling+Pathways+during+Early+Xenopus+Embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A Functional Genome-Wide In Vivo Screen Identifies New Regulators of Signaling Pathways during Early Xenopus Embryogenesis.</a> PLoS ONE. , e79469(2013).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

השיטה המתוארת כאן לשיבוט הפונקציונלי של גנים מסוגלים גרימת תגובה בהאאקטודרם מוסמך יכולה לשמש כדי לזהות מגוון רחב של מוצרי גן. שיטה זו מרחיבה על העבודה האחרונה על ידי שילוב של מבחני וישכנע רקמה עם טכניקות שיבוט ביטוי. אנו מנצלים את המסלולים המטבוליים של ביצית Xenopus כמקור לייצור של גרימת גורמים, במישרין או בעקיפין, לאחר הזרקת RNA. זה, בשילוב עם השימוש בשיטות שהוקמו לשיבוט גן של עניין 6,7 באמצעות ביטוי של תמלילים שנוצרו מספריית cDNA או אוסף אחר של שיבוטים, מספק ...

גישות גנטיות קדימה לזיהוי גנים מעניינים באמצעות תפקודם או אובדן תפקודם1,2 הן חלק בלתי נפרד מהבנת אירועי דפוס מורכבים בהתפתחות. בשילוב עם טכניקות גנטיות הפוכות עוצמתיות הזמינות למגוון הולך וגדל של מערכות וחוקרים3-5, ניתן כעת לזהות גנים בעלי תפקיד תפקודי מרכזי במסלול ולאחר מכן להבהיר את התפקוד ברמה התאית ובאינטראקציה עם תוצרי גנים אחרים. גישה אחת לזיהוי פונקציונלי של גנים מעניינים שהניבה ממצאים מרכזיים רבים בעבר היא שיבוט ביטוי6,7.
המטרה האחרונה שלנו8 הייתה לזהות גורמים אינדוקטיביים מוקדמים לעדשה, מכיוון שהוכח כי שלבים ראשוניים בתהליך השראת עדשות החולייתנים מתרחשים כבר בשלבי הקיבה. למטרה זו, השתמשנו באקטודרם של9 בעלי חיים בעלי יכולת ארעית (שלב 11-11.510) של עוברי קסנופוס כרקמה מגיבה לאינדוקציה, ובביצית Xenopus שלב VI כמקור ייצור לגורמים המעוררים.
הפרוטוקול הבא מתבסס על פרוטוקולי שיבוט הביטויים ובחירת ה-sib של סמית והרלנד6,7, ששימשו בהצלחה גם אחרים11-13. במערכת ביטוי הביציות שלנו (ששימשה לראשונה לייצור גורמים מעוררים על ידי לוסטיג וקירשנר14), נבחרים ומזוהים מאגרי תעתיקים מוזרקים המסוגלים לגרום במישרין או בעקיפין לביציות לייצר גורמים המעוררים תגובה אינדוקטיבית לעדשה באקטודרם של כובע בעלי חיים. מכיוון שהמערכת שימושית לביטוי מולקולות מעוררות המופרשות ישירות (INHBB mRNA המוזרק על ידי ביצית גורם לאינדוקציה של מזודרם באקטודרם 8 של כובע בעלי חיים בעל יכולת מזודרם), ציפינו במקור שהליך הסינון יהיה שימושי בעיקר לזיהוי גורמים פרקריניים. עם זאת, מכיוון שזיהינו גורם גרעיני במסך שלנו (ldb18), ברור שניתן להשתמש במערכת כדי לזהות מגוון רחב של מולקולות כגון גורמי רגולציה שעתוק או תרגום, miRNAs, קופקטורים או גורמים סמוכים.

