Name: התנהגות Assay עבור Mechanosensation של MARCM מבוסס משובט ב תסיסנית melanogaster (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 48 s
Description: למדו שיטת MARCM לזיהוי מוטציות המשפיעות על מכנוסנסציה ב-Drosophila melanogaster. שיטת הסקר המוזאיקית מאפשרת לבחון מוטציות קטלניות באמצעות שיבוטים גנטיים ומדידת תגובות התנהגותיות לגירוי מישוש.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות למרכז Bloomington המניות, Liqun לואו, צ&#39;רלס צוקר, ולילי וYuh Nung יאן לשיתוף הנדיב של מניות לטוס ובא למימון: somas-URM (לJD וSW), בוגר תואר ראשון פורד פקולטה קיץ המלגה (לSW), BD תאגיד קיץ מחקר המלגה (לCL וDL), רנה ואנתוני מ &#39;מרלון, MD 63&#39; קיץ מחקר מלגה (לDL) ג&#39;יימס ג 75 וג&#39;יין Colihan קיץ מחקר מלגה (TO) דרך הבוגרים / הורה קיץ קרן מחקר של המכללה לצלב הקדוש וסטראנסקי קרן מלגת מחקר הקיץ (ל). תודה מיוחדת למחלקה לביולוגיה ומשרד הדיקן במכללה לצלב הקדוש לתמיכה של כל העבודה במעבדה.

1. צלבים כדי ליצור זבובים MARCM <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על זבובים בתקשורת קמח תירס מולסה (אגר L / 6.5 G; 23.5 גר &#39;/ שמרי L, 60 גר&#39; / קמח תירס L, 60 מיליליטר מולסה / L, 4 מיליליטר / תערובת חומצת L; 0.13% Tegosept) או תקשורת תסיסנית סטנדרטית ב 22 מעלות צלזיוס בשעת 12 מחזור אור / חושך. הערה: נמוך מהטמפרטורה סטנדרטית משמש כדי לשמור MARCM-מניות בריאים. זה מרחיב את הזמן התפתחותי בין הביצה והבגרות ל -14 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש נקבות בתולה (כ 1 - 8 ימים ההם) ממניות MARCM מוכנה המכיל אלמנטים גנטיים הנחוצים (GFP תחת שליטתו של רצף הפעלה-במעלה הזרם (כטב&quot;מ-GFP), חלבון Gal80 מדכאים, גורם שעתוק Gal4, חום-הלם recombinase מונע, ואתר רקומבינציה FRT). הערה: מוכנות מניות MARCM מכילות גנוטיפים הבאים: elavGal4, כטב&quot;מ-CD8-GFP, HS-flipase; FRT40A, tubGal80 / ארגון נוער קתולי; tubGal4 / TM3Sb. הערה: אתר FRT הספציפי יהיה תלוי במיקום של המוטציהבגנום. לדוגמא, FRT40A משמש לבדיקת מוטציות בזרוע השמאלית של כרומוזום 2, כגון NOMPC (ראה 10 לפרטים נוספים על פרוטוקולי MARCM). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקבות צלב MARCM מוכן בתולה לגברים המכילים מוטציה של עניין והאתר שלה המתאים FRT (לדוגמא, להתראות, ביל; NOMPC3, FRT40A / ארגון נוער קתולי; + / +). כדי לשלוט על האינדוקציה MARCM יעילה, להגדיר צלב שני באמצעות זבובי זכרים מכילים את אותו אתר FRT, אך ללא מוטציה. השתמש יחס משוער של 5 נקבות: זכר 1 בצלבים. </li></ol> 2. מתוזמן הטלת ביצים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מאפשר זבובים להזדווג ללילה אחד לפחות, לעבור מבוגרים לתוך צלוחיות חדשות עם תקשורת טרי. לאפשר זבובים להטיל ביצים בסביבה חשוכה למשך כ 4 שעות לפני העברה שוב הצלבים לתוך צלוחיות חדשות. שים לב לזמני ההתחלה וסיום של תקופת הטלת ביצים. הערה: מרווחים קצרים יותר מקובלים כאשר נראה שיש מספר גבוה של ביצים על התקשורת לפני סוף interva 4 HR-l. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור צלוחיות עם מספר מספיק של ביצים (כ יותר מ -20) וחנות בשעה 12 מחזור אור / חושך ב 22 מעלות צלזיוס להיות חום בהלם מאוחר יותר. הערה: בקבוקים עם מספר נמוך של ביצים על התקשורת (פחות מכ -20) צפויים להניב כמות מספקת של מבוגר הזבובים לבדיקת התנהגות והאינטרס של יעילות מומלץ הם לא יישמרו לבדיקה נוספת. הערה: הזבובים שלנו גדלים עם האורות ב08:00-20:00. מצאנו זמן ערב נקודות יובילו לצפיפות גבוהה יותר ביצה, ולכן בדרך כלל לבצע צלבי מתוזמן בין 4 - 8 בערב ושעה 8 בערב-חצות. הזבובים מטילים את ביציהם על RT בארון חשוך ולאחר מכן הם חזרו לחממה למחרת כדי לא להפריע למחזור אור-חושך הקבוע בחממה. </li></ol></li></ol> .3 בצע חום הלם כדי לגרום mitotic רקומבינציה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כ 85-100 לאחר הטלת ביצי HR, נ &#39;המקוםials לתוך אמבט מים בחום של 37 מעלות במשך שעה 1. ודא כי מפלס המים מגיע מעל לגובה של התקשורת בבקבוקונים, אבל לא לצלול באופן מלא את הבקבוקונים כדי למנוע את זחלי מטביעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר צלוחיות מאמבט מים ולאפשר תקופת החלמה שעה 1 ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקבוקוני מקום בחזרה ל37 מעלות צלזיוס אמבט מים במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר צלוחיות מאמבט מים וחנות בחממה על מחזור אור / חושך של 12 שעות ב 22 מעלות צלזיוס עד eclosion. </li></ol> 4. הכנה לבחינות להתנהגות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות eclosion, להרדים זבובים על קרח. בחר זבובים עם גנוטיפים המכילים את כל המרכיבים הגנטיים לMARCM ומצביעים על השיבוטים מסומנים ביטוי של GFP צפוי להיות נצפו מבוססים על סמני הפנוטיפ הנצפים משמשים במניות ההורה. לערוף זבובים עם המספריים iridectomy. הערה: לדוגמא, בחרנו לזבובים ללא סמנים הגנטיים ארגון נוער קתולי (כנפיים מתולתלות) וSb (זיפי זיפים) לזיהה אתזבובי פ.