שיבוט פונקציונלי שימוש Xenopus
January 30th, 2016
אנו מתארים מערכת ביצית Xenopus וכובע בעלי חיים לשיבוט ביטוי של גנים המסוגלים לעורר תגובה באקטודרם מוכשר, ודנים בטכניקות לניתוח מאוחר יותר של גנים כאלה. מערכת זו שימושית בזיהוי פונקציונלי של מגוון רחב של תוצרי גנים.
המטרה הכוללת של הליך זה היא להדגים ביצית Xenopus, מערכת כובע של בעלי חיים, המתאימה לזיהוי תוצרי גנים המסוגלים לעורר תגובה באקטודרם מוסמך. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה ההתפתחותית כגון אילו גנים נחוצים כדי להגיב באופן לא חוקי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא השימוש שלה בביצית Xenopus, כמערכת ביטוי, כדי לייצר ולזהות משרים הפועלים על רקמת מטרה, או אפילו גנים הפועלים במעלה הזרם של משרה.
הדגמה חזותית של שיטה זו שימושית ביותר, מכיוון ששלבי החיתוך והרקומבינציה תלויים מאוד בשלב ודורשים טכניקה מעודנת. לאחר איסוף רקמת שחלה מנקבות צפרדעים מורדמות, קרעו את הרקמה לחתיכות קטנות, שכל אחת מהן מכילה כ-10 עד 20 ביציות. והעבירו את השברים הללו, תחילה לתמיסת OR2 טרייה, ולאחר מכן ל-OR2 המכיל 2.0 מיליגרם למיליליטר קולגנאז A.המשיכו על ידי ערבוב עדין של התערובת המכילה רקמה על שייקר למשך שעה.
לאחר מכן העבירו את השברים לתמיסת קולגנאז טרייה, וערבבו במשך שעה נוספת. צפו לצפות בביציות מנוטרלות בסוף טיפול זה. המשך לשטוף את הביציות 10 פעמים ב-OR2 מלא, ולאחר מכן פעמיים במדיום תרבית ביציות, בקיצור OCM.
לאחר מכן, הניחו את הביציות ב-OCM טרי, ובדקו אותן ויזואלית תחת מיקרוסקופ דיסקציה. בודדו את אלה בשלב השישי על ידי השלכת הביציות הקטנות והלא בשלות. לאחר מכן, מניחים את הביציות בצלחת פטרי מצופה אגרוז המכילה OCM, ושומרים אותן על 18 עד 20 מעלות צלזיוס עד להזרקה.
כדי להתכונן למיקרו-הזרקה, הנח צינורות נימי זכוכית לתוך מושך מחט, משוך אותו ולאחר מכן שבור את הקצוות מהזכוכית כדי ליצור מחטים בקוטר של כ-20 מיקרומטר. במיקרוסקופ מורכב, מדוד את קצות המחט בעזרת מיקרומטר עיניים מכויל. לאחר מכן, דחפו את החימר לשכבה אחידה בתחתית צלחת פטרי בגודל 35 על 10 מילימטר.
ואז צור חריצים מקבילים בשכבה זו, באמצעות כלי דמוי בדיקה בקניון. מלאו את התבנית המרופדת בחימר בכ-2 מיליליטר של 3% פיקול במי מלח של בארת' שהשתנו פי 1, או MBS. ואז מעבירים אליו את הביציות באמצעות פיפטה רחבת קדח.
מקם את הביציות במטעים כך שיוחזקו במקומם במהלך המיקרו-הזרקה שלאחר מכן. בעזרת מיקרו-מזרק, מלאו מחט בכשני מיקרוליטר של מאגר mRNA שנוצר בעבר והתאימו את האיזון כדי לייצר לחץ חיובי קל, שימנע משיכת ציטופלזמה של ביצית לתוך המחט במהלך ההזרקה. לאחר מכן, הזריקו לכל ביצית 20 ננוליטר RNA באזור קו המשווה.
לאחר מכן, השאירו את הביציות ב-Ficoll MBS למשך שעה, ולאחר מכן העבירו אותן בעדינות ל-1x MBS. המשיכו לדגור על הביציות במשך שמונה עד 24 שעות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס. כדי להתחיל בבדיקת כובע החיה, אסוף פי 3/4 מדיום דו-חיים רגיל, בקיצור תמיסת NAM, מלקחיים עדינים, לולאת שיער, ביציות שהוזרקו בעבר ועוברי קסנופוס בשלב 11 עד 11.5.
לאחר מכן, שברו את מכסה הזכוכית לשברים בגודל של מילימטר על שני מילימטרים, והעבירו את החלקים הללו דרך להבה עד שהקצוות שלהם מלטשים ונמשכים. לאחר מכן, לחץ חימר לשכבה אחת בכלי, כפי שתואר קודם לכן. והשתמש בבדיקה של קניון כדי ליצור רשמים אישיים בצורת בציפוי זה.
המשיכו למלא את המנה בכשני מיליליטר של 3/4x NAM. ואליו, העבירו את הביציות המוזרקות, מקמו כמה כך שכל אחת מהן תשתק בכניסה אחת. כדי להכין את העוברים, העבירו אותם בכלי המכיל תמיסת NAM פי 3/4.
בחר תת-קבוצה של גסטרולה שתשמש כבקרות בימוי לגיל האקטודרם, והעביר אותם לכלי אחר המכיל את אותה תמיסה. והניחו את הצלחת הזו בצד. עבור עוברים שישמשו בכובע החיה, הסר את ממברנות הוויטלין שלהם עם שני זוגות מלקחיים עדינים.
לאחר מכן, העבירו את הגסטרולה לכלי המרופד בחימר עם הביציות. כדי להתחיל, חתכו את כובעי החיות מהעוברים באמצעות שני זוגות קדמיים עדינים, והקפידו להימנע מרקמת קו המשווה. כדי ליצור רקומביננטים בשיטה הראשונה, מקם כובעי בעל חיים כך שהמשטח הפנימי ייגע בחצי הכדור של הביצית, שכבר ממוקם בשקע.
וחזור על תהליך זה עבור כמה מהביציות המוזרקות. כדי להבטיח שהרקומביננטים הללו מוחזקים יחד, הניחו שבר כיסוי זכוכית מעוקל על גבי כל אחד מהם, והפעילו לחץ כלפי מטה עד שהחיה משוטחת והכיסוי נוגע בחימר. כדי ליצור רקומביננטים בשיטה השנייה, הניחו כובעי בעלי חיים וביציות יחד בשקעים בודדים ריקים בחימר.
וודא שהמשטחים הפנימיים של מכסי בעלי החיים פונים לביצית. לאחר מכן, אבטח את שתי הרקמות יחד באמצעות הרחבות קטנות של חימר. לאחר שנוצרו רקומביננטים מרובים בכל אחת מהשיטות, תרבית אז והעוברים המופרשים שולטים ב-20 מעלות צלזיוס.
כאשר עוברי הביקורת מגיעים לשלב הרצוי, הסר את החלקות הכיסוי מהרקומביננטים ובודד את אקטודרם כובע החיה באמצעות מלקחיים ולולאת שיער. המשך לתקן גם שברים אקטודרמליים וגם לשלוט בעוברים ב-MEMFA למשך שעה. והעבירו אותם לאתנול ואחסנו את הרקמה הזו בטמפרטורה שלילית של 20 מעלות צלזיוס.
כאן, קבוצות של ביציות הוזרקו עם מאגרי mRNA המתאימים למספר קטן יותר של שיבוטים או מושבות, ולאחר מכן, תורבבו עם כובעי בעלי חיים. לאחר מכן, נקבע מספר כובעי בעלי החיים בכל קבוצה המבטאים foxe3, סמן שנצפה בדרך כלל באקטודרם עדשה משוער משלבי צלחת עצבית מוקדמים ועד להיווצרות שלפוחית, ומשמש כאן, להערכת יכולת השראת עדשה. שיטה זו זוהתה בגן המקודד לגורם גרעיני, ldb1, שיכול לייצר תגובה מעוררת עדשה ב-50 מתוך 179, או 28% מכובעי בעלי החיים שהוערכו.
מוצגות כאן, תמונות ההכלאה שלנו באתר, המתארות את אות foxe3, המסומן על ידי ראשי חצים, בכובעי בעלי חיים שגודלו עם ביציות מוזרקות ldb1 בערך משלב 11 עד שלב 23. לא נצפה ביטוי של foxe3 בכובעי חיות ביקורת מקבילים המונחים על ביציות לא מוזרקות. כאשר נוצרו חתכים מכובעי בעלי חיים אלה, נצפה ביטוי שועל3 הן בשכבות האקטודרמיס הפנימיות והן בשכבות האקטודרמיס החיצוניות.
ביטוי בשכבה הפנימית אופייני לתגובת עדשה. או, כפי שמסומן בשתי השכבות, מעיד על מבנים אחרים כגון שלט הריח. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות כמו אימונוהיסטוכימיה, הכלאה באתר, או זיהוי ישיר של גן מדווח פלואורסצנטי, על מנת להעריך תגובה אינדוקטיבית באקטודרם של כובע החיה.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה כללית
מאמר זה מתאר מערכת של ביציות Xenopus וכובע מן החי לצורך שיבוט של ביטוי של גנים שמגרים תגובות באקטודרם מוכשר. השיטה מועילה במיוחד לזיהוי מוצרי גנים ולניתוח הפונקציות שלהם בביולוגיה התפתחותית.
רכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- ביולוגיה התפתחותית
- ביטוי גנים
- גנומיקה פונקציונלית
רקע
- ביציות Xenopus הן מודל חשוב לחקר תפקוד הגנים.
- מערכת הכובע מאפשרת ניתוח של תגובות אינדוקטיביות באקטודרם.
- הבנת אינטראקציות בין גנים חיונית לתהליכים התפתחותיים.
- טכניקות ויזואליות חיוניות בגלל המורכבות של תהליך הניתוח.
מטרת המחקר
- לזהות גנים שמגרים תגובות באקטודרם.
- לחקור את מנגנוני פעולת הגנים בהקשרים התפתחותיים.
- לספק שיטה אמינה לניתוח מוצרי גנים.
שיטות ששימשו
- איסוף רקמות שחלות מצפרדעות נשיות מורדמות.
- ניתוח הרקמות לרסיסים קטנים המכילים ביציות.
- שימוש בקולגנאז A כדי להקל על בידוד הביציות.
- ערבוב תערובות הרקמות כדי לשפר את השחזור של הביציות.
תוצאות עיקריות
- מערכת הביציות של Xenopus מזהה ביעילות מגרי ביטויים של גנים.
- הטכניקות שהוכחו מאפשרות מניפולציה מדויקת של רקמות אקטודרמליות.
- כלים ויזואליים משפרים את ההבנה של הנהלים הניסויים.
- התוצאות תורמות לידע הרחב יותר על ויסות גנים בהתפתחות.
מסקנות
- מערכת הביציות של Xenopus היא כלי חזק למחקרי ביטוי גנים.
- זיהוי מגרים יכול להוביל לתובנות על ביולוגיה התפתחותית.
- מחקר עתידי יכול לבנות על שיטות אלו לגילויים נוספים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
This method enables functional screening of gene products that elicit inductive responses in competent ectoderm, supporting target validation in developmental pathways. By linking molecular overexpression to phenotypic readouts in a tissue context, it provides mechanistic de-risking for early-stage target hypotheses. The Xenopus oocyte expression system offers a scalable platform for identifying paracrine, juxtacrine, or transcriptional regulators relevant to signal transduction cascades.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by testing whether candidate genes can induce a specific developmental response in naïve tissue.
- Operational Value: Enables phenotypic screening of cDNA libraries using a quantitative readout (foxe3 expression) to prioritize functional hits.
- Scientific Value: Supports biological de-risking by distinguishing inducers acting directly on target cells from those requiring upstream regulators or binding partners.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates validated biological systems (oocyte-animal cap recombinants) for downstream assay standardization and reproducibility testing.
- Operational Value: Facilitates preparation of inducible tissue models suitable for high-content screening of signaling modulators or pathway inhibitors.
- Scientific Value: Enables measurement of ligand-independent or juxtacrine signaling activities not captured in soluble factor assays.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Assesses developmental progression following target overexpression or knockdown, informing phenotypic consequence and pathway placement.
- Operational Value: Provides a disease-relevant system (ectodermal competence) for evaluating target modulation in a physiological context.
- Scientific Value: Supports translational biomarker alignment by correlating molecular perturbation with early lineage marker induction (e.g., foxe3).
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis generation to lead identification, particularly for targets operating via extracellular or juxtacrine mechanisms.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of gene function by measuring inductive capacity in competent ectoderm, clarifying pathway roles and reducing mechanistic ambiguity.
- Screening: Produces standardized, quantifiable outputs (percentage of animal caps expressing foxe3) that support assay reproducibility and hit confirmation across screening campaigns.
- Analytics: Delivers functional readouts based on spatial and temporal marker expression, enabling comparison of inducer potency and structure-activity relationships.
- Translational Research: Connects early gene discovery to phenotypic outcomes in developing tissue, supporting risk-adjusted advancement decisions based on inductive fidelity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for screening diverse cDNA or ORF libraries against multiple inductive phenotypes in ectoderm or other competent tissues.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by linking genotype to inductive phenotype in a tissue-based functional assay.
- Operational Value: Promotes standardization through defined oocyte preparation, mRNA injection, and co-culture parameters, enhancing cross-lab reproducibility.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by filtering targets based on demonstrable inductive capacity, reducing investment in non-functional candidates.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets demonstrating consistent lens-inductive or ectopic tissue responses across biological replicates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Xenopus embryology, microsurgery, and mRNA handling for successful oocyte isolation and injection.
- Dependent on instrumentation for microinjection, agarose plate preparation, and fluorescence or chromogenic detection of marker expression.
- Necessitates cross-team standardization of embryo staging, animal cap isolation, and fixation protocols to ensure assay consistency.
- Adaptation to other model systems may require optimization of co-culture conditions and tissue competence windows.
- Practical limitations include the low throughput of manual recombinant assembly and the stage-specific nature of ectodermal competence.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:53
Preparation of Oocytes
2:21
Injection of Library Transcripts
4:08
Preparing the Animal Cap Asssay
5:48
Generation and Culture of Recombinants
7:35
Results: Identification of a Gene Product that Elicits a Lens-Inductive Response in Animal Cap Ectoderm
9:11
Conclusion