<table><tbody><tr><td>12/101</td><td>מחקרי התפתחות נוגדנים בנק היברידומה</td><td>12/101</td><td>נוגדן חד שבטי לזיהוי רקמת שריר</td></tr><tr><td>20x SSC Buffer</td><td>Sigma</td><td>S6639</td><td>עבור ISH</td></tr><tr><td>אנהידריד אצטי</td><td>Sigma</td><td>A6404</td><td>עבור ISH</td></tr><tr><td>Anti-Dig-AP</td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td>עבור ISH</td></tr><tr><td>Aurum פלסמיד מיני קיט</td><td>Bio-Rad</td><td>732-6400</td><td>טיהור DNA פלסמיד</td></tr><tr><td>חסימת ריאגנט</td><td>Roche</td><td>11096176001</td><td>עבור ISH</td></tr><tr><td>BM סגול</td><td>Roche</td><td>11442074001</td><td>עבור ISH</td></tr><tr><td>Boekel Hybridization</td><td>Oven Fisher Scientific</td><td>13-245-121</td><td>עבור ISH</td></tr><tr><td>Bouin's Solution</td><td>Sigma</td><td>HT10132</td><td>עבור ISH</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A9647</td><td>עבור OCM</td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>Sigma</td><td>C3023</td><td>עבור ISH</td></tr><tr><td>קולגנאז A</td><td>Roche</td><td>10103578001</td><td>דפוליקולציה של ביציות</td></tr><tr><td>ציסטאין</td><td>סיגמא</td><td>C121800</td><td>עוברי Dejelly</td></tr><tr><td>DEPC-H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP5611</td><td>לתערובת</td></tr><tr><td>תיוג ISH Dig-RNA</td><td>Roche</td><td>11277073910</td><td>לבדיקות ISH</td></tr><tr><td>Dumont #5 מלקחיים</td><td>World Precision Instruments</td><td>500233</td><td>למעטפת Vitelline הסרה</td></tr><tr><td>אתיל 3-aminobenzoate</td><td>Sigma</td><td>A5040</td><td>MS222 חומר הרדמה</td></tr><tr><td>Ficoll PM 400</td><td>Sigma</td><td>F4375</td><td>עבור הזרקת מדיה</td></tr><tr><td>פורממיד</td><td>Sigma</td><td>F9037</td><td>עבור ISH</td></tr><tr><td>Gentamicin sulfate</td><td>Sigma</td><td>G1914</td><td>עבור נימי</td></tr><tr><td>זכוכית</td><td>OCM מכשירי דיוק עולמיים</td><td>4878</td><td>3.5 אינץ' אורך, I, D, 0.530 מ"מ</td></tr><tr><td>בקבוקוני דגימת זכוכית</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>06-408B</td><td></td></tr><tr><td>לולאת</td><td></td><td></td> שיער ISH <td>שיער מודבק בפיפטה פסטור למניפולציה של רקמות</td></tr><tr><td>מלח נתרן הפרין</td><td>סיגמא</td><td>H4784</td><td></td></tr><tr><td>למזרק ISH ננוליטר 2010</td><td>מכשירי דיוק עולמיים</td><td>ננוליטר 2010</td><td>מיקרו-מזרק נשלט על ידי מיקרו-מעבד</td></tr><tr><td>אוקיינוס</td> <td>מיידי</td><td></td><td>מלח אקווריום 972433 קרולינה לשחזור