חקר complexation של מרקורי (II) עם Dicysteinyl Tetrapeptides ידי Ionization electrospray ספקטרומטריית המסה

המטרה הכוללת של הליך זה היא להכין קומפלקסים של כספית ופפטידים של דיציסטיניל תחת סטוכיומטריות תגובה שונות, ולאפיין את הקומפלקסים השונים הנוצרים על ידי יינון אלקטרו-ספריי וספקטרומטריית מסה של אוריביטראפ. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח הנוגעות לנטיות המורכבות של תרכובות כספית ותיול, מה שישפר את התכנון הרציונלי של חומרי כלאט לקיבוע יוני כספית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת ניתוח של מתחמי יוני מתכת עם פיצול זניח.

אחרים כוללים דפוס התפלגות איזוטופי מובהק של כספית. קלות בהקצאת המטען וניתוח פסגות חופפות על ידי ספקטרומטריית מסה טנדם. למרות ששיטה זו מספקת תובנה לגבי קומפלקסים של פפטידים כספית, ניתן ליישם אותה גם עם קומפלקסים אחרים, במיוחד עם יוני מתכת הקיימים בצורות איזוטופיות שונות.

הסר מאגר בפורמט אמוניום של חמישה מילי-מולרי מתחת למערכת ואקום למשך 10 דקות, וטהר עם ארגון. חזור על הפעולה פעמיים ואחסן את התמיסה מתחת לארגון. ביום השימוש, סנן את תמיסת החיץ דרך מסנן 0.2 מיקרון לפני השימוש.

להכנת תמיסות כספית כלוריד, שקלו 0.2375 גרם כספית כלוריד. ממיסים ב-25 מיליליטר של מאגר אמוניום בפורמט של חמישה מילי-מולרים, כדי לייצר תמיסת כספית כלוריד מולרית של 0.035. הוסף 0.214 מיליליטר של תמיסת כספית כלוריד ל-9.785 מיליליטר של מאגר אמוניום בפורמט חמישה מילי-מולרי, ליצירת תמיסה של 0.75 מילי-מולאר.

שמיכה את הפתרון המתקבל בגז ארגון. לאחר מכן, הוסף 225 מיקרוליטר של תמיסת מלאי CGGC של חמישה מילי-מולרית ל-1.275 מיליליטר של מאגר pH 7.5 של אמוניום בפורמט חמישה מילי-מולריות, כדי לתת תמיסת CGGC של 0.75 מילי-מולרי. לאחר מכן, הכינו יחס של 1 ל-0.5 של כספית לתמיסת CGGC על ידי הנחת 255 מיקרוליטר של מאגר pH 7.5 של אמוניום בפורמט 5 מילי-מולרי לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר.

לאחר מכן, הוסף 30 מיקרוליטר של תמיסת כספית כלוריד 0.75 מילי-מולרית לתוך הצינור. מערבולת את התמיסה למשך 10 שניות. לאחר מכן, הוסף 15 מיקרוליטר של תמיסת CGGC של 0.75 מילי-מולרית לתוך הצינור.

מערבל את התמיסה למשך 10 שניות נוספות, ולאחר מכן תן לתמיסה לעמוד 10 דקות לפני ההזרקה לספקטרומטר המסה. כדי להכין את ספקטרומטר המסה של ESI, או MS, צייר 100 מיקרוליטר של תקני כיול למזרק זכוכית של 500 מיקרוליטר. הנח את המזרק בעריסת המזרק של משאבת הטרשת הנפוצה.

חבר את הצינור, והזריק לספקטרומטר המסה. הגדר את שם הקובץ עבור ההפעלה על-ידי בחירת סמל הקובץ והקלדת שם הקובץ. בחר בלחצן רכישת נתונים במודול רכישת הנתונים, ואסוף 150 סריקות.

נתח את הכרומטוגרמה כדי לאמת את תקני הכיול על ידי פתיחת מודול עיבוד הנתונים של התוכנה. לאחר מכן, עבור לתפריט הקובץ ובחר לפתוח, ואחריו את הקובץ בתיבת הדו-שיח. ודא שהפסגות בכרומטוגרמה מתואמות עם יחסי המסה למטען של התקנים.

