שיבוט פונקציונלי שימוש

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להדגים מערכת של כיפה עיברית (animal cap) מביצי Xenopus, המתאימה לזיהוי תוצרי גנים המסוגלים להשרות תגובה באקטודרמה כשירה. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום הביולוגיה של ההתפתחות, כגון אילו גנים נחוצים כדי לעורר תגובה השראתית. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא השימוש בביצית של Xenopus כמערכת ביטוי, לצורך ייצור וזיהוי של משריים הפועלים על רקמת מטרה, או אפילו של גנים הפועלים במעלה הזרם של המשריים.

הדגמה חזותית של שיטה זו היא מועילה ביותר, שכן שלבי הדיסקציה והשחזור תלויים מאוד בשלב התפתחותי ודורשים טכניקה מעודנת. לאחר איסוף רקמת שחלה מצפרדעים נקבות המורדמות, קרעו את הרקמה לחתיכות קטנות, שכל אחת מהן מכילה בערך 10 עד 20 oocytes. העבירו את המקטעים הללו, תחילה לתמיסת OR2 טרייה, ולאחר מכן לתמיסת OR2 המכילה 2.0 mg/mL collagenase A. המשיכו בערבוב עדין של התערובת המכילה את הרקמה על ידי שייקר למשך שעה אחת.

לאחר מכן, העבירו את השברים לתמיסת קולגנאז (collagenase) טרייה, וערבבו במשך שעה נוספת. בסיום טיפול זה, צפויות להופיע ציטות (oocytes) שחררו מהצבירה (deflocculated). המשיכו לשטוף את הציטות 10 פעמים ב-OR2 מלא, ולאחר מכן פעמיים במצע גידול לציטות, המקוצר כ-OCM.

לאחר מכן, העבירו את התאי הביצית ל-OCM טרי, ובדקו אותם ויזואלית תחת מיקרוסקופ דיסקציה. בדלו את התאים שנמצאים בשלב שש על ידי השלכת התאים הביצית הקטנים והבלתי בשלים. לאחר מכן, הניחו את התאים הביצית בצלחת פטרי מצופה אגרוזה המכילה OCM, ושמרו אותם בטמפרטורה של 18 עד 20 degrees Celsius עד להזרקה.

כדי להתכונן להזרקה מיקרוסקופית (microinjection), מקמו צינורית קפילרית מזכוכית במכשיר למשיכת מחטים (needle puller), משכו אותה, ולאחר מכן שברו את קצות הזכוכית כדי ליצור מחטים שקוטרן כ-20 micrometers. באמצעות מיקרוסקופ תואר (compound microscope), מדדו את קצות המחטים בעזרת מיקרומטר אוקולרי מכויל. לאחר מכן, דחפו חימר לשכבה אחידה בתחתית של צלחת פטרי בגודל 35 על 10 millimeter.

לאחר מכן, צרו חריצים מקבילים בשכבה זו, באמצעות כלי דמוי מחקש קטן. מלאו את הצלחית המרופדת בחימר בכ-2 milliliters של 3%Ficoll ב-1x modified Barth's saline, או MBS. לאחר מכן, העבירו אליה את התאיביצים, באמצעות פיפטה בעלת פיה רחבה.

מקמו את הביציות (oocytes) בחריצים כך שיישמרו במקומן במהלך המיקרו-הזרקה הבאה. באמצעות מיקרו-מזרק, מלאו מחט בכ-2 µL ממאגר mRNA שהוכן מראש, וכווננו את המאזן ליצירת לחץ חיובי קל, אשר ימנע מהציטופלזמה של הביצית להישאב אל תוך המחט במהלך ההזרקה. לאחר מכן, ההריקו לכל ביצית 20 nL של RNA באזור המשווה (equatorial region).

לאחר מכן, השאירו את התאי ביצית ב-Ficoll MBS למשך שעה אחת, ואז העבירו אותם בעדינות ל-1x MBS. המשיכו לדגרי את התאי ביצית למשך שמונה עד 24 שעות בטמפרטורה של 20 degrees Celsius. כדי להתחיל את בדיקת ה-animal cap, אספו 3/4x normal amphibian medium, המכונה בקיצור תמיסת NAM, פינצטה עדינה, לולאת שיער, תאי ביצית שהוזרקו בעבר ועוברים של xenopus בשלב 11 עד 11.5.

לאחר מכן, שברו לוחות כיסוי מזכוכית לרסיסים בגודל של כ-1 מילימטר על 2 מילימטר, ועברו על החלקים הללו בלהבה עד שפינותיהם יתחלקו ויימסו. לאחר מכן, הצמידו חימר לשכבה אחת בתוך צלחת, כפי שתואר קודם לכן, והשתמשו במ probes קטן כדי ליצור חריצים בודדים בצורת כוס בתוך הציפוי הזה.

