Name: חקר complexation של מרקורי (II) עם Dicysteinyl Tetrapeptides ידי Ionization electrospray ספקטרומטריית המסה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-08T13:00:01.000+00:00
Duration: 12 min 59 s
Description: חקור את תהליך הקומפלקסציה של מרקורי (II) עם טטרפפטידים דיציסטאיניליים באמצעות ספקטרומטריית מסה עם איוניזציית electrospray. שיטה זו מאפשרת אנליזה מדויקת של קומפלקסי יוני מתכת עם שברור מינימלי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

MN-S מודה תמיכה מהקרן הלאומית למדע, רוי להעניק מל&quot;ג 1011859. המחברים תודה להכיר מתקן שלישיית ספקטרומטריית מסה באוניברסיטת צפון קרוליינה בגרינסבורו לשימוש בספקטרומטר המסה תרמו פישר סיינטיפיק LTQ Orbitrap XL. המחברים מודים דניאל טוד, וינסנט סיקה, וBrandie Erhmann באוניברסיטת צפון קרוליינה בגרינסבורו להצעות מועילות והערות לגבי עבודה זו.

הערה: נא להתייעץ כל גיליונות הנתונים של בטיחות חומרים הרלוונטיים (MSDS) לפני השימוש. כלוריד מרקורי הוא חומר כימי רעיל. ציוד מגן אישי (כפפות, משקפי בטיחות, ומעבדה מעיל) חייבים להיות משוחק בעת המסירה ואת כל הפתרונות הקשורים. השלך פתרונות בבקבוקי פסולת כימיים מסומנים באופן ברור המיועדים למתכות כבדות. 1. הכנה של 5 מ&quot;מ degassed אמוניום Formate המאגר, pH 7.5 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים .1576 גרם של חיץ formate אמוניום ב450 מיליליטר של מים כיתה HPLC. התאם את ה- pH של התמיסה מעל עם 1 חומצה פורמית M ואמוניום הידרוקסיד 1 M 7.5. העבר את הפתרון הזה לבקבוק נפח 500 מיליליטר ולהוסיף מים HPLC לקו הכיול לעשות פתרון formate אמוניום 5 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגה חיץ formate אמוניום 5 מ&quot;מ מתחת מערכת ואקום במשך 10 דקות וטיהור עם ארגון. חזור פעמיים ופתרון חנות תחת ארגון. ביום שימוש, לסנן את פתרון החיץ דרך פילטר 0.2 מיקרון beforשימוש בדואר. </li></ol> 2. הכנה של מרקורי פתרונות כלוריד (II) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את .2375 כספית גרם (II) כלוריד. לפזר אותו ב 25 מיליליטר של חיץ formate אמוניום 5 מ&quot;מ לייצר (II) פתרון כלוריד 0.035 M כספית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף .214 מיליליטר של 0.035 פתרון M הכספית כלוריד (II) ל9.785 חיץ formate אמוניום מיליליטר של 5 מ&quot;מ כדי ליצור פתרון M 7.5 x 10 -4. שמיכת פתרון 7.5 x 10 -4 M כספית (II) עם גז ארגון. </li></ol> 3. הכנת CGGC פתרון במלאי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 2.0 מ&quot;ג של tetrapeptide dicysteinyl, CGGC, ב0.118 מיליליטר של אצטוניטריל הכיתה HPLC ולאחר מכן להוסיף 1.0647 מיליליטר של 5 מ&quot;מ formate אמוניום, pH 7.5 חיץ שכבר degassed בארגון להניב פתרון מניות מ&quot;מ CGGC 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 225 μl של פתרון מניות מ&quot;מ CGGC 5 ל1,275 μl של pH היווצרות אמוניום 5 מ&quot;מ 7.5 חיץ לתת פתרון M CGGC 7.5 x 10 -4. </li></ol> 4. הכנהשל תערובות תגובה שונות של מרקורי (II) וCGGC <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה של 1: 0.5 יחס של כספית (II): פתרון CGGC <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח 255 μl של formate אמוניום 5 מ&quot;מ, חיץ pH 7.5 לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר. הוסף 30 μl של פתרון כספית כלוריד (II) 7.5 x10 -4 M לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר עם חיץ formate אמוניום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת הפתרון במשך 10 שניות. ואז להוסיף 15 μl של 7.5 x 10 -4 פתרון M CGGC לmicrocentrifuge 1.5 מיליליטר. מערבולת הפתרון במשך 10 שניות. תן הפתרון לעמוד במשך 10 דקות לפני ההזרקה לתוך ספקטרומטר המסה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה של 1: 1 יחס של כספית (II): פתרון CGGC <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח 240 μl של formate אמוניום 5 מ&quot;מ, חיץ pH 7.5 לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר. הוסף 30 μl של פתרון כספית כלוריד (II) 7.5 x10 -4 M לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר עם חיץ formate אמוניום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת הפתרון במשך 10 שניות. אזלהוסיף 30 μl של 7.5 x 10 -4 פתרון M CGGC לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר. חזור באופן דומה כמפורט בסעיף 4.1. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת 1: 2 יחס של כספית (II): פתרון CGGC <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח 210 μl של formate אמוניום 5 מ&quot;מ, חיץ pH 7.5 לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר. הוסף 30 μl של פתרון כספית כלוריד (II) 7.5 x10 -4 M לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר עם חיץ formate אמוניום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת הפתרון במשך 10 שניות. ואז להוסיף 60 μl של 7.5 x 10 -4 פתרון M CGGC לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר. חזור באופן דומה כמפורט בסעיף 4.1. </li></ol></li></ol> 5. הכנת CEEC פתרון במלאי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 3.5 מ&quot;ג של tetrapeptide dicysteinyl, CEEC, ב0.145 מיליליטר של אצטוניטריל הכיתה HPLC לפזר פפטיד. לאחר מכן להוסיף 13.067 מיליליטר של 5 formate אמוניום מ&quot;מ, pH 7.5 חיץ שכבר degassed בארגון לייצר 0.5 מ &#39;פתרון M CEEC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת הפתרון עד שכל פפטיד נמס. להוסיף 1.125 מיליליטר של 0.5 מ&quot;מ פתרון CEEC ו0.375 מיליליטר של 5 מ&quot;מ formate אמוניום, חיץ pH 7.5 לצינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge לתת פתרון x 10 -5 M CEEC 7.5. מערבולת עד מעורב. </li></ol> 6. הכנת תערובות תגובה שונות של מרקורי (II) ופתרון CEEC <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה של 1: 0.5 יחס של הכספית (II): פתרון CEEC <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח 255 μl של formate אמוניום 5 מ&quot;מ, חיץ pH 7.5 לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר. הוסף 30 μl של פתרון כספית כלוריד (II) 7.5 x10 -4 M לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר עם חיץ formate אמוניום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת הפתרון במשך 10 שניות. ואז להוסיף 15 μl של 7.5 x 10 -4 פתרון M CEEC לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר. חזור באופן דומה כמפורט בסעיף 4.1. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה של 1: 1 יחס של כספית (II): פתרון CEEC <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח 24081; L של formate אמוניום 5 מ&quot;מ, חיץ pH 7.5 לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר. הוסף 30 μl של פתרון כספית כלוריד (II) 7.5 x10 -4 M לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר עם חיץ formate אמוניום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת הפתרון במשך 10 שניות. ואז להוסיף 30 μl של 7.5 x 10 -4 פתרון M CEEC לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר. חזור באופן דומה כמפורט בסעיף 4.1. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת 1: 2 יחס של כספית (II): פתרון CEEC <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח 210 μl של formate אמוניום 5 מ&quot;מ, חיץ pH 7.5 לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר. הוסף 30 μl של פתרון כספית כלוריד (II) 7.5 x10 -4 M לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר עם חיץ formate אמוניום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת הפתרון במשך 10 שניות. ואז להוסיף 60 μl של 7.5 x 10 -4 פתרון M CEEC לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר. חזור באופן דומה כמפורט בסעיף 4.1. </li></ol></li></ol> 7. Analyזיע תערובות התגובה של מרקורי (II) ודוגמאות CGGC ידי Orbitrap ESI ספקטרומטריית המסה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת ספקטרומטר מסת ESI 16 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר של סטנדרטים כיול 100 μl לתוך מזרק זכוכית 500 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את המזרק בעריסת המזרק של משאבת MS, לצרף את צינורות, ולהזריק לספקטרופוטומטר ההמוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגדיר את שם הקובץ לריצה על ידי בחירת סמל הקובץ ולהקליד את שם הקובץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר כפתור נתונים לרכוש במודול רכישת נתונים ולאסוף 150 סריקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח chromatogram כדי לאמת את הסטנדרטים כיול על ידי פתיחת מודול עיבוד נתונים של התוכנה. פתח את מודול, ללכת להגיש תפריט ובחר באפשרות &quot;לפתוח&quot;, ובחר את הקובץ בתיבת הדו-שיח. ודא שהפסגות בchromatogram כדי לתאם את המסה לחייב יחסים של הסטנדרטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את מזרק זכוכית 500 μl על ידי ציור את מתנול הכיתה HPLC 500 μl ואז לוותר מ &#39;אתנול לתוך כוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר את 500 μl של מתנול הכיתה HPLC לתוך מזרק הזכוכית ולשטוף את המערכת לפי צעד 7.1.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את שיטת התקנת מודול של התוכנה כדי להגדיר את הפרמטרים. בחר את תפריט מצב הסריקה ולזהות המנתח כFTMS, ולאחר מכן לחץ על &quot;אישור&quot;. לאחר מכן על ידי לחיצה על הסמלים השונים בדף ספקטרום תצוגה בזמן אמת, להגדיר את הפרמטרים הבאים: זרימת גז שיעור נדן: 10, טמפרטורת מקור: 0, מתח נימים: 37 V, עדשת Tube: 95 V, מתח ריסוס: 4.20 קילו וולט , קצב זרימה 10.00 μl / דקה, מנתח: FTMS, מספר סריקות: 150. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ריצת דגימות CGGC על ספקטרומטר מסת ESI <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את חיץ pH formate אמוניום 5 מ&quot;מ 7.5. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח 500 μl של חיץ formate אמוניום 5 מ&quot;מ לתוך מזרק זכוכית 500 μl, למקם אותו לתוך עריסת המזרק של משאבת MS, ולצרף את צינורות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל חיץ דרך צינורות במשך 1-2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגדיר את שם הקובץ לריצהעל ידי בחירת סמל הקובץ ולהקליד את שם הקובץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר כפתור נתונים לרכוש במודול ולאסוף 150 סריקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על לחצן הפעלה כדי לעצור אוסף אחרי 150 סריקות נאספות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את מודול דפדפן נתונים, ואז ללכת להגיש תפריט ובחר באפשרות &quot;לפתוח&quot;, ובחר את הקובץ בתיבת הדו-שיח. ודא שאין בפסגות 483, 683, 1,163 ו1,363 מ &#39;/ z נמצאות דומה לפפטיד או כספית (II) מתחמי -peptide. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל 1: כספית 0.5 (השני): פתרון יחס CGGC. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח 250 μl של 1: 0.5 כספית (II): יחס CGGC של המדגם לתוך המזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את המזרק לתוך תושבת המזרק של משאבת MS, לצרף את צינורות, וראש המנגנון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר שם קובץ עבור הטווח על ידי בחירת סמל הקובץ ולהקליד את שם הקובץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על כפתור נתונים לרכוש במודול רכישת נתונים ולאסוף 150 סריקות ולחץ על לחצן הפעלה כדי לעצור את האוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את מודול, ללכת להגיש תפריט ובחר באפשרות &quot;לפתוח&quot;, ובחר את הקובץ בתיבת הדו-שיח. ודא שchromatogram מכיל פסגות כוללים אחד לפפטיד CGGC לבד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את המזרק על ידי aspirating עם חיץ formate אמוניום 500 μl ולאחר מכן מחלק חיץ formate אמוניום לתוך כוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר בלחצן הפסולת בטרשת הנפוצה ולשטוף את צינורות שלוש פעמים עם 500 חיץ formate אמוניום μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את המזרק על ידי aspirating עם מתנול 500 μl ולאחר מכן מחלק מתנול לתוך כוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף פעם אחת צינורות עם 500 מתנול μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כפתור גלאי עומס בחר בטרשת הנפוצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl של חיץ formate אמוניום למזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את המזרק לתוך תושבת המזרק של משאבת MS, לצרף את צינורות, וראש המנגנון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר שם קובץ עבור המאגר מנוהל על ידי בחירת סמל הקובץ ולהקליד את שם הקובץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לִלְחוֹץכפתור נתונים לרכוש ולאסוף 150 סריקות ולאחר מכן לחץ על לחצן הפעלת התחנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את מודול דפדפן נתונים, ללכת להגיש תפריט ובחר באפשרות &quot;לפתוח&quot;, ובחר את הקובץ בתיבת הדו-שיח. ודא שchromatogram הוא חלל של פסגות מהמ&quot;כ הקודמת: ריצת CGGC. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל 1: כספית 1 (השני): פתרון יחס CGGC. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח 250 μl של 1: 1 כספית (II): מדגם יחס CGGC לתוך המזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור באופן דומה כפי שתואר לצעדים 7.2.2.2 ל7.2.2.15. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל 1: 2 הכספית (II): פתרון יחס CGGC <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח 250 μl של 1: 2 כספית (II): מדגם ריכוז CGGC לתוך המזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור באופן דומה כפי שתואר לצעדים 7.2.2.2 ל7.2.2.15. </li></ol></li></ol></li></ol> 8. ניתוח תערובות התגובה של מרקורי ודוגמאות CEEC ידי Orbitrap ESI ספקטרומטריית המסה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ריצת דגימות CEEC על ספקטרומטר מסת ESI <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הליך ניתוח חוזר (צעדים 7.1-7.2) באמצעות דגימות CEEC ותערובות תגובה של כספית (II) וCEEC ביחסי stoichiometric שונים. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Clifton, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mercury+exposure+and+public+health%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr.+Clin.+N.+Am%22%5BJournal%5D)">Mercury exposure and public health.</a> Pediatr. Clin. N. Am. 54, 237-269 (2007).</li>
<li>Andersen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+and+Recent+Developments+in+Chelation+Treatment+of+Metal+Intoxication%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Principles and Recent Developments in Chelation Treatment of Metal Intoxication.</a> Chem. Rev. 99, 2683-2710 (1999).</li>