י. שיכילו את כל המרכיבים הגנטיים הדרושים כדי ליצור אזורי פסיפס מסומנים עם GFP. הערה: עריפת הראש הוא הכרחית כדי למנוע מהמבוגרים עפו משם כאשר מגורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הניחו זבובים חסרי ראש בסביבה סגורה, לחה ולאפשר כ 10 - 20 שעות של התאוששות. שימוש רק זבובים שזכות עצמם כאשר מוטרדים לבדיקה נוספת. מבחן זבובים בתוך 30 שעות של עריפת ראש. </li></ol> 5. בדיקות התנהגותיות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על ידי התבוננות זבובים ערופים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי לנתח, לזהות שיבוטים הומוזיגוטים מסומנים עם GFP באיברי החישה החיצוניים זיפים. רשום את שם הזיפים וצד שמאל או ימין. לחסל את כל הטיה פוטנציאלית, חבר המעבדה מבצע את גירוי הזיפים צריך להיות עיוור לגנוטיפ של הזיפים, wild-type או מוטציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעורר רפלקס טיפוח על ידי הסטת GFP המסומנת זיפים כלפי גוף הזבוב עם שיער נוקשה או מלקחיים עדינים ולבחון את הרגל מחדשsponse. נותן ציון של אחד לזבובים שלהרים את רגלם בתגובה לגירוי וזיפי ציון אפס לזבובים שלא להזיז את הרגליים שלהם. הערה: מחקרים קודם 6,7 אפיינו את תגובת הרגל שהושרה על ידי גירוי זיפים מסוימים. זה כולל את הרגל שמגיבה לכל זיפים ואת חלקם של זבובים שמגיבים לגירוי של זיפים מסוימים. אנחנו רק כבש עבור תנועות של הרגל שצפויה להגיב מבוססים על הסיווג של Vandervorst 6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנהל חמישה ניסויים במרווחים 2 דקות זה מזה. </li></ol>

<ol><li>Grünert, U., Gnatzy, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((K%2B+and+Ca%2B%2B+in+the+receptor+lymph+of+arthropod+cuticular+mechanoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Physiol+A%22%5BJournal%5D)">K+ and Ca++ in the receptor lymph of arthropod cuticular mechanoreceptors.</a> J Comp Physiol A. 161, 329-333 (1987).</li>
<li>Kernan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanotransduction+and+auditory+transduction+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Mechanotransduction and auditory transduction in Drosophila.</a> Pflugers Arch. 454, 703-720 (2007).</li>
<li>Gillespie, P. G., Walker, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+mechanosensory+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of mechanosensory transduction.</a> Nature. 413, 194-202 (2001).</li>
<li>Corfas, G., Dudai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+and+fatigue+of+a+mechanosensory+neuron+in+wild-type+Drosophila+and+in+memory+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Adaptation and fatigue of a mechanosensory neuron in wild-type Drosophila and in memory mutants.</a> J Neurosci. 10, 491-499 (1990).</li>
<li>Kernan, M., Cowan, D., Zuker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+mechanosensory+transduction%3A+mechanoreception-defective+mutations+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of mechanosensory transduction: mechanoreception-defective mutations of Drosophila.</a> Neuron. 12, 1195-1206 (1994).</li>
<li>Vandervorst, P., Ghysen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+control+of+sensory+connections+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetic control of sensory connections in Drosophila.</a> Nature. 286, 65-67 (1980).</li>