המשיכו למלא את הצלחת בכ-2 mL של 3/4x NAM. העבירו אליה את הביציות המוזרקות, והמיקמו מספר ביציות כך שכל אחת תהיה מקובעת בשקע בודד. כדי להכין את העוברים, העבירו אותם לצלחת המכילה תמיסת 3/4x NAM.

בחר תת-קבוצה של גסטולות שישמשו כביקורות לשלב ההתפתחותי (staging controls) עבור גיל האקטודרם, והעבר אותן לצלחית אחרת המכילה את אותו התמיסה. הset את הצלחית זו בצד. עבור עוברים שישמשו בבדיקת כובע החי (animal cap assay), הסר את קרומי הוויטלין שלהם באמצעות שני זוגות של פינצטות עדינות.

לאחר מכן, העבירו את הגסטולה למנה המרופדת בחימר עם האוציטים. כדי להתחיל, גזרו את כיפת החלק העליון (animal caps) מהעוברים באמצעות שתי זוגות פינצטות עדינות, תוך הקפדה להימנע מרקמת קו המשווה. כדי ליצור רקומביננטים באמצעות השיטה הראשונה, מקמו כיפת חלק עליון כך שהמשטח הפנימי שלה יבוא במגע עם ההמיספירה העליונה של אוציט, שכבר ממוקם בתוך שקע.

חזרו על תהליך זה עבור מספר ציטות מוזרקות. כדי להבטיח שהרקומביננטים הללו יישמרו יחד, הניחו שבב זכוכית מעוקל של כיסוי (coverslip) מעל כל אחד מהם, והפעילו לחץ כלפי מטה עד שהחיה תשטח והכיסוי ייגע בחימר. כדי להפיק רקומביננטים באמצעות השיטה השנייה, הניחו כיסויי חיה (animal caps) וציטות יחד בתוך שקעים בודדים וריקים בחימר.

ודאו שהמשטחים הפנימיים של ה-animal caps פונים לעבר ה-oocyte. לאחר מכן, קבעו את שתי הרקמות יחד באמצעות תוספות קטנות של חימר. לאחר שנוצרו מספר רקומיבננטים בכל אחת מהשיטות, תרבתו אותם ואת עוברי הביקורת שהופרדו בטמפרטורה של 20 degrees celsius.

כאשר העוברים של קבוצת הביקורת מגיעים לשלב הרצוי, הסירו את כיסי הזכוכית מהרקומביננטים ובודדו את האקטודרמה של כיפת החי (animal cap ectoderm) באמצעות פינצטה ולולאת שערה. המשיכו בקיבוע של שני מקטעי האקטודרמה ושל עוברי הביקורת ב-MEMFA למשך שעה אחת. לאחר מכן, העבירו אותם לאתנול ואחסנו רקמה זו בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס.

בניסוי זה, הוזרקו קבוצות של ציטות (oocytes) עם מאגרי mRNA המתאימים למספרים קטנים יותר ויותר של שיבוטים (clones) או מושבות, ולאחר מכן תורגשו יחד עם כיפות אנימליות (animal caps). לאחר מכן, נקבע מספר הכיפות האנימליות בכל קבוצה המבטאות את foxe3, סמן הנצפה בדרך כלל באקטודרמה של עדשת העין העתידית משלבי לוח העצבים המוקדמים ועד להיווצרות השלפוחית, ובניסוי זה שימש להערכת היכולת להשראת התפתחות עדשה. שיטה זו זיהתה גן המקודד לגורם גרעיני, ldb1, שיכול להוביל לתגובת השראת עדשה ב-50 מתוך 179, או 28% מהכיפות האנימליות שנבדקו.

מוצגות כאן תמונות ההיברידיזציה in situ שלנו, המדגימות אות של foxe3, המסומן בחצי חצים, במכסי חיות (animal caps) שגודלו עם אוציטים המוזרקים ב-ldb1 בערך משלב 11 עד שלב 23. לא נצפה ביטוי של foxe3 במכסי חיות של ביקורת תואמים שהונחו על אוציטים שלא הוזרקו. כאשר הופקו חתכים ממכסי חיות אלו, נצפה ביטוי של foxe3 הן בשכבות האקטודרמה הפנימיות והן בחיצוניות.

ביטוי בשכבה הפנימית מאפיין תגובה של עדשה. לחלופין, ביטוי שמופיע בשתי השכבות מעיד על מבנים אחרים, כגון ה-olfactory placode. לאחר ביצוע הליך זה, ניתן לבצע שיטות כגון אימונוהיסטוכימיה, היברידיזציה in situ, או זיהוי ישיר של גן רפורטר פלואורסצנטי, וזאת כדי להעריך תגובה אינדוקטיבית באקטודרמה של ה-animal cap.