Radiolabeling וכימות של רמות סלולריות של Phosphoinositides ידי נצנץ זרימה מצמיד כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים

המטרה הכוללת של הליך זה היא למדוד את הכמות של כל מין פוספואינוזיטיד בתאים בתנאים גנטיים וסביבתיים שונים על מנת להבין את תפקוד הפוספואינוזיטיד והוויסות שלו. שומני פוספואינוזיטיד שולטים בתפקודי תאים כמו נדידה, שכפול וסחר בזיכרון. שיטה זו מזהה תנאים גנטיים וסביבתיים המשפיעים על פוספואינוזיטידים ומגדילה את הידע שלנו על ויסות ותפקודם.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת מדידה מדויקת ובמקביל של כל הפוספואינוזיטידים בתוך התאים. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי ויסות הפוספואינוזיטידים בשמרים, ניתן ליישם אותה גם על תאי יונקים מתורבתים. אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו בגלל השלבים הרבים הנדרשים לתיוג, עיבוד וניתוח.

אנו ממליצים להתאמן תחילה ללא התווית הרדיואקטיבית. כדי להתחיל, יש לגדל תרבית נוזלית של 20 מיליליטר של זן השמרים SEY6210, במדיום סינטטי שלם בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס עם טלטול מתמיד לשלב אמצע העץ. לאחר מכן, העבירו בסך הכל 10 עד 14 OD של תאי השמרים לצינור צנטריפוגה תחתון עגול של 12 מיליליטר וצנטריפוגה ב-800 פעמים G למשך חמש דקות.

לשפוך את המדיום. ולהשעות מחדש את הגלולה ב -2 מיליליטר של מדיום נטול אינוזיטול. צנטריפוגה שוב את התאים.

ואז השעו מחדש את הגלולה ב-440 מיקרוליטר של מדיום נטול אינוזיטול. דגרו את התאים בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. לאחר הדגירה יש להוסיף 60 מיקרוליטר טריטיום המסומן מיו-אינוזיטול ולגדל את התאים למשך שעה עד שלוש שעות נוספות בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס עם טלטול מתמיד.

העבירו את מתלה התאים לצינור מיקרו-צנטריפוגה המכיל 500 מיקרוליטר של חומצה פרכלורית 9% ו-200 מיקרוליטר חרוזי זכוכית שטופים בחומצה. מערבבים על ידי היפוך חוזר ונשנה של הצינור, ואז מדגרים על קרח למשך חמש דקות. לאחר מכן, מערבל את הצינור במהירות מקסימלית למשך 10 דקות.

לאחר מכן העבירו את הליזאט לצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש באמצעות קצה טעינת ג'ל כדי למנוע שאיבת חרוזי הזכוכית. לאחר מכן, צנטריפוגה את הצינור והשליכו את הסופרנטנט. סוניקציה של הכדור במיליליטר אחד של 100 מילי-מולרי EDTA עד שהוא מתפזר לחלוטין, ושוב צנטריפוגה.

לאחר הצנטריפוגה, שאפו את ה-EDTA מהצינור המכיל את הגלולה המסומנת ברדיו. הוסף 50 מיקרוליטר מים וסוניקט כדי להשעות מחדש את הגלולה. הכן מגיב דאצילציה טרי על פי פרוטוקול הטקסט.

לאחר מכן הוסף 500 מיקרוליטר של מגיב הדיאצילציה לצינור, וסוניקט לערבב. דגרו את הדגימה בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. לאחר מכן, העבירו את הדגימה לגוש חימום בטמפרטורה של 53 מעלות צלזיוס למשך 50 דקות.

לאחר מכן, הניחו את הדגימה בצנטריפוגת ואקום והניחו לה להתייבש למשך שלוש שעות לפחות. השעו מחדש את הגלולה על ידי סוניקציה של 300 מיקרוליטר מים, ודגרו אותה בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. לאחר מכן, יבש את הדגימה לחלוטין בצנטריפוגת ואקום למשך שלוש שעות לפחות.

לאחר הייבוש, הוסיפו 450 מיקרוליטר מים לצינור והשעו מחדש את הגלולה על ידי סוניקציה עד שהיא מתפזרת לחלוטין. הכן מגיב מיצוי טרי על פי פרוטוקול הטקסט. הוסף 300 מיקרוליטר של מגיב מיצוי ומערבולת במהירות מקסימלית למשך חמש דקות.

צנטריפוגה את הצינור ב -18000 פעמים G למשך שתי דקות, ופיפטה בזהירות את השכבה המימית התחתונה לצינור חדש. לאחר מכן, יבש את השבר המימי הסופי על ידי צנטריפוגה ואקום למשך שלוש שעות לפחות. לאחר מכן, פזרו את הגלולה במלואה על ידי סוניקציה ב-50 מיקרוליטר מים, ואחסנו את הדגימה ב-20 מעלות צלזיוס.

לבסוף, קבע את הרדיואקטיביות של הדגימה על ידי הוספת שני מיקרוליטר לארבעה מיליליטר של נוזל נצנוץ בבקבוקון נצנוץ פוליאתילן של 6 מיליליטר. רשום את העלות לאלף חשיפות של הבקבוקון באמצעות מונה נצנוץ נוזלי עם חלון פתוח. כדי להגדיר את מערכת ה-HPLC להפרדת הגליצרו-אינוזיטידים המסומנים בטריטיום, יש להכין תחילה את המאגרים A ו-B, ואת עמודת הכרומטוגרפיה בהתאם לפרוטוקול הטקסט.