<li>Aposhian, H. V., Maiorino, R. M., Gonzalez-Ramirez, D., Zuniga-Charles, M., Xu, Z., Hurlbut, J. M., Junco-Munoz, P., Dart, R. C., Aposhian, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mobilization+of+heavy+metals+by+newer%2C+therapeutically+useful+chelating+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Mobilization of heavy metals by newer, therapeutically useful chelating agents.</a> Toxicology. 97, 23-38 (1995).</li>
<li>Flora, S. J. S., Pachauri, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chelation+in+Metal+Intoxication%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Environ.+Res.+Public+Health%22%5BJournal%5D)">Chelation in Metal Intoxication.</a> Int. J. Environ. Res. Public Health. 7, 2745-2788 (2010).</li>
<li>Campbell, J. R., Clarkson, T. W., Omar, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+therapeutic+use+of+2%2C3-dimercaptopropane-1-sulfonate+in+two+cases+of+inorganic+mercury+poisoning%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">The therapeutic use of 2,3-dimercaptopropane-1-sulfonate in two cases of inorganic mercury poisoning.</a> JAMA. 256, 3127-3130 (1986).</li>
<li>Rooney, J. P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+thiols%2C+dithiols%2C+nutritional+factors+and+interacting+ligands+in+the+toxicology+of+mercury%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">The role of thiols, dithiols, nutritional factors and interacting ligands in the toxicology of mercury.</a> Toxicology. 234, 145-156 (2007).</li>
<li>Lin, X., Brooks, J., Bronson, M., Ngu-Schwemlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evalution+of+the+association+of+mercury+%28II%29+with+some+dicysteinyl+tripeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg.+Chem%22%5BJournal%5D)">Evalution of the association of mercury (II) with some dicysteinyl tripeptides.</a> Bioorg. Chem. 44, 8-18 (2012).</li>
<li>Ngu-Schwemlein, M., Lin, X., Rudd, B., Bronson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+ESI+mass+spectrometric+analysis+of+the+association+of+mercury%28II%29+with+multi-cysteinyl+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Inorg.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Synthesis and ESI mass spectrometric analysis of the association of mercury(II) with multi-cysteinyl peptides.</a> J. Inorg. Biochem. 133, 8-23 (2014).</li>
<li>Winther, J. R., Thorpe, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+thiols+and+disulfides%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et.+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Quantification of thiols and disulfides.</a> Biochimica et. Biophysica Acta. 1840, 838-846 (2014).</li>
<li>D'Agstino, A., Colton, R., Traeger, J. C., Cantry, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Electrospray+Mass+Spectrometric+Study+of+Organomercury+%28II%29+and+Mercuric+Interactions+with+Peptides+Involving+Cysteinyl+Ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">An Electrospray Mass Spectrometric Study of Organomercury (II) and Mercuric Interactions with Peptides Involving Cysteinyl Ligands.</a> Eur. Mass Spectrom. , 273-285 (1990).</li>
<li>Hofstadler, S. A., Sannes-Lowery, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+ESI-MS+in+drug+discovery%3A+interrogation+of+noncovalent+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Applications of ESI-MS in drug discovery: interrogation of noncovalent complexes.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 5, 585-595 (2006).</li>
<li>Rubino, F. M., Verduci, C., Giampiccolo, R., Pulvirenti, S., Brambilla, G., Columbi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Characterization+of+Homo-+and+Heterodimeric+Mercury+%28II%29-bis-thiolates+of+Some+Biologically+Relevant+Thiols+by+Electrospray+Ionization+and+Triple+Quadruple+Tandem+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Molecular Characterization of Homo- and Heterodimeric Mercury (II)-bis-thiolates of Some Biologically Relevant Thiols by Electrospray Ionization and Triple Quadruple Tandem Mass Spectrometry.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 15, 288-300 (2003).</li>
<li>Krupp, E. M., Milne, B. F., Mestrot, A., Meharg, A. A., Feldmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+into+mercury+bound+to+biothiols%3A+structural+identification+using+ESI-ion-trap+MS+and+introduction+of+a+method+for+their+HPLC+separation+with+simultaneous+detection+by+ICP-MS+and+and+ESI-MS%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Investigation into mercury bound to biothiols: structural identification using ESI-ion-trap MS and introduction of a method for their HPLC separation with simultaneous detection by ICP-MS and and ESI-MS.</a> Anal. Bioanal. Chem. 390, 1753-1764 (2008).</li>
<li>Schaumlöffel, D., Tholey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+directions+of+electrospray+mass+spectrometry+for+elemental+speciation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Recent directions of electrospray mass spectrometry for elemental speciation analysis.</a> Anal. Bioanal. Chem. 400, 1645-1652 (2011).</li>
<li>Patiny, L., Borel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChemCalc%3A+a+building+block+for+tomorrow%27s+chemical+infrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Inf.+Model%22%5BJournal%5D)">ChemCalc: a building block for tomorrow's chemical infrastructure.</a> J. Chem. Inf. Model. 53, 1223-1228 (2013).</li>
<li>Thermo Scientific. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Xcaibur+Versions+2.1.0-2.3.0+Data+Acquisition+and+Processing+User+Guide.+Revision+E.+United+States%22">Xcaibur Versions 2.1.0-2.3.0 Data Acquisition and Processing User Guide. Revision E. United States</a>. , Thermo Fisher Scientific Inc. (2012).</li>
<li>Falcone, G., Foti, C., Gianguzza, A., Giuffrè, O., Napoli, A., Pettignano, A., Piazzese, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequestering+ability+of+some+chelating+agents+towards+methylmercury%28II%29%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Sequestering ability of some chelating agents towards methylmercury(II).</a> Anal. Bioanal. Chem. 405 (2), 881-893 (2013).</li>
<li>Mah, V., Jalilehvand, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutathione+Complex+Formation+with+Mercury%28II%29+in+Aqueous+Solution+at+Physiological+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Res.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Glutathione Complex Formation with Mercury(II) in Aqueous Solution at Physiological pH.</a> Chem. Res. Toxicol. 23, 1815-1823 (2010).</li>
</ol>