<li>Corfas, G., Dudai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Habituation+and+dishabituation+of+a+cleaning+reflex+in+normal+and+mutant+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Habituation and dishabituation of a cleaning reflex in normal and mutant Drosophila.</a> J Neurosci. 9, 56-62 (1989).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery-based+science+education%3A+functional+genomic+dissection+in+Drosophila+by+undergraduate+researchers%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Discovery-based science education: functional genomic dissection in Drosophila by undergraduate researchers.</a> PLoS Biol. 3, e59(2005).</li>
<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22, 451-461 (1999).</li>
<li>Wu, J. S., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+%28MARCM%29+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A protocol for mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) in Drosophila.</a> Nature Protocols. 1, 2583-2589 (2006).</li>
<li>Eberl, D. F., Hardy, R. W., Kernan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+similar+transduction+mechanisms+for+touch+and+hearing+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genetically similar transduction mechanisms for touch and hearing in Drosophila.</a> J Neurosci. 20, 5981-5988 (2000).</li>
<li>Walker, R. G., Willingham, A. T., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Drosophila+mechanosensory+transduction+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A Drosophila mechanosensory transduction channel.</a> Science. 287, 2229-2234 (2000).</li>
<li>Yan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+NOMPC+is+a+mechanotransduction+channel+subunit+for+gentle-touch+sensation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Drosophila NOMPC is a mechanotransduction channel subunit for gentle-touch sensation.</a> Nature. 493, 221-225 (2013).</li>
<li>Arnadottir, J., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+Mechanosensitive+Channels%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic Mechanosensitive Channels.</a> Annual Review of Biophysics. 39, 111-137 (2010).</li>
<li>Christensen, A. P., Corey, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRP+channels+in+mechanosensation%3A+direct+or+indirect+activation%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">TRP channels in mechanosensation: direct or indirect activation?</a> Nature Reviews Neuroscience. 8, 510-521 (2007).</li>
<li>Cheng, L. E., Song, W., Looger, L. L., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+the+TRP+Channel+NompC+in+Drosophila+Larval+and+Adult+Locomotion%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The Role of the TRP Channel NompC in Drosophila Larval and Adult Locomotion.</a> Neuron. 67, 373-380 (2010).</li>
<li>Lee, J., Moon, S., Cha, Y., Chung, Y. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+TRPN%28%3DNOMPC%29+channel+localizes+to+the+distal+end+of+mechanosensory+cilia%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Drosophila TRPN(=NOMPC) channel localizes to the distal end of mechanosensory cilia.</a> PLoS One. 5, e11012(2010).</li>
<li>Liang, X., Madrid, J., Saleh, H. S., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NOMPC%2C+a+Member+of+the+TRP+Channel+Family%2C+Localizes+to+the+Tubular+Body+and+Distal+Cilium+of+Drosophila+Campaniform+and+Chordotonal+Receptor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">NOMPC, a Member of the TRP Channel Family, Localizes to the Tubular Body and Distal Cilium of Drosophila Campaniform and Chordotonal Receptor Cells.</a> Cytoskeleton. 68, 1-7 (2011).</li>
<li>de Vries, S. E., Clandinin, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loom-sensitive+neurons+link+computation+to+action+in+the+Drosophila+visual+system%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Loom-sensitive neurons link computation to action in the Drosophila visual system.</a> Curr Biol. 22, 353-362 (2012).</li>
<li>Jarman, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+mechanosensation+using+the+fly%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Studies of mechanosensation using the fly.</a> Hum Mol Genet. 11, 1215-1218 (2002).</li>
</ol>

יש הסופרים לא אינטרסים כלכליים מתחרים.