צפרדעים</td></tr><tr><td>IRBG XGC Xenopus מאומת באורך מלא cDNA</td><td>מקור Bioscience</td><td>989_IRBG</td><td>cDNA library&nbsp;</td></tr><tr><td>צלחות LB Agar עם 100 ומיקרו; גרם/מ"ל Ampicillin</td><td>Teknova</td><td>L5004</td><td>150 מ"מ צלחות LB-Amp שנשפכו מראש לבחירת אחים</td></tr><tr><td>LB Luria Broth</td><td>Teknova</td><td>L8650</td><td>LB לאיסוף מושבות בבחירת sib מצלחות ודילול תרביות</td></tr><tr><td>ערכת בידוד mRNA מגנטי</td><td>New England BioLabs</td><td>S1550S</td><td>לבידוד של RNA מועשר בפולי (A)</td></tr><tr><td>חומצה מאלית</td><td>Sigma</td><td>M0375</td><td>עבור ISH</td></tr><tr><td>מיקרופיל מיקרומניפולטור ידני</td><td>מכשירים מדויקים בעולם</td><td>M3310R</td><td>מיקרומניפולטור ידני</td></tr><tr><td>מיקסר אגוזים</td><td>פישר מדעי</td><td>22-363-152</td><td>נדנדה ל-ISH</td></tr><tr><td>Permoplast</td><td>Nasco</td><td>SB33495M</td><td>חימר לכלי הזרקה וחיתוך</td></tr><tr><td>פוספט חוצץ</td><td>מלח סיגמא</td><td>P5368</td><td>עבור ISH</td></tr><tr><td>PMSG</td><td>Sigma</td><td>G4877</td><td>כדי לעורר את התפתחות הביציות</td></tr><tr><td>Polyvinylpyrrolidone</td><td>Sigma</td><td>PVP40</td><td>עבור ISH</td></tr><tr><td>חולץ לתכנות</td><td>מכשירים דיוק עולמי</td><td>PUL-1000</td><td>חולץ מחט מיקרופיפטה</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma</td><td>P6556</td><td>עבור ISH</td></tr><tr><td>pTnT וקטור</td><td>Promega</td><td>L5610</td><td>cDNA ספריית בניית</td></tr><tr><td>מערכת שילוב Riboprobe</td><td>Promega</td><td>P1450</td><td>במבחנה תמלול</td></tr><tr><td>Superscript ערכת בניית ספריית cDNA באורך מלא</td> Life <td>Technologies</td><td>ערכת 18248013</td><td>לבניית ספריית cDNA</td></tr><tr><td>תפרים, 3-0 משי</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-037-516</td><td>חוט תפר ומחט להסרת ביצית</td></tr><tr><td>Torula RNA</td><td>Sigma</td><td>R3629</td><td>עבור ISH</td></tr><tr><td>Triethanolamine</td><td>Sigma</td><td>T1502</td><td>עבור ISH</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td>עבור</td></tr><tr><td>ISH מערכת סינתזה אוניברסלית של RiboClone cDNA</td><td>Promega</td><td>C4360</td><td>ערכה חלופית לבניית ספריית cDNA</td></tr><tr><td>Xenopus שיבוטי כניסה מלאים של ORF - ORFeome שיתוף פעולה</td><td>מקור Bioscience</td><td>5055_XenORFeome</td><td>ORFeome Clones</td></tr><tr><td>XL2-Blue תאים אולטרה-מוכשרים</td><td>Agilent Technologies</td><td>200150</td><td>תאים לטרנספורמציה של cDNA ספריה</td></tr></tbody></table>