אין גילוי נאות לעבודה שדווחה.

Tetrapeptide dicysteinyl הידרופובי CGGC (10 C H 18 N O 4 5 S 2; MW = 338) (איור 1), יוצר קומפלקסים עם כספית (II) כפי שמוצג באיור 2 ולוח 1 בנוסף, הוא יוצר הדימרים פפטיד וtrimers. בהדרגה בסכום של עליות פפטיד בתערובת התגובה. כפי שניתן לראות על ידי ערכי m / z של הדימרים הקשורים [(2M + H) + = 677] וtrimers [(3M + H) + = 1,015], קבוצות תיאול של CGGC לא לחמצן כד...

התרופות הקליניות הנוכחיות שנקבעו לטיפול בכלציה של הרעלת כספית1 מכילות קבוצות תיול, שאחראיות על קשירה וקיבוע יוני כספית2,3. עם זאת, מחקרים הראו כי תרכובות תיול קטנות אלה [חומצה דימרקפטוסוקסיקנית (DMSA) וחומצה דימרקפטופרופאן-סולפונית (DMPS)] אינן אופטימליות לטיפול בכלציה כספית4-6. לכן, יש צורך להבין את האסוציאציה ונטיות ההיווצרות המורכבות של כספית עם תיולים כדי לשפר את תכנון התרופות הרציונלי של תרכובות תיול לכלציה של כספית. לאחרונה, דיווחנו כי טריפפטידים n-אלקיל ואריל דיציסטיניל עם קבוצות דיתיול יכולים לשמש כ"עוגנים כפולים" יעילים כדי להתאים את אתרי התיאום של כספית (II) ליצירת קומפלקסים של 1:1 כספית (II):p אפטיד ו-1:2 כספית (II):(פפטיד)2 7. בנוסף, חקרנו את ההשפעה של הגדלת שאריות ציסטיניל על תצורות מורכבות8. במחקר זה, אנו חוקרים את הקשר של כספית (II) עם שני טטרפפטידים של דיציסטיניל, כאשר שאריות הציסטיניל מופרדות על ידי שתי שאריות חומצות אמינו. על מנת להעריך את ההשפעה של קבוצות קשירת עזר לכספית, חומצות האמינו המתערבות הן שתי שאריות גליצין (ללא תחליף) או שתי שאריות חומצה גלוטמית (גמא-קרבוקסילאט). 
התגובה של פפטיד ציסטיניל עם כספית (II) דורשת תנאים שימנעו את החמצון של קבוצות ציסטיניל תיול ליצירת קשרי דיסולפיד9. יתר על כן, הקשר של כספית (II) עם פפטידים של ציסטיניל ליצירת סוגים שונים של קומפלקסים של כספית-פפטיד תלוי ביחס ההתחלתי של כספית (II): פפטיד בתערובת התגובה7,8. ניתן לנתח את סוגי קומפלקסי הכספית-פפטיד הנוצרים בתערובות תגובה אלו על ידי ספקטרוסקופיית מסה של יינון רך, שהיא כלי אנליטי רגיש לקביעת אינטראקציות בין מינים בין יוני מתכת לפפטידים10-14. בהתאם, הוא יספק פרופיל של הסוגים השונים של תוספות פפטיד מרקוריות הנוצרות בתנאי יינון אלקטרוספריי מוגדר. כאן, נראה כיצד ניתן להכין פפטידים של ציסטיניל ותמיסות כלוריד כספית (II) בתמיסת חיץ אמוניום בפורמט נטול גז המכוסה בארגון כדי למזער את החמצון. על ידי תגובה של שומות משתנות של כספית (II) עם טטרפפטידים של דיציסטייניל, נראה כיצד היחס ההתחלתי של כספית (II):p אפטיד משפיע על סוגי הקומפלקסים שנוצרו. נראה גם כיצד ספקטרומטריית מסה של יינון אלקטרו-ספריי (ESI) יכולה לשמש ככלי אפיון כדי לספק סטוכיומטריה מדויקת של כספית לפפטיד בקומפלקסים שנוצרו. פרוטוקול הווידאו המשויך ידגים את תנאי הניסוי להכנת קומפלקסי הכספית, את ההליך לניתוח תערובות התגובה בתנאי יינון אלקטרו-ספריי מוגדרים, ואת אפיון הסטויכיומטריות של קומפלקסים טטרפפטידים של כספית (II)-דיציסטייניל, בהתבסס על דפוסי התפלגות איזוטופים מובהקים של כספית, באמצעות תוכנית ChemCal15. הוא נועד לסייע למי שמעוניין להשתמש בספקטרומטריית מסה של ESI orbitrap כדי לנתח קומפלקסים שונים הנוצרים על ידי יוני מתכת הקיימים בצורות איזוטופיות שונות.