פרוטוקול זה מנצל assay התנהגות בוגר למסך למוטציות המשפיעות mechanosensation בדרוזופילה. בגלל האוסף של מוטציות מכיל מוטציות p-אלמנט קטלניים שימנע הקרנה כמבוגרים, פרוטוקול זה עושה שימוש בטכניקה גנטית מורכבת שתוארה לראשונה על ידי לי ולואו , (1999) וכמפורט בפרוטוקול על ידי וו ולואו, (2006) לעקוף קטלני מבוגר. MARCM גורם רקומבינציה mitotic בין כרומוזומים הומולוגיים ליצור אזורים משובטים של תאים הומוזיגוטים. אזורים אלה מסומנים עם GFP בגלל האובדן של החלבון המדכא, אמבטיה-GAL80 המתר...

בני אדם מסתמכים על היכולת להמיר גירויים מכניים מסביבתם, כגון מגע, לחץ, רטט או גלי קול, למידע חושי שיכול להיות מעובד על ידי מערכת העצבים, בתהליך הנקרא מכני-טרנסדוקציה. רבים מהמאפיינים המכאניסטיים הכוללים של טרנסדוקציה מכנית בין בני אדם לחסרי חוליות זהים1, מה שהופך את דרוזופילה למודל שימושי לחקר המנגנונים המולקולריים של טרנסדוקציה מכנית. Drosophila melanogaster מכיל שתי קבוצות של איברי חישה מיוחדים (סוג I ו- II) המסוגלים להמיר גירויים מכניים לפוטנציאל פעולה. לקולטנים מכניים מסוג I יש נוירון עם דנדריט יחיד או תהליך תחושתי, מוקף בשלושה תאי תמיכה2. הקולטנים המכניים מסוג I כוללים קולטנים מכניים זיפים, איברים כורדוטונליים רגישים לשמיעה (איבר ג'ונסטון) ורגישות קמפניפורמית המעבירה מידע על פעימות כנף3. הזיפים המכסים את הצד הגבי של הזבוב הם הנפוצים והנגישים ביותר מבין האיברים מסוג I. בדומה לסביבה החוץ-תאית של תאי שיער הקשורה לשמיעה ושיווי משקל בבעלי חוליות, תאי התמיכה המקיפים נוירונים רגישים למכניקה של זבובים מפרישים אנדולימפה גבוהה של אשלגןהיוצרת שיפוע ריכוז יוצא דופן עבור אשלגן 1. נוירונים רגישים למכניקה, הן של מערכת היונקים והן של מערכת הזבובים, מנצלים את האשלגן החוץ-תאי הגבוה הזה כדי לבצע דה-פולריזציה של התא. בתגובה לגירוי מכני של זיפי המקרוכאט לכיוון דופן הגוף, הנוירונים החושיים מגיבים בפרץ של פוטנציאל פעולה המונע על ידי דה-פולריזציה זו של אשלגן של קרום התא4. הנוירונים החושיים של דרוזופילה המעצבבים זיפים דומים לתאים הרגישים למכניקה של אורגניזמים אחרים, כולל תאי שיער של בעלי חוליות, הן במבנה והן בתפקוד1,5. הנגישות של איברי החישה החיצוניים של דרוזופילה למניפולציה ניסויית ושפע הטכניקות הגנטיות העומדות לרשות החוקרים הופכים את דרוזופילה למערכת מודל מצוינת לחקירת היסודות המולקולריים של תחושה מכנית. 
בזבוב, גירוי של נוירון חושי יחיד שמעצבב זיפים מוביל לתגובה התנהגותית נצפית. גירוי של זיפים שונים מעורר תגובות התנהגותיות ספציפיות הניתנות לשחזור, בהתאם לזיפים המגורים. עם גירוי מישוש, זבובי בר ערופי ראש מציגים רפלקס טיפוח מורכב שבו הם מנקים את האזור ליד הזיפים המגורים עם סט מעוצב של תנועות רגליים5-7. כאשר הם הומוזיגוטיים למוטציות ידועות בגן יחיד המפריעות ללמידה7 או קואורדינציה ופעילות תנועתית5, זבובים מגיבים בצורה לא נורמלית לגירוי מכני. רפלקס טיפוח זה הוא אפוא כלי שימושי לחקר ההשפעות של מוטציות בגן בודד על התנהגות ספציפית הניתנת לשכפול.