שיבוט פונקציונלי שימוש<em&gt; xenopus</emמערכת ביטוי ביצית&gt;

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

זיהוי גנים האחראים לאינדוקציה עוברית מציב מספר אתגרים; בין היתר, מולקולות מופרשות מעניינות עשויות להיות בשפע נמוך, עשויות שלא להיות מופרשות אלא קשורות לתאי האיתות, או עשויות לדרוש נוכחות של שותפים קושרים או מולקולות רגולטוריות במעלה הזרם. לפיכך, בחיפוש אחר תוצרי גנים המסוגלים לעורר תגובה אינדוקטיבית מוקדמת של עדשה באקטודרם מוכשר, השתמשנו במערכת שיבוט ביטוי שתאפשר זיהוי של גורמים פרקריניים או סמוכים כמו גם חלבונים שעתוק או רגולטוריים אחרים. בריכות של mRNA הוזרקו לביציות Xenopus, ורקמת תגובה הונחה ישירות על הביציות ותרבית משותפת. בעקבות שיבוט תפקודי של ldb1 מספריית cDNA בשלב צלחת עצבית בהתבסס על יכולתו לעורר את הביטוי של סמן הפלאקוד המוקדם של העדשה foxe3 באקטודרם כובע בעלי חיים בעל יכולת עדשה, אפיינו את דפוס ביטוי ה-mRNA, ובדקנו את ההתקדמות ההתפתחותית לאחר ביטוי יתר או נוק-דאון של ldb1. מערכת זו מתאימה במגוון רחב מאוד של הקשרים שבהם מחפשים זיהוי של משרה או מולקולות הרגולציה שלו במעלה הזרם באמצעות תגובה פונקציונלית ברקמה מוכשרת.