<table><tbody><tr><td>כספית (II) כלוריד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>429724</td> פורמט אמוניום <td>רעיל ביותר</td></tr><tr><td></td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>516961</td><td></td></tr><tr><td>חומצה פורמית</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>F0507</td><td></td></tr><tr><td>אמוניום הידרוקסיד</td><td>פישר</td><td>A512-P500</td><td></td></tr><tr><td>HPLC מים</td><td>פישר</td><td>W5-4</td><td></td></tr><tr><td>HPLC אצטוניטריל</td><td>פישר</td><td>BP2405-1</td><td></td></tr><tr><td>HPLC מתנול</td><td>פישר</td><td>A452-4</td><td></td></tr></tbody></table>

חקר complexation של מרקורי (ii) עם dicysteinyl tetrapeptides ידי ionization electrospray ספקטרומטריית המסה

A Study of the Complexation of Mercury(II) with Dicysteinyl Tetrapeptides by Electrospray Ionization Mass Spectrometry

במחקר זה הערכנו שיטה לאפיון קומפלקסים, שנוצרו ביחסים יחסיים שונים של כספית (II) לדיציסטיניל טטרפפטיד, על ידי ספקטרומטריית מסה של יינון אלקטרו-ספריי. אסטרטגיה זו מבוססת על אפיון מוצלח קודם של קומפלקסים כספית-דיציסטיניל הכוללים טריפפטידים על ידי שימוש בספקטרומטריית מסה בין טכניקות אחרות. כספית (II) כלוריד ודיציסטיניל טטרפפטיד הודגרו בתווך חוצץ נטול גזים ביחסים סטוכיומטריים משתנים. הקומפלקסים שנוצרו נותחו לאחר מכן על ספקטרומטר מסה אלקטרו-ספריי המורכב ממנתח מסה היברידי ליניארי של יונים ומלכודות אורבי. ספקטרום ספקטרומטריית המסה של יינון אלקטרוספריי (ESI-MS) נרכש במצב חיובי והפסגות שנצפו נותחו לאחר מכן עבור דפוסי התפלגות איזוטופיים מובהקים של כספית ושיא מונואיזוטופי נלווה. עבודה זו מדגימה כי ניתן לקבוע סטוכיומטריה מדויקת של כספית ופפטיד בקומפלקסים שנוצרו בתנאי יינון אלקטרו-ספריי מוגדרים על ידי שימוש ב-ESI MS ברזולוציה גבוהה המבוססת על דפוסי התפלגות איזוטופיים מובהקים של כספית.

<html> מחקר בוצע כדי לאפיין את ההרכב המורכב כספית-פפטיד האפשרי לשתי tetrapeptides, CGGC וCEEC (איור 1) על ידי ספקטרומטריית מסת ESI. מתחמים של כספית (II) עם CGGC או CEEC נחקרו על ידי מגיב התערובות של כספית (II) ופתרונות פפטיד בשלושה יחסים שונים טוחנות: 1: 0.5, 1: 1, ו 1: 2 (כספית (II): פפטיד) . הריכוז של כספית (II) היה 7.5 x 10 -6 M וריכוז הפפטיד מגוון בהתאם. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1" sty...

מוצג האפיון של קומפלקסים שנוצרו ביחסים יחסיים שונים של כספית (II) לטטרפפטידים של דיציסטיניל על ידי יינון אלקטרו-ספריי, ספקטרומטריית מסה אורביטראף.

חקר complexation של מרקורי (II) עם Dicysteinyl Tetrapeptides ידי Ionization electrospray ספקטרומטריית המסה