התגובה ההתנהגותית החזקה לגירוי של זיפי מקרוכאט בודדים טומנת בחובה פוטנציאל לסייע בזיהוי גנים חדשים המעורבים בטרנסדוקציה מכנית. פרוטוקול זה משמש לבדיקת אוסף של זבובים מוטנטיים להיעדר תגובה התנהגותית כדי להצביע על כך שהמוטציה מפריעה לתחושה המכנית. באוסף המוטאנטים שנבחר לסינון, המוטציות גורמות לקטלניות לפני הבגרות, ולכן לא ניתן יהיה לבדוק באמצעות מסכי התנהגות מסורתיים של מבוגרים. במקור, אוסף זה של רכיבי p קטלניים שולב עם אתרי רקומבינציה של FRT כדי לבדוק פגמים בצמיחת תאים בשיבוטים. השיבוטים נוצרו במיוחד בעין מכיוון שזבובים בוגרים יכולים לשרוד במעבדה ללא ראייה פונקציונלית8. עם זאת, הסרת כל התחושה המכנית עלולה לגרום למבוגרים להיות לא מתואמים באופן חמור או למות לפני אקלוזיה5. פרוטוקול זה משתמש בגישת פסיפס כדי לעקוף את הקטלניות של המוטציות ולאפשר בדיקה בשלב המבוגרים. טכניקה גנטית הנקראת ניתוח פסיפס עם סמן תא מדכא (MARCM)9 משמשת ליצירת תאים מוטנטיים הומוזיגוטיים במספר מוגבל של איברי חישה של זבובים בוגרים, בעוד ששאר האורגניזם נותר הטרוזיגוט. זבובי MARCM אלה שורדים בקלות עד לבגרות, אך הזיפים הומוזיגוטיים עבור הגנים הקטלניים המעניינים.
MARCM מאפשר לאזורים של תאים מוטנטיים הומוזיגוטיים להיווצר ולהיות מסומנים על ידי ביטוי של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), בעוד ששאר האורגניזם נשאר הטרוזיגוטי באותו מקום מסוים ולא מסומן9. MARCM משלב מוטציות בודדות של יסודות p עם חמישה אלמנטים גנטיים נפוצים: GFP בשליטה של רצף מפעיל במעלה הזרם (UAS-GFP), חלבון מדכא Gal80 בשליטה של מקדם כללי (tub-Gal80), גורם שעתוק Gal4 בשליטה של מקדם כללי (tub-Gal4), אנזים רקומבינאז FRT המתבטא באמצעות מקדם מבוקר הלם חום, ואתר רקומבינציה FRT10. על ידי הנעת רקומבינאז מיטוטי באמצעות רקומבינאז המופעל על ידי הלם חום, מספר מוגבל של תאים הופכים להומוזיגוטים עבור המוטציה ומסומנים ב-GFP. ביטוי GFP מדוכא בתאים הטרוזיגוטיים על ידי נוכחות Gal80 על העותק הפראי של הכרומוזום. 
פרוטוקול הלם חום עבור MARCM עבר אופטימיזציה כדי לגרום לרקומבינציה באיברי החישה החיצוניים של זיפי הזבוב, בעוד שחלק גדול מהאורגניזם נותר הטרוזיגוט, ולכן אינו מסומן ב-GFP. זבובי פסיפס שנוצרו באמצעות פרוטוקול זה הכילו מוטציות הומוזיגוטיות לרוב בזיפים המרכזיים האחוריים או הגביים על פני השטח של הנוטום. 
בדקנו את התועלת של שילוב זה של MARCM ומסך התנהגות הטיפוח עם מוטציה ידועה רגישה למכניקה, NOMPC. תעלת היונים, ללא פוטנציאל קולטן מכני C (NOMPC), היא מרכיב חיוני במסלול הטרנסדוקציה המכנית בדרוזופילה5,11-13. NOMPC שייך למשפחת העל של פוטנציאל הקולטן החולף (TRP) של תעלות קטיון5 ועונה על כל הקריטריונים כדי לזכות בתעלה רגישה למכניקה בדרוזופילה14,15: 1) NOMPC מתבטא בקצות הריסים של נוירונים חושיים מסוג 1 של דרוזופילה 13,16-18, 2) לזחלי אפס NOMPC אין תגובה חשמלית לגירוי מישוש13, 3) ביטוי חוץ רחמי של NOMPC בתאים לא רגישים למגע יכול לגרום לרגישות לגירוי מכני13, 4) ביטוי הטרולוגי של NOMPC בתאי שניידר 2 מניב ערוץ רגיש למכניקה13, ו-5) מוטנטים בוגרים של NOMPC מציגים פגמים בתגובתם לגירוי מכני5. בהתחשב בראיות אלה, חזינו כי שיבוטים מוטנטיים של NOMPC יראו תגובת טיפוח שונה או מעוכבת בתגובה לגירוי מכני של זיפים.