בתגובה לביטוי של mRNA מוזרק לתוך ביציות, להגיב רקמת כובע חיה assayed לביטוי של otx2 ידי הכלאה באתר (איור 2 ולוח 1); otx2 בא לידי ביטוי בהאאקטודרם העדשה המשוערת (PLE) מסגירת צינור עצבית באמצעות placode העדשה עיבוי 19. עם זאת, מאז otx2 בא לידי ביטוי גם בהאאקטודרם הקדמי עצבי כמו גם האאקטודרם ראש שאינו עצבי מחוץ לPLE, זה קשור לשני עצבי ותגובות placodal. השימוש בfoxe3 להקרין את הספ...

אנו מתארים מערכת ביצית Xenopus וכובע בעלי חיים לשיבוט ביטוי של גנים המסוגלים לעורר תגובה באקטודרם מוכשר, ודנים בטכניקות לניתוח מאוחר יותר של גנים כאלה. מערכת זו שימושית בזיהוי פונקציונלי של מגוון רחב של תוצרי גנים.

שיבוט פונקציונלי שימוש<em&gt; Xenopus</emמערכת ביטוי ביצית&gt;

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להדגים מערכת של כיפה עיברית (animal cap) מביצי Xenopus, המתאימה לזיהוי תוצרי גנים המסוגלים להשרות תגובה באקטודרמה כשירה. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום הביולוגיה של ההתפתחות, כגון אילו גנים נחוצים כדי לעורר תגובה השראתית. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא השימוש בביצית של Xenopus כמערכת ביטוי, לצורך ייצור וזיהוי של משריים הפועלים על רקמת מטרה, או אפילו של גנים הפועלים במעלה הזרם של המשריים.הדגמה חזותית של שיטה זו היא מועילה ביותר, שכן שלבי הדיסקציה והשחזור תלויים מאוד בשלב התפתחותי ודורשים טכניקה מעודנת. לאחר איסוף רקמת שחלה מצפרדעים נקבות המורדמות, קרעו את הרקמה לחתיכות קטנות, שכל אחת מהן מכילה בערך 10 עד 20 oocytes. העבירו את המקטעים הללו, תחילה לתמיסת OR2 טרייה, ולאחר מכן לתמיסת OR2 המכילה 2.0 mg/mL collagenase A. המשיכו בערבוב עדין של התערובת המכילה את הרקמה על ידי שייקר למשך שעה אחת.לאחר מכן, העבירו את השברים לתמיסת קולגנאז (collagenase) טרייה, וערבבו במשך שעה נוספת. בסיום טיפול זה, צפויות להופיע ציטות (oocytes) שחררו מהצבירה (deflocculated). המשיכו לשטוף את הציטות 10 פעמים ב-OR2 מלא, ולאחר מכן פעמיים במצע גידול לציטות, המקוצר כ-OCM.לאחר מכן, העבירו את התאי הביצית ל-OCM טרי, ובדקו אותם ויזואלית תחת מיקרוסקופ דיסקציה. בדלו את התאים שנמצאים בשלב שש על ידי השלכת התאים הביצית הקטנים והבלתי בשלים. לאחר מכן, הניחו את התאים הביצית בצלחת פטרי מצופה אגרוזה המכילה OCM, ושמרו אותם בטמפרטורה של 18 עד 20 degrees Celsius עד להזרקה.כדי להתכונן להזרקה מיקרוסקופית (microinjection), מקמו צינורית קפילרית מזכוכית במכשיר למשיכת מחטים (needle puller), משכו אותה, ולאחר מכן שברו את קצות הזכוכית כדי ליצור מחטים שקוטרן כ-20 micrometers. באמצעות מיקרוסקופ תואר (compound microscope), מדדו את קצות המחטים בעזרת מיקרומטר אוקולרי מכויל. לאחר מכן, דחפו חימר לשכבה אחידה בתחתית של צלחת פטרי בגודל 35 על 10 millimeter.לאחר מכן, צרו חריצים מקבילים בשכבה זו, באמצעות כלי דמוי מחקש קטן. מלאו את הצלחית המרופדת בחימר בכ-2 milliliters של 3%Ficoll ב-1x modified Barth's saline, או MBS. לאחר מכן, העבירו אליה את התאיביצים, באמצעות פיפטה בעלת פיה רחבה.מקמו את הביציות (oocytes) בחריצים כך שיישמרו במקומן במהלך המיקרו-הזרקה הבאה. באמצעות מיקרו-מזרק, מלאו מחט בכ-2 µL ממאגר mRNA שהוכן מראש, וכווננו את המאזן ליצירת לחץ חיובי קל, אשר ימנע מהציטופלזמה של הביצית להישאב אל תוך המחט במהלך ההזרקה. לאחר מכן, ההריקו לכל ביצית 20 nL של RNA באזור המשווה (equatorial region).לאחר מכן, השאירו את התאי ביצית ב-Ficoll MBS למשך שעה אחת, ואז העבירו אותם בעדינות ל-1x MBS. המשיכו לדגרי את התאי ביצית למשך שמונה עד 24 שעות בטמפרטורה של 20 degrees Celsius. כדי להתחיל את בדיקת ה-animal cap, אספו 3/4x normal amphibian medium, המכונה בקיצור תמיסת NAM, פינצטה עדינה, לולאת שיער, תאי ביצית שהוזרקו בעבר ועוברים של xenopus בשלב 11 עד 11.5.