In this study we evaluated a method for the characterization of complexes, formed in different relative ratios of mercury(II) to dicysteinyl tetrapeptide, ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא להכין קומפלקסים של כספית ופפטידים של דיציסטאין תחת סטוכיומטריות תגובה שונות, ולאפיין את הקומפלקסים השונים שנוצרו באמצעות יינון בריסס אלקטרוסטטי ומספקטרומטריית מסות orbitrap. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בנוגע לנטיית הקומפלקסציה של כספית ותרכובות תיול, דבר שישפר את התכנון הרציונלי של חומרי קיליציה לסבסוב של יוני כספית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת ניתוח של קומפלקסים של יוני מתכת עם פרגמנטציה מזערית.אפשרויות אחרות כוללות דפוס התפלגות איזוטופית מובחן של כספית. קלות בהשמה של המטען ובניתוח של שיאים חופפים באמצעות ספקטרומטריית מסות טנדם. למרות ששיטה זו מספקת תובנה לגבי קומפלקסים של כספית ופפטיד, ניתן להחיל אותה גם על קומפלקסים אחרים, במיוחד עם יוני מתכת הקיימים בצורות איזוטופיות שונות.בצעו ניתון גזים (Degassing) לתמיסת בופר אמוןיום פורמט בריכוז five millimolar תחת מערכת ואקום למשך 10 דקות, ושטפו בארגון. חזרו על הפעולה פעמיים ושמרו את התמיסה תחת ארגון. ביום השימוש, סננו את תמיסת הבופר באמצעות מסנן של 0.2 micron לפני השימוש.להכנת תמיסות של כספית כלוריד (mercury chloride), שקלו 0.2375 גרם של כספית כלוריד. המיסו את החומר ב-25 מיליליטר של בופר אמוןיום פורמט בריכוז 5 מילימולר, כדי להכין תמיסת כספית כלוריד בריכוז 0.035 מולרי. הוסיפו 0.214 מיליליטר מתמיסת הכספית כלוריד ל-9.785 מיליליטר של בופר אמוןיום פורמט בריכוז 5 מילימולר, כדי ליצור תמיסה בריכוז 0.75 מילימולר.כסו את התמיסה שהתקבלה בגז ארגון. לאחר מכן, הוסיפו 225 µL של תמיסת סטוק של CGGC בריכוז 5 mM ל-1.275 mL של בופר פורמט אמוניום 5 mM ב-pH 7.5, כדי לקבל תמיסת CGGC בריכוז 0.75 mM. לאחר מכן, הכינו יחס של 1 ל-0.5 בין כספית לתמיסת CGGC על ידי העברת 255 µL של בופר פורמט אמוניום 5 mM ב-pH 7.5 למבחנה למיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 mL.לאחר מכן, הוסף 30 µL של תמיסת מרקורי כלוריד בריכוז 0.75 mM למבחנה. ערבב את התמיסה במיקסר (Vortex) למשך 10 שניות. לאחר מכן, הוסף 15 µL של תמיסת CGGC בריכוז 0.75 mM למבחנה.ערבבו את התמיסה ב-Vortex למשך 10 שניות נוספות, ולאחר מכן הניחו לתמיסה לעמוד במשך 10 דקות לפני ההזרקה למספקטרומטר מסות. להכנת מספקטרומטר מסות מסוג ESI, או MS, שאבו 100 µl של תמיסות כיול למזרק זכוכית בנפח 500 µl. הניחו את המזרק במעמד המזרקים של משאבת ה-MS.חברו את הצינורית והזריקו אל ספקטרומטר המסה. הגדירו את שם הקובץ להרצה באמצעות בחירה בסמל הקובץ והקלדת שם הקובץ. בחרו בכפתור רכישת הנתונים (acquire data) במודול רכישת הנתונים, ואספו 150 סריקות.נתחו את הכרומטוגרמה כדי לאמת את תכלילי הכיול על ידי פתיחת מודול עיבוד הנתונים של התוכנה. לאחר מכן, עברו לתפריט הקבצים (file), בחרו ב"פתח" (open), ולאחר מכן בחרו את הקובץ בתיבת הדיאלוג. ודאו כי הפסים בכרומטוגרמה תואמים ליחסי המסה למטען של התכלילים.נקה את מזרק הזכוכית בנפח 500 microliter על ידי שאיבה של 500 microliters של methanol בדרגת HPLC ולאחר מכן ריקומו לתוך כוס כימית. שאב 500 microliters של methanol בדרגת HPLC אל מזרק הזכוכית, ושטוף את המערכת. בחר במודול הגדרת השיטה (method setup) של התוכנה כדי לקבוע את הפרמטרים.בחרו בתפריט מצב הסריקה וזהו את ה-analyzers FTMS, ולאחר מכן לחצו על okay. בשלב הבא, לחצו על הסמלים השונים בדף ספקטרום התצוגה בזמן אמת כדי להגדיר את הפרמטרים כמפורט בפרוטוקול הטקסט. להרצת הבאפר, העבירו 500 µL של באפר ammonium formate בריכוז 5 mM למזרק זכוכית של 500 µL.הנח אותו במעמד המזרק של משאבת ה-MS, ונתק את הצינורית. העבר את התמיסה הבופרית דרך הצינורית למשך דקה אחת עד שתי דקות. הגדר את שם הקובץ להרצה, על ידי בחירה בסמל הקובץ והקלדת שם הקובץ.בחרו בכפתור רכישת נתונים (acquire data) במודול, ואספו 150 סריקות. לחצו על כפתור עצירת ההרצה (stop run) כדי להפסיק את האיסוף לאחר איסוף 150 סריקות. לאחר מכן, פתחו את מודול דפדפן הנתונים (data browser), עברו לתפריט קובץ (file) ובחרו בפתח (open), ולאחר מכן בחרו את הקובץ בתיבת הדו-שיח.וודאו כי אין שיאים ב-483, 683, 1163 ו-1363 במטען מסה (mass overcharge) הדומים לקומפלקסים של הפפטיד או של יוני כספית-פפטיד. הריצו את תמיסת היחס של 1 עד 0.5 של כספית ל-CGGC על ידי העברת 250 µL מהדגימה למזרק. הניחו את המזרק במעמד המזרקים של משאבת ה-MS.