התנהגות Assay עבור Mechanosensation של MARCM מבוסס משובט ב תסיסנית melanogaster

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבדוק מוטציות המשפיעות על תחושת המנו בזבובים בוגרים. שיטה זו יכולה לסייע בזיהוי שאלות מפתח בתחום תחושת המנו, כגון זיהוי הערוץ הרגיש של מנו. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שבאמצעות חיות פסיפס, אנו מסוגלים לסנן מוטציות שאחרת היו קטלניות לאורגניזם.

על ידי שימוש במסך פסיפס, אנו מסוגלים לזהות מוטציות שאולי החמיצו מסכי התנהגות מסורתיים יותר. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית. שלבי הבדיקה ההתנהגותית קשים ללמידה.

נדרשת יד יציבה ותרגול כדי לזהות את הזיפים הרלוונטיים. כדי להתחיל בניסוי, שמור זבובים על מדיה של מולסה מקמח תירס ואחסן אותם בחממה. השג נקבות בתולות ממלאי מוכן למרקום המכיל את האלמנטים הגנטיים הדרושים.

חצו את הנקבות הבתולות המוכנות למרקום לזכרים המכילים את המוטציה המעניינת ואת אתר ה-FRT המתאים לה. לאחר מכן, הגדירו את הכלאת הבקרה השנייה באמצעות זבובים זכרים שמכילים את אותו אתר FRT, אך ללא מוטציה. ביחס של חמש נקבות לזכר אחד, לאחר שאפשרו לזבובים להזדווג לפחות לילה אחד, העבירו את הבוגרים לבקבוקונים חדשים עם מדיה טרייה.

תנו לזבובים להטיל את ביציהם בטמפרטורת החדר בארון חשוך. לאחר שהזבובים הטילו ביצים, העבירו את הצלבים לבקבוקונים חדשים. תעד את זמני ההתחלה והסיום של תקופת הטלת הביצים.

שמרו את הבקבוקונים המניבים יותר מ-20 ביצים להלם חום והחזירו אותם לחממה. 85 עד 100 שעות לאחר הטלת הביצים הכניסו בקבוקונים לאמבט מים, וודאו שמפלס המים גבוה מגובה המדיה, אך שהוא אינו טובל את הבקבוקונים במלואם. לאחר שעה, הוציאו את הבקבוקונים מאמבט המים וספקו לזבובים תקופת התאוששות.

לאחר ההתאוששות, יש להחזיר את הבקבוקונים לאמבט המים למשך שעה. הוציאו את הבקבוקונים מאמבט המים ואחסנו אותם בחזרה באינקובטור לאחר הרדמה. הזבובים על הקרח.

ברגע שהזבובים חסרי תנועה, בחרו פרטים המכילים את כל התכונות הרצויות. לאחר מכן, ערפו בזהירות את ראשי הזבובים שנבחרו בעזרת מספריים לכריתת אירידקטומיה והקפידו למקם את המספריים בין הראש לבית החזה. חתוך את החיבור מבלי לחתוך את בית החזה.

הניחו את הזבובים חסרי הראש בסביבה סגורה ולחה ואפשרו להם להתאושש במשך 10 עד 20 שעות לאחר ההתאוששות. אחזר את הזבובים לבדיקה. השתמש רק בזבובים שכותבים את עצמם.

כאשר הם מוטרדים, צפו בזבובים ערופי מיקרוסקופ פלואורסצנטי מנתח כדי לזהות שיבוטים הומוזיגוטיים המסומנים ב-GFP. בזיפים איברי חישה חיצוניים. רשום את שם הזיפים והאם הוא בצד שמאל או ימין של הזבוב, עורר רפלקס טיפוח על ידי הסטת הזיפים המסומנים ב-GFP לכיוון גוף הזבוב עם שיער נוקשה או מלקחיים עדינים והתבונן בתגובת הרגליים.

ציון סינוס של 1 לזבובים שמרימים את רגלם בתגובה לגירוי זיפים וציון סינוס של אפס לזבובים שאינם מזיזים את רגליהם. כשאפשר. אנו בודקים זבובים שיש להם רקמת פסיפס על הזיפים שלאחר AOR, המגיבים היטב לגירוי באמצעות הבדיקה ההתנהגותית בזיפים שלאחר AOR, בעוד שזבובים מסוג הושוו מול המוטציה הידועה הרגישה למכאנו ללא פוטנציאל קולטן מכאנו C או NMSI שיבשו את תגובת הטיפוח זבובי בקרת הגיבו ל-34% מגירויי הזיפים שלהם.

לעומת זאת, בעלי חיים עם זיפים שהיו הומוזיגוטיים עבור NMSI הראו תגובה של 2%. בעקבות הליך זה וזיהוי גן תגובה התנהגותי חדש, ניתן להשתמש בניסויים נוספים כגון אלקטרופיזיולוגיה ולוקליזציה של חלבונים. כדי לאפיין עוד יותר את תפקידו של גן זה, למשל, אנו יכולים לענות על השאלה האם הגן מעורב בהתמרת תחושת מנו או בהתפתחות נוירונים חושיים של מנוס.