לאחר מכן, שברו לוחות כיסוי מזכוכית לרסיסים בגודל של כ-1 מילימטר על 2 מילימטר, ועברו על החלקים הללו בלהבה עד שפינותיהם יתחלקו ויימסו. לאחר מכן, הצמידו חימר לשכבה אחת בתוך צלחת, כפי שתואר קודם לכן, והשתמשו במ probes קטן כדי ליצור חריצים בודדים בצורת כוס בתוך הציפוי הזה.המשיכו למלא את הצלחת בכ-2 mL של 3/4x NAM. העבירו אליה את הביציות המוזרקות, והמיקמו מספר ביציות כך שכל אחת תהיה מקובעת בשקע בודד. כדי להכין את העוברים, העבירו אותם לצלחת המכילה תמיסת 3/4x NAM.בחר תת-קבוצה של גסטולות שישמשו כביקורות לשלב ההתפתחותי (staging controls) עבור גיל האקטודרם, והעבר אותן לצלחית אחרת המכילה את אותו התמיסה. הset את הצלחית זו בצד. עבור עוברים שישמשו בבדיקת כובע החי (animal cap assay), הסר את קרומי הוויטלין שלהם באמצעות שני זוגות של פינצטות עדינות.לאחר מכן, העבירו את הגסטולה למנה המרופדת בחימר עם האוציטים. כדי להתחיל, גזרו את כיפת החלק העליון (animal caps) מהעוברים באמצעות שתי זוגות פינצטות עדינות, תוך הקפדה להימנע מרקמת קו המשווה. כדי ליצור רקומביננטים באמצעות השיטה הראשונה, מקמו כיפת חלק עליון כך שהמשטח הפנימי שלה יבוא במגע עם ההמיספירה העליונה של אוציט, שכבר ממוקם בתוך שקע.חזרו על תהליך זה עבור מספר ציטות מוזרקות. כדי להבטיח שהרקומביננטים הללו יישמרו יחד, הניחו שבב זכוכית מעוקל של כיסוי (coverslip) מעל כל אחד מהם, והפעילו לחץ כלפי מטה עד שהחיה תשטח והכיסוי ייגע בחימר. כדי להפיק רקומביננטים באמצעות השיטה השנייה, הניחו כיסויי חיה (animal caps) וציטות יחד בתוך שקעים בודדים וריקים בחימר.ודאו שהמשטחים הפנימיים של ה-animal caps פונים לעבר ה-oocyte. לאחר מכן, קבעו את שתי הרקמות יחד באמצעות תוספות קטנות של חימר. לאחר שנוצרו מספר רקומיבננטים בכל אחת מהשיטות, תרבתו אותם ואת עוברי הביקורת שהופרדו בטמפרטורה של 20 degrees celsius.כאשר העוברים של קבוצת הביקורת מגיעים לשלב הרצוי, הסירו את כיסי הזכוכית מהרקומביננטים ובודדו את האקטודרמה של כיפת החי (animal cap ectoderm) באמצעות פינצטה ולולאת שערה. המשיכו בקיבוע של שני מקטעי האקטודרמה ושל עוברי הביקורת ב-MEMFA למשך שעה אחת. לאחר מכן, העבירו אותם לאתנול ואחסנו רקמה זו בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס.בניסוי זה, הוזרקו קבוצות של ציטות (oocytes) עם מאגרי mRNA המתאימים למספרים קטנים יותר ויותר של שיבוטים (clones) או מושבות, ולאחר מכן תורגשו יחד עם כיפות אנימליות (animal caps). לאחר מכן, נקבע מספר הכיפות האנימליות בכל קבוצה המבטאות את foxe3, סמן הנצפה בדרך כלל באקטודרמה של עדשת העין העתידית משלבי לוח העצבים המוקדמים ועד להיווצרות השלפוחית, ובניסוי זה שימש להערכת היכולת להשראת התפתחות עדשה. שיטה זו זיהתה גן המקודד לגורם גרעיני, ldb1, שיכול להוביל לתגובת השראת עדשה ב-50 מתוך 179, או 28% מהכיפות האנימליות שנבדקו.מוצגות כאן תמונות ההיברידיזציה in situ שלנו, המדגימות אות של foxe3, המסומן בחצי חצים, במכסי חיות (animal caps) שגודלו עם אוציטים המוזרקים ב-ldb1 בערך משלב 11 עד שלב 23. לא נצפה ביטוי של foxe3 במכסי חיות של ביקורת תואמים שהונחו על אוציטים שלא הוזרקו. כאשר הופקו חתכים ממכסי חיות אלו, נצפה ביטוי של foxe3 הן בשכבות האקטודרמה הפנימיות והן בחיצוניות.ביטוי בשכבה הפנימית מאפיין תגובה של עדשה. לחלופין, ביטוי שמופיע בשתי השכבות מעיד על מבנים אחרים, כגון ה-olfactory placode. לאחר ביצוע הליך זה, ניתן לבצע שיטות כגון אימונוהיסטוכימיה, היברידיזציה in situ, או זיהוי ישיר של גן רפורטר פלואורסצנטי, וזאת כדי להעריך תגובה אינדוקטיבית באקטודרמה של ה-animal cap.