חבר את הצינורות ובצע ה priming (השריה) למכשיר. לאחר רכישת 150 סריקות נתונים, פתח את מודול הדפדפן, עבור לתפריט קובץ ובחר ב"פתח". לאחר מכן, בחר את הקובץ בתיבת הדו-שיח.וודאו שהכרומטוגרמה מכילה שיאים, כולל זה של הפפטיד CGGC לבדו. היבט קריטי של הליך זה הוא להבטיח שאנליטים מהריצה הקודמת הוסרו לחלוטין לפני ניתוח כל תערובת תגובה. מזעור של זיהום הדגימה מאנליטים שנשארו מהריצה הקודמת מובטח על ידי ניקוי יסודי של קו ההזרקה.שטפו את המזרק על ידי שאיבה של 500 µL של באפר ammonium formate, ולאחר מכן פלטו את הבאפר לתוך כוס כימית. לאחר מכן, בחרו בכפתור הפסולת (waste) במכשיר ה-MS ושטפו את הצינורות שלוש פעמים עם 500 µL של באפר ammonium formate. שטפו את המזרק שנית, על ידי שאיבה של 500 µL של methanol ופליטתו לתוך כוס כימית.שטפו את הצינור פעם אחת עם 500 µL של methanol. לאחר מכן, בחרו בלחצן טעינת הגלאי (load detector) ב-MS. לאחר הוספת 500 µL של ammonium formate buffer למזרק, הניחו את המזרק במעמד המזרקים של משאבת ה-MS. חברו את הצינור, ובצעו ה priming למכשיר.בחר שם קובץ להרצת התמיסה המאזנת (buffer run) כפי שנעשה קודם לכן, ורכוש 150 סריקות לפני הלחיצה על כפתור עצירת ההרצה (stop run). פתח את מודול דפדפן הנתונים כדי לוודא שהכרומטוגרמה נקייה מפיקים מהרצת ה-mercury to CGGC הקודמת. חזור על הליך האנליזה עבור שאר דגימות ה-CGGC.כדי להכין יחס של 1 ל-0.5 של כספית למסלול ה-CEEC, העבירו 255 µL של בופר ammonium formate בריכוז 5 mM ו-pH 7.5 למבחנה של מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 mL. הוסיפו למבחנה 30 µL של תמיסת mercury chloride בריכוז 0.75 mM. לאחר ערבוב של התמיסה בוורטקס למשך 10 שניות, הוסיפו למבחנה 15 µL של תמיסת CEEC בריכוז 0.75 mM.ערבבו את התמיסה במערבל וורטקס (vortex) למשך 10 שניות נוספות. השאירו את התמיסה למשך 10 דקות לפני ההזרקה למספקטרומטר מסות. חזרו על הליך האנליזה באמצעות דגימות CEEC ותערובות תגובה של יוני כספית ו-CEEC.מוצג ספקטרום מס מייצג. לאחר 10 דקות, נראים הסוגים השונים של קומפלקסי פפטיד-כספית עבור תערובת התגובה ביחס של 1 ל-0.5 של כספית ל-CGGC, יחד עם פיק פפטיד של 339.08 ודימר פפטיד של 677.15. כפי שנראה בספקטרום הקודם, תערובת התגובה של כספית ל-CGGC ביחס של 1 ל-1 מכילה כמה פיקים דומים.לדוגמה, שיא 539.03 מצביע על קומפלקס של יחס אחד לאחד של כספית ופפטיד. התצוגה המוגדלת מראה את תבנית האיזוטופים האופיינית לכספית, התואמת לשבעת איזוטופי הכספית העיקריים המופיעים בטבע. כמו כן, נצפה קומפלקס של יחס אחד לשניים של כספית ל-CGGC, כפי שדווח בעבר עבור טריפפטיד דיציסטניל של כספית.קומפלקס זה מופיע בכל שלוש תערובות התגובה של כספית ו-CGGC. ניתן היה לנתחו בקלות באמצעות דפוס איזוטופי מובחן של כספית עם שיא מונואיזוטופי ב-877. עם זאת, אם הכספית נמצאת בעודף, כפי שקורה בתערובת התגובה שבה היחס הוא 0.5 כספית ל-CGGC, מזוהה קומפלקס נוסף של שתי כספית לשני CGGC.חתימה איזוטופית זו של כספית תואמת לקומפלקס של שתי יחידות כספית, כפי שחושב באמצעות תוכנת chem cal. המסה המוני-איזוטופית הפרוטונית התיאורטית תואמת לערך טעינת יתר של מסה של 1077, שהוא הפסגה התשעית באשכול האיזוטופי שנצפה. מוצג ספקטרום מייצג המראה קומפלקסים שונים של כספית ל-CEEC.מעניין לציין את הפסגות החופפות הקשורות לאדוקטים של כספית ל-CEEC במצב טעינה של פלוס אחת, המראות פסגות מונו-איזוטופית ב-883. ובמצב טעינה של פלוס שתיים, עם ערך פסגות מונו-איזוטופית מחושב של 1765. לאחר השליטה בשיטה, ניתן לבצעה בפחות משעתיים, במידה והיא מבוצעת כראוי.בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לבצע ניקוי גזים (degas) מהבופרים ולשטוף את הקו ביסודיות כדי למנוע שאריות של אנליטים. לאחר ביצוע פרוצדורה זו, ניתן להשתמש בשיטות אחרות, כגון ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית (NMR) של פרוטון, פחמן-13 וכספית-199, או בפוטנציומטריה, כדי לקבל קביעה מדויקת יותר של קומפלקסי התוכן בפאזה התמיסתית. לאחר צפייה בסרטון זה, תוכלו לנתח קומפלקסי כספית שונים ואת דפוסי התפלגות האיזוטופים והמטענים המובחנים של הכספית בהם באמצעות ספקטרומטריית מסות orbitrap עם יינון בריסס חשמלי (electrospray ionization), וכן להבחין בין שיאים חופפים באמצעות אנליזת MS טנדם.זכרו כי עבודה עם תמיסות כספית עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון חבישת ציוד מגן אישי, בעת ביצוע פרוצדורה זו.

a-study-complexation-mercury-ii-with-dicysteinyl-tetrapeptides

Research

JoVE Journal

Chemistry

כימיה

ספקטרומטריית מסה הוכיחה להיות כלי רב ערך עבור ניתוח מערכות חלבון גדול. שיטה זו מאפשרת תובנות אדריכלות, הרכב stoichiometry הכוללת של למקטע רב מכלולים. כאן, אנו לתאר, שלב אחר שלב, כיצד לבצע ניתוח מבניות ספקטרומטריית מסה, ולאפיין מבנים macromolecular.

ניתוח מערכות חלבון גדול על ידי ספקטרומטריית מסה מבנית

אנו מתארים את ההכנה של נקודתי קוונטיות colloidal עם גודל הידרודינמית ממוזער עבור דימות פלואורסצנטי מולקולה בודדה. בהשוואה לנקודות קוונטיות קונבנציונליות, חלקיקים אלה הם בגודל דומים לחלבונים כדוריים ומותאמים לבהירות מולקולה בודדה, יציבות נגד photodegradation, והתנגדות לקשירה לא ספציפית לחלבונים ותאים.

נקודות קוונטיות קומפקטיות להדמית מולקולה בודדה

קביעת acidities גז השלב של oligopeptides המכיל ציסטאין מתוארת. הניסויים מבוצעים באמצעות ספקטרומטר מסת quadrupole משולש. את acidities היחסי של פפטידים נמדדים באמצעות ניסויי דיסוציאציה התנגשות-Induced, ואת acidities כמותיות נקבעות באמצעות טבחים ממושכים שיטה קינטית.

קביעת Acidities גז השלב של Oligopeptides

מחקרי Biophysical והביוכימי של אינטראקציות בין חלבוני קרום תחומים מוטבעים-להתמודד עם אתגרים טכניים רבים, הראשונה שבן היא קבלת חומר הלימוד מתאים. מאמר זה מתאר פרוטוקול להפקה וטיהור מתחמי פפטיד הטרנסממברני דיסולפיד-התייצב המתאימים לניתוח מבנים על ידי תהודה מגנטית גרעינית פתרון (NMR) ויישומים אנליטיים אחרים.

מכלולי פפטיד הטרנסממברני ייצור של דיסולפיד-התייצבו ללימודים מבניים

כאן, אנו מציגים פרוטוקולים מפורטים לספקטרומטריית מסה של חילופי מימן/דאוטריום במצב מוצק (ssHDX-MS) וספקטרומטריית מסה של תיוג פוטוליטי במצב מוצק (ssPL-MS) עבור חלבונים באבקות מוצקות. השיטות מספקות מידע ברזולוציה גבוהה על קונפורמציה של חלבונים ואינטראקציות במצב מוצק אמורפי, שעשוי להיות שימושי בתכנון ניסוח.

Mass spectrometric גישות לחקר מבנה חלבון ואינטראקציות באבקות Lyophilized

גמישות קונפורמציה משחקת תפקיד קריטי בתפקוד חלבון. בזאת, אנו מתארים את השימוש של ספקטרומטריית מסת electrospray יינון הזמן לפתור מצמידה את חילופי המימן-דאוטריום חיטוט השינויים המבניים המהירים שמניעים פונקצית חלבוני הורה אי סדר.

המרת מימן-דאוטריום electrospray יינון זמן נפתרה ספקטרומטריית מסה לימוד מבנה החלבון Dynamics

בניידות המסה-הספקטרומטר ההמוני וטכניקות הדוגמנות המולקולריות ניתן לאפיין את ביצועי המתכת הסלקטיבית של הפפטידים העשויים מתכת-כריכה ומתיונין-הנחושת המטאוקובטין. פיתוח מחלקות חדשות של פפטידים מתכת הכלפת יסייע להוביל לtherapeutics עבור מחלות הקשורות באיזון מתכת ביון.

שיטות לקביעת מבנה ומנגנונים של זיהוי יון מתכת וחמצון פעילות של כריכת מתכת Oligopeptides

נייטרלי SO2 אשכולות של אנרגיה קינטית נמוכה (≪ 0.8 eV/בוחרים) משמשים desorb מולקולות פני השטח מורכבים כגון פפטידים או שומנים לניתוח נוסף באמצעות ספקטרומטר מסה באמצעות ספקטרומטר המסה של מלכודת יונים. אין צורך בהכנה לדוגמה מיוחדת, וניתן להתבונן בזמן אמת על תגובות.

ניתוח של מולקולות מורכבות והתגובות שלהם על משטחים באמצעות מצבר-המושרה באמצעות אשכול/אינון המסה ספקטרומטריה

סינתזות Lanthipeptide לזרז תגובות מרובות צעדים במהלך הביוסינתזה של מוצרים טבעיים פפטיד. כאן, אנו מתארים רציף, מלמטה למעלה, מימן-deuterium חילופי ספקטרומטריית מסה (HDX-MS) זרימת עבודה שניתן להפעיל כדי ללמוד את הדינמיקה הקונפורמטיבית של סינתטאז lanthipeptide, כמו גם אנזימים דומים אחרים המעורבים ביוסינתזה של מוצר טבעי פפטיד.

פלטפורמת ספקטרומטריית מסה של חילופי מימן-דיטריום (HDX-MS) לבדיקת אנזימים ביוסינתטיים פפטיד

מוצג כאן הוא פרוטוקול עבור אלקטרופורזה מבוססת אלקטרופורזה נימית מימן / דיוטריום חילופי (HDX) גישה בשילוב עם ספקטרומטריית מסה מלמעלה למטה. גישה זו מאפיינת את ההבדל במבנים מסדר גבוה יותר בין מיני חלבונים שונים, כולל חלבונים במצבים שונים ופרוטאופורמים שונים, על ידי ביצוע HDX דיפרנציאלי בו זמנית והפרדה אלקטרופורטית.

חילופי מימן/דיטריום מבוססי נימי אלקטרופורזה לאפיון קונפורמציה של חלבונים עם ספקטרומטריית מסה מלמעלה למטה

מאמר זה מתאר פרוטוקול ניסיוני המשתמש בספקטרומטריית מסות-ניידות אלקטרו-יונים, חישובים קוונטיים אמפיריים למחצה ודיסוציאציה הנגרמת על ידי התנגשות סף הנפתרת על-ידי אנרגיה, כדי למדוד את התרמוכימיה היחסית של הדיסוציאציה של קומפלקסים של מתכות טרנריות קשורות.

מחקרים תרמוכימיים של קומפלקסים טרנריים Ni(II) ו-Zn(II) באמצעות ספקטרומטריית ניידות-מסה של יונים

חקור את תהליך הקומפלקסציה של מרקורי (II) עם טטרפפטידים דיציסטאיניליים באמצעות ספקטרומטריית מסה עם איוניזציית electrospray. שיטה זו מאפשרת אנליזה מדויקת של קומפלקסי יוני מתכת עם שברור מינימלי.

חקר complexation של מרקורי (II) עם Dicysteinyl Tetrapeptides ידי Ionization electrospray ספקטרומטריית המסה

גלה סרטונים נוספים