נקה את מזרק הזכוכית בנפח 500 מיקרוליטר על ידי שאיבת 500 מיקרוליטר של מתנול בדרגת HPLC ולאחר מכן הוצאתו לכוס. שאב 500 מיקרוליטר של מתנול בדרגת HPLC לתוך מזרק הזכוכית, ושטוף את המערכת. בחר את מודול הגדרת השיטה של התוכנה כדי להגדיר את הפרמטרים.

בחר בתפריט מצב הסריקה וזהה את המנתחים FTMS, ולאחר מכן לחץ על אישור. לאחר מכן, לחץ על הסמלים השונים בדף ספקטרום התצוגה בזמן אמת כדי להגדיר את הפרמטרים כמפורט בפרוטוקול הטקסט. כדי להפעיל את המאגר, הנח 500 מיקרוליטר של מאגר בפורמט אמוניום של חמישה מילי-מולרי לתוך מזרק הזכוכית של 500 מיקרוליטר.

הנח אותו בעריסת המזרק של משאבת הטרשת הנפוצה, ונתק את הצינור. העבירו את המאגר דרך הצינור למשך דקה עד שתיים. הגדר את שם הקובץ עבור ההפעלה, על-ידי בחירת סמל הקובץ והקלדת שם הקובץ.

בחר בלחצן השגת נתונים במודול, ואסוף 150 סריקות. לחץ על לחצן עצור הפעלה כדי להפסיק את האיסוף לאחר איסוף 150 סריקות. לאחר מכן, פתח את מודול דפדפן הנתונים, עבור לתפריט קובץ ובחר לפתוח, ואחריו את הקובץ בתיבת הדו-שיח.

ודא שאין שיאים בטעינת יתר של מסה 483, 683, 1163 ו-1363 הדומים לקומפלקסים של פפטיד או יוני כספית. הפעל את תמיסת היחס של 1 עד 0.5 כספית ל-CGGC על ידי הכנסת 250 מיקרוליטר מהדגימה לתוך המזרק. הנח את המזרק בעריסת המזרק של משאבת הטרשת הנפוצה.

חבר את הצינור, ופתח את המנגנון. השגת 150 סריקות נתונים, פתח את מודול הדפדפן, עבור לתפריט קובץ ובחר פתח. לאחר מכן, בחר את הקובץ בתיבת הדו-שיח.

ודא שהכרומטוגרמה מכילה פסגות כולל זו של פפטיד CGGC בלבד. היבט קריטי של הליך זה הוא להבטיח שאנליטים מהריצה הקודמת יוסרו לחלוטין לפני כל ניתוח תערובת תגובה. מזעור זיהום הדגימה מאנליטים מועבר מובטח על ידי ניקוי יסודי של קו ההזרקה.

שטפו את המזרק על ידי שאיבה עם 500 מיקרוליטר של מאגר אמוניום בפורמט ולאחר מכן הוצאת המאגר לכוס. לאחר מכן, בחר את כפתור הפסולת ב-MS ושטוף את הצינור שלוש פעמים עם 500 מיקרוליטר של מאגר בפורמט אמוניום. יש לשטוף את המזרק עוד יותר, על ידי שאיבת 500 מיקרוליטר מתנול וחלוקה לכוס.

שטפו את הצינור פעם אחת עם 500 מיקרוליטר מתנול. לאחר מכן, בחר בלחצן גלאי העומס ב-MS. לאחר הוספת 500 מיקרוליטר של מאגר אמוניום פורמט למזרק, הנח את המזרק לעריסת המזרק של משאבת MS. חבר את הצינור, ופתח את המנגנון.

בחר שם קובץ להפעלת המאגר כמו קודם, וקבל 150 סריקות לפני לחיצה על כפתור עצור הפעלה. פתח את מודול דפדפן הנתונים כדי לוודא שהכרומטוגרמה נטולת פסגות מהריצה הקודמת של כספית ל-CGGC. חזור על הליך הניתוח עבור דגימות CGGC הנותרות.

כדי להכין יחס של 1 עד 0.5 של כספית לתמיסת CEEC, הנח 255 מיקרוליטר של מאגר pH 7.5 של אמוניום בפורמט חמישה מילי-מולרי, לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. הוסף 30 מיקרוליטר של תמיסת כספית כלוריד 0.75 מילי-מולרית לתוך הצינור. לאחר מערבולת התמיסה למשך 10 שניות, הוסף 15 מיקרוליטר של תמיסת CEEC של 0.75 מילי-מולרית לתוך הצינור.

מערבולת את התמיסה למשך 10 שניות נוספות. ותן לתמיסה לעמוד 10 דקות לפני הזרקת ספקטרומטר מסה. חזור על הליך הניתוח באמצעות דגימות CEEC ותערובות תגובה של יון כספית ו-CEEC.

מוצג ספקטרום מסה מייצג. לאחר 10 דקות, הסוגים השונים של קומפלקסי פפטיד כספית נראים לתערובת התגובה של 1 עד 0.5 כספית ל-CGGC, יחד עם שיא פפטיד של 339.08, ודימר פפטיד של 677.15. כפי שנצפה בספקטרום הקודם, תערובת התגובה של כספית ל-CGGC אחד לאחד מכילה כמה פסגות דומות.

לדוגמה, שיא 539.03 מציין קומפלקס אחד לאחד של כספית ופפטיד. התצוגה המוגדלת מציגה את הדפוס האיזוטופי הייחודי של כספית המתאים לשבעת האיזוטופים העיקריים של כספית המופיעים באופן טבעי. כמו כן, נצפה קומפלקס כספית אחד עד שניים ל-CGGC, כפי שדווח בעבר עבור כספית דיציסטיניל טריפפטיד.

קומפלקס זה מופיע בכל שלושת תערובות התגובה של כספית ו-CGGC. הוא נותח בקלות על ידי דפוס איזוטופי מובהק של כספית עם שיא מונואיזוטופי ב-877. עם זאת, אם הכספית נמצאת בעודף, כמו בתערובת התגובה של 1 עד 0.5 כספית ל-CGGC, מתגלה קומפלקס נוסף של שתיים עד שתיים כספית ל-CGCC.

חתימה איזוטופית זו של כספית תואמת לקומפלקס של שתי כספית כפי שחושב באמצעות התוכנית הכימית. המסה המונואיזוטופית התיאורטית תואמת לערך טעינת יתר של מסה של 1077, שהוא השיא התשיעי בצביר האיזוטופי הנצפה. מוצג ספקטרום מייצג המציג קומפלקסים שונים של כספית ל-CEEC.

מעניין, הוא הפסגות החופפות הקשורות לכספית לתוספות CEEC במטען פלוס אחד המציגות שיא מונואיזוטופי ב-883. ובמטען פלוס שתיים, עם ערך שיא מונואיזוטופי מחושב של 1765. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך פחות משעתיים, אם היא מבוצעת כראוי.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לנקות את המאגרים ולשטוף את הקו ביסודיות כדי למנוע אנליטים מעבר. בעקבות הליך זה, ניתן להשתמש בשיטות אחרות כמו ספקטרוסקופיה של תהודה מגנטית גרעינית של פרוטון, פחמן-13 וכספית-199, או פוטנציומטריה, כדי לספק קביעה מדויקת יותר של מתחמי התוכן בשלב הפתרון. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות מסוגל לנתח קומפלקסים שונים של כספית ואת דפוסי ההתפלגות האיזוטופיים הייחודיים של כספית ותצורות מטען באמצעות ספקטרומטריית מסה של אורביטראף עם יינון אלקטרו-ספריי, כמו גם להבחין בפסגות חופפות על ידי ניתוח MS טנדם.

אל תשכח שעבודה עם תמיסות כספית עלולה להיות מסוכנת ביותר ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות כגון לבישת ציוד מגן אישי בעת ביצוע הליך זה.