functional-cloning-using-a-xenopus-oocyte-expression-system

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

כאן אנו מדגימים microinjection cytoplasmic...

Microinjection של ביציות Xenopus Laevis

הפריה של Xenopus ביציות באמצעות שיטת העברה מארח

Xenopus עובריים epithelia הם מערכת מודל אידיאלי ללמוד התנהגויות התא כגון פיתוח הקוטביות ולשנות צורה במהלך המורפוגנזה אפיתל. היסטולוגיה מסורתית של דגימות קבוע ויותר כהשלמה הדמיה לחיות תאים confocal. כאן אנו מדגימים שיטות לבודד ברקמות הצפרדע לדמיין לתאי האפיתל לחיות לחיות cytoskeleton שלהם באמצעות תאים מיקרוסקופיה confocal.

Live-תא הדמיה וניתוח כמותי של תאים אפיתל עובריים ב Xenopus laevis</em

זה פרוטוקול וידאו מדגים שיטה להפקת...

הפקה של טראנסגנטי Xenopus laevis על ידי שילוב אנזימים מתווכת הגבלת והשתלות גרעיני

אנו מתארים שיטות למניפולציה של ביציות לא בשלות Xenopus laevis, הבשלת ביציות במבחנה לביציות והזרקת זרע תוך ציטופלזמית. פרוטוקול זה מאפשר פירוק של כמה חלבונים אימהיים וביטוי יתר של גנים מעניינים בעת ההפריה, ולכן הוא בעל ערך לחקר תפקידים של גורמים ספציפיים בהתפתחות עוברית מוקדמת.

ומניפולציה<em&gt; במבחנה</em&gt; ההבשלה של<em&gt; Laevis Xenopus</em&gt; ביציות, ואחריו הזרקת Intracytoplasmic זרע, לחקר התפתחות העוברית

בעוברי קסנופוס, תאים מגג הבלסטוקואל הם פלוריפוטנטיים וניתן לתכנת אותם ליצירת רקמות שונות. כאן, אנו מתארים פרוטוקולים לשימוש בצמחי גג בלסטוקואל דו-חיים כמערכת בדיקה לחקירת תכונות מפתח in vivo  ו-in vitro של התפתחות עצבית מוקדמת.

כמו תא גזע<em&gt; Xenopus</em&gt; Explants העובריים לחקר תכונות המוקדמות עצבי התפתחותית<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; In vivo</em

מתוארים נהלים אופטימליים לבידוד זקיקים בודדים, מיקרו-הזרקות RNA ציטופלזמיות, הסרת שכבות התאים הסובבות וביטוי חלבון בביציות Xenopus. בנוסף, מוצגת שיטה פשוטה לשינויי תמיסה מהירים בניסויים אלקטרופיזיולוגיים עם תעלות יונים מגודרות ליגנד.

Xenopus ביציות: שיטות אופטימיזציה עבור Microinjection, הסרת שכבות ניידות זקיקים, ושינויי פתרון מהירים בניסויי אלקטרו

גנים חיוניים להישרדות מהווים מכשולים טכניים עבור יצירת שורות מוטציה. קפיצת מדרגה עוקף קטלני על-ידי שילוב הגנום עריכה עם השתלת תא נבט הקדמונים ליצירת חיות פראי-סוג נושאת germline מוטציות. קפיצת מדרגה מאפשרת גם הדור יעיל של מוטציות null homozygous דור1 F. . הנה, הצעד השתלת הוא הפגין.

השתלת תא נבט הקדמוני עבור מבוססת על CRISPR/Cas9 וקפיצת המדרגה של צפרדע רפואית

אנו מציגים שיטה לדור של במבחנה עצמית מתמשכת mitotic תנודות ברמת תא בודד על-ידי לבצע תמציות ביצה של צפרדע רפואית זריזה microemulsions מים בתוך שמן.

שיחזור התנודות מחזור התא ב- Microemulsions של תמציות ביצה ללא תא צפרדע רפואית

מאמר זה נועד להדגים את השימוש בתאי גזע עובריים הפלואידיים פרתנוגנטיים כתחליף לזרע לבניית עוברים משובטים למחצה.

יישום של עכבר פרתנוגנטי תאי גזע עובריים הפלואיד כתחליף של זרע

מניפולציות עובריות כגון סילוק והשתלת תאים הן כלים חשובים לחקר ההתפתחות המוקדמת. פרוטוקול זה מתאר מכשיר השתלה פשוט ויעיל לביצוע מניפולציות אלה בעוברי דגי זברה.

מכשיר השתלה פשוט ויעיל לעוברי דגי זברה

חקור שיבוט פונקציונלי לזיהוי גנים המשרים תגובה באקטודרם בשיטת חמאת Xenopus. השיטה מאפשרת ניתוח מדויק של תפקודי גנים בביולוגיה התפתחותית באמצעות ביטוי גנים בחמאות.

שיבוט פונקציונלי שימוש

גלה סרטונים נוספים