מלאי MARCM המכיל את מוטציית NOMPC פותח לשימוש בניסוי הוכחת עקרונות של מבחן הטיפוח. זבובי פסיפס גורו בזיפים מקרו-כאטיים המכילים תאים מוטנטיים הומוזיגוטיים של NOMPC. ציפינו לעיכוב של תגובת הטיפוח בעקבות גירוי של זיפי המקרוכאט. מצאנו שרק 2 מתוך 14 זבובי זיפים מוטנטיים שנבדקו נתנו תגובה אחת לגירוי חוזר; רובם לא הגיבו לגירוי של הזיפים המוטנטיים ההומוזיגוטיים. לאחר שאישרנו כי בדיקה התנהגותית מבוססת MARCM מייצרת רפלקס טיפוח חריג במוטציה ידועה של פסיפס רגיש למכניקה, ניתן להשתמש בטכניקה זו במסך למוטציות רגישות מכניות נוספות.

<table><tbody><tr><td>שמרי בירה (25 ליברות)</td><td>MP ביו-רפואיים&nbsp;</td><td>ICN90331225&nbsp;</td><td>מזון זבוב</td></tr><tr><td>תירס (25 ליברות)</td><td>MP ביו-רפואיים&nbsp;</td><td>ICN90141125&nbsp;</td><td>מזון זבוב</td></tr><tr><td>אגר (1 ליברות)</td><td>מוראגר בע"מ</td><td>41004</td><td>מזון זבוב</td></tr><tr><td>Tegosept (5 ק"ג)</td><td>Genesee</td><td>20-259</td><td>מזון זבוב</td></tr><tr><td>מולסה (1 ליטר)</td><td>מותג טחנת סוכר - Thomsen Food Service</td><td>0 2625</td><td>מזון זבוב</td></tr><tr><td>חומצה פרופיונית</td><td>פישר</td><td>A258-500</td><td>מזון זבוב</td></tr><tr><td>חומצה זרחתית</td><td>פישר</td><td>A260-500</td><td>מזון זבוב</td></tr><tr><td>בקבוקוני דרוזופילה, צר (PS)</td><td>Genesee</td><td>32-109</td><td>תרביות זבובים</td></tr><tr><td>6oz בקבוק תחתון מרובע (PP)</td> <td>Genesee</td><td>32-130</td><td>תרביות זבוב</td></tr><tr><td>Flugs - בקבוקי זבוב מפלסטיק</td><td>Genesee</td><td>49-100</td><td>תרביות זבוב כדורי</td></tr><tr><td>זהורית,</td><td>גדול Genesee</td><td>51-100</td><td>תרביות זבוב</td></tr><tr><td>מילוי דרוסו, Genesee</td><td></td><td>צר 59-168</td><td>הכנת מזון זבוב</td></tr><tr><td>מילוי דרוסו, בקבוקים</td><td>Genesee</td><td>59-170</td><td>מזון זבוב הכנה</td></tr><tr><td>8A-C / מערבל מעבדה מונע הילוכים עם תושבת c-clamp &nbsp; 1/15 כ"ס, מהירות משתנה 700 סל"ד, 115 וולט, 50/60 הרץ</td><td>קליבלנד מיקסר</td><td>8A-C</td><td>הכנת מזון זבוב</td></tr><tr><td>קומקום מעוטר במים הכנת</td><td></td><td></td><td>מזון זבוב</td></tr><tr><td>תא צמיחה יומי</td><td>פורמה טמפרטורה מדעית</td><td></td><td>ומחזור אור/חושך מבוקר</td></tr><tr><td>אמבט מים</td><td>VWR</td><td></td><td>לחום MicroScissors לזעזועים</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>כלים מדעיים</td><td>&nbsp; 15000-08</td><td>להסרת ראשים</td></tr><tr><td>פלורסנס חיתוך מיקרוסקופ</td><td>Zeiss</td><td>SteREO Discovery V8&nbsp;</td><td>עם קוביית GFP (KSC295-814D) מסנן מעבר פס</td></tr><tr><td>מקור אור Fluroscence</td><td>Zeiss</td><td>X-Cite 120</td><td>צינור אור סיבים אופטיים מקל על הגדרה&nbsp;</td></tr><tr><td>מצלמה עבור היקף</td><td>Zeiss</td><td>AxioCam ICc1</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת רכישת תמונה</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>דלי</td><td></td><td></td> קרח <td>עבור אנתזיה קרה</td></tr><tr><td>מגש</td><td></td><td></td> אנתזיה קרה תוצרת בית <td>לעריפת ראש אנתזיה קרה</td></tr><tr><td>קופסאות</td><td></td><td></td> פלסטיק <td>לשחזור זבובים מפורקים בסביבה לחה</td></tr></tbody></table>

התנהגות assay עבור mechanosensation של marcm מבוסס משובט ב<em&gt; תסיסנית melanogaster</em

A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

בגלל ההומולוגיה המבנית ותפקודית של תאי שיער באוזן הפנימית היונקים, תאי העצב שמעצבבים את איברי חוש חיצוניים תסיסנית לספק מערכת מודל מצוינת ללימוד mechanosensation. פרוטוקול זה מתאר מגע התנהגות פשוטה בזבובי פירות שיכולים לשמש לזיהוי מוטציות שמפריעות mechanosensation. גירוי חוש המישוש של macrochaete זיפים על בית החזה של זבובים מעורר רפלקס טיפוח משתי הרגל הראשונה או שלישית. מוטציות שמפריעות mechanotransduction (כגון NOMPC), או בהיבטים אחרים של קשת רפלקס, יכולות לעכב את תגובת הטיפוח. מסך מסורתי של התנהגויות בוגרות הייתי מחמיץ מוטציות שיש תפקידים חיוניים בפיתוח. במקום זאת, פרוטוקול זה משלב מסך המגע עם ניתוח פסיפס עם סמן תא repressible (MARCM) כדי לאפשר רק לאזורים מוגבלים של תאים שעברו מוטציה הומוזיגוטים להיות שנוצר ומסומן על ידי expression של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP). על ידי בדיקת השיבוטים MARCM לתגובות התנהגותיות חריגות, אפשר להקרין אוסף של מוטציות p-אלמנט קטלניים כדי לחפש גנים חדשים המעורבים בmechanosensation שהיה החמיצו בשיטות מסורתיות יותר.

ההצלחה של פרוטוקול זה תלוי במידה רבה על התשואה הכוללת של זבובים הניתנים לבדיקה, את האפקטיביות של הלם החום כדי לגרום לרקומבינציה mitotic, ואת היכולת להשיג תגובה התנהגותית חזקה בזבובי מגורה ב -2 דקות במרווחים. בהתחשב בכך 12.5% ​​משוערים של עוברים מכילים את האלמנטים ההכרחיים וMARCM 16.67% משוערים של מבוגרים שיש לי eclose הפוטנציאל לביטוי של GFP, זה הוא קריטי להשגת מספר גבוה של ביצים במהלך מתוזמן מניח. דוגמא לעיתוי מוצלח שכבה על מרווח 4 שעות שהיה בשימו...

על מנת לזהות מוטציות חדשות המשפיעות על תחושה מכנית, תכננו בדיקה המודדת את התגובה ההתנהגותית לגירוי מישוש של זיפי זבובים בשיבוטים מוטנטיים שנוצרו בשיטת MARCM. שילוב הטכניקות מאפשר לזהות מוטציות רגישות למכניקה שאחרת היו קטלניות.