לאחר מכן, טען 10 מיליון CPM מהדגימה לבקבוקון הזרקה של שני מיליליטר, המצויד בתוספת קפיצית של 250 מיקרוליטר, והוסף מים לנפח כולל של 55 מיקרוליטר. מכסים את הבקבוקון במכסה בורג המצויד במחיצת סיליקון PTFE ומכניסים אותו למגש הדגימה האוטומטית של מערכת HPLC, יחד עם ריק מים בבקבוקון דומה. באמצעות התוכנה במערכת HPLC, תכנת פרוטוקול פליטה.

אחוז אחד ב' למשך חמש דקות, אחוז אחד עד 20 אחוז ב' למשך ארבעים דקות, 20 עד 100 אחוז ב' למשך עשר דקות, 100% ב' למשך חמש דקות, 100 עד אחוז ב' למשך עשרים דקות, ואז אחוז אחד ב' למשך עשר דקות. הגדר את קצב זרימת המשאבה על 1.0 מיליליטר לדקה במשך 90 דקות, ואת מגבלת הלחץ על 400 בר. עקוב אחר זה על ידי הגדרת פרוטוקול זיהוי על נצנוץ הזרימה שיפעל במשך 60 דקות, עם קצב זרימת נוזל הנצנוץ של 2.5 לדקה, וזמן שהייה של 8.57 שניות.

לאחר מכן, תכנת רצף הזרקה אוטומטי ב-HPLC כך שיתחיל עם ריק המים המפעיל את פרוטוקול שיווי המשקל, ואחריו הדגימה המסומנת ברדיו בפרוטוקול הפליטה. לפני השלמת פרוטוקול שיווי המשקל, צור רצף אצווה על מנצנץ הזרימה כדי למדוד את כל הדגימות באמצעות פרוטוקול הזיהוי, המופעל על ידי פרוטוקול הפליטה. כדי לנתח את נתוני HPLC, יש לפתוח תחילה את קובץ הנתונים הגולמיים עבור כל דגימה, באמצעות תוכנת כימות הכרומטוגרף.

בכרטיסייה כרומטוגרמות, התקרב כדי למתוח את הפסגות הקטנות תוך שמירה על רזולוציית הזמן. השתמש בכלי הוספת החזר ROI כדי להדגיש כל שיא לניתוח, ולאחר מכן זהה את הפסגות על סמך זמן הפליטה שלהן. השתמש בכרטיסיית טבלת האזורים כדי לאתר ולתעד את האזור של כל שיא.

במקביל, שימו לב לשעת ההתחלה והסיום של כל שיא. לאחר מכן, בצע חיסור רקע לכל פסגה על-ידי סימון אזור הסמוך לשיא, המתפרש על פני אותו פרק זמן. באמצעות תוכנת הגיליון האלקטרוני, הפחיתו את מספר הספירות עבור אזור זה מהספירות של השיא המתאים.

נרמל את השטח של כל פסגה כנגד שיא האינוזיטול הגליצרי ההורי, ורשום כאחוז מהפוספטידילינוזיטול ההורי. לאחר מכן לנרמל כל אחת מהפסגות בכל תנאי ניסוי כנגד תנאי הבקרה, ולבטא ככל שהקיפול הסופי גדל בהשוואה לבקרה. ייצא את הקבצים על ידי לחיצה על קובץ ושמירה בשם ובחירת פורמט ה-CSV.

לבסוף, פתח את קובץ ה-CSV בתוכנית גיליון אלקטרוני כדי להתוות את הנתונים. הניתוח של פוספואינוזיטידים של שמרים המסומנים ברדיו בוצע על ידי HPLC. מכיוון שתאי שמרים מייצרים רק ארבעה פוספואינוזיטידים, ניתן להשיג רזולוציה בשיטת פליטת שיפוע כפול של שעה אחת.

שיא האינוזיטול הגליצרי המרמז על שמונה עד תשע דקות האפיל על האות מכל שאר המינים הזרחניים. לכן, יש צורך להתקרב לחלק העקבות המכיל את הפסגות האחרות לפני שילוב האותות הרדיואקטיביים. זני שמרים מסוג בר, ATG18 שנמחקו ו-VAC14 נבדקו לשינויים בפוספטידילינוזיטול 3, 5-ביספוספט בשיטת HPLC זו.

המוטציה שנמחקה על ידי ATG18 הוכחה כמייצרת הכי הרבה פוספטידילינוזיטול 3, 5-ביספוספט והמוטנט שנמחק VAC14 ייצר הכי פחות. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך ארבעה ימים אם היא נעשית כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לייעל את תנאי הגידול והתווית על סמך זן השמרים או סוגי התאים הספציפיים.

בעקבות הליך זה, ניתן להשתמש בשיטות אחרות, כמו חיישנים ביולוגיים התמזגו GFP, כדי להשלים את נצנוץ זרימת HPLC לזיהוי פוספואינוזיטידים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לתייג, לחלץ ולמדוד פוספואינוזיטידים על ידי נצנוץ זרימה משולב HPLC. אל תשכח שעבודה עם רדיואקטיביות וממיסים אורגניים עלולה להיות מסוכנת ביותר, ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון לבישת ציוד מגן אישי והכשרה מתאימה בעת ביצוע הליך זה.