התנהגות Assay עבור Mechanosensation של MARCM מבוסס משובט ב<em&gt; תסיסנית melanogaster</em

Because of the structural and functional homology to the hair cells of the mammalian inner ear, the neurons that innervate the Drosophila external sense ...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לבחון מוטציות המשפיעות על תחושת Meno בזבובים בוגרים. שיטה זו יכולה לסייע בזיהוי שאלות מפתח בתחום תחושת ה-Meno, כגון זיהוי התעלה הרגישה ל-Meno. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שבאמצעות שימוש בבעלי חיים פסיפסאיים (mosaic), אנו יכולים לסנן מוטציות שאלמלא כן היו קטלניות עבור האורגניזם.באמצעות שימוש במסך פסיפס (mosaic screen), אנו יכולים לזהות מוטציות שייתכן והוחמצו במסכים התנהגותיים מסורתיים יותר. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית. שלבי הבדיקה ההתנהגותית קשים ללמידה.נדרשת יד יציבה וניסיון כדי לזהות את השערות הרלוונטיות. כדי להתחיל בניסוי, תחזקו את הזבובים על מצע קורנמיל-מולס (cornmeal molasses) ואחסנו אותם באינקובטור. השגו נקבות בתולות ממאגר markum ready המכיל את האלמנטים הגנטיים הדרושים.הכריזו את הנקבות הבתולות המוכנות לסימון (markum ready) עם זכרים הנושאים את המוטציה הרצויה ואת אתר ה-FRT התואם לה. לאחר מכן, בצעו את ההכראה השנייה כביקורת באמצעות זכרים הנושאים את אותו אתר FRT, אך ללא מוטציה. ביחס של חמש נקבות לזכר אחד, ולאחר שהזבובים הזדווגו במשך לילה אחד לפחות, העבירו את הבוגרים למבחנות חדשות עם מצע טרי.הנחו את הזבובים להטיל את ביציהם בטמפרטורת החדר בתוך ארון חשוך. לאחר שהזבובים הטילו ביצים, העבירו את ההכלאות למבחנות חדשות. תעדו את זמני ההתחלה והסיום של תקופת הטילת הביצים.שמרו את המבחנות שבהן הושמו יותר מ-20 ביצים לצורך הלם חום והחזירו אותן לאינקובטור. 85 עד 100 שעות לאחר הנחת הביצים, הניחו את המבחנות באמבט מים; ודאו שגובה המים גבוה מגובה המצע, אך שאינו שוקע את המבחנות לחלוטין. לאחר שעה אחת, הוציאו את המבחנות מאמבט המים ואפשרו לזבובים תקופת התאוששות.לאחר ההתאוששות, החזירו את המבחנות למקלח המים למשך שעה אחת. הוציאו את המבחנות ממקלח המים והחזירו אותן לאינקובטור לאחר הרדמה. את הזבובים הניחו על קרח.לאחר שהזבובים אינם ניידים, בחרו פרטים בעלי כל התכונות הרצויות. לאחר מכן, בצעו כריתת ראש זהירה לזבובים שנבחרו באמצעות מספרי אירידקטומיה, תוך הקפדה על מיקום המספריים בין הראש לחזה. חתכו את החיבור מבלי לפגוע בחזה.הניחו את הזבובים ללא הראש בסביבה סגורה ולחה והניחו להם להתאושש למשך 10 עד 20 שעות. אספו את הזבובים לבדיקה. השתמשו רק בזבובים שמתעוררים מעצמם.בעת הפרעה, בחנו זבובים ערופים תחת מיקרוסקופ דיסקציה פלואורסצנטי כדי לזהות שיבוטים הומוזיגוטיים המסומנים ב-GFP. באיברי החישה החיצוניים של השערות (bristles), רשמו את שם השערה ואם היא נמצאת בצדו השמאלי או הימני של הזבוב, עוררו רפלקס ניקוי על ידי הסטה של השערה המסומנת ב-GFP לכיוון גוף הזבוב באמצעות שערה קשיחה או פינצטה עדינה, ובחנו את תגובת הרגל.ציון סינוס של אחת לזבובים המרימים את רגלם בתגובה לגירוי של השערה, וציון סינוס של אפס לזבובים שאינם מזיזים את רגליהם. במידת האפשר, אנו בוחנים זבובים בעלי רקמה פסיפסית בשערות ה-post AOR, המגיבות היטב לגירוי באמצעות הבדיקה ההתנהגותית בשערות post AOR, בעוד שזבובים מסוג זה הושוו למוטנט רגיש-מכני ידוע שבו פוטנציאל קולטן מכני חסר או NMSI שיבש את תגובת הטיפוח; זבובי ביקורת הגיבו ב-34% מגירויי השערה שלהם.לעומת זאת, בעלי סיכות שהיו הומוזיגוטים ל-NMSI הפגינו תגובה של 2%. בעקבות הליך זה וזיהוי של גן תגובה התנהגותית חדש, ניתן להשתמש בניסויים נוספים כגון אלקטרופיזיולוגיה ומיקום חלבונים. כדי לאפיין יותר את תפקידו של גן זה, נוכל לענות, למשל, על השאלה האם הגן מעורב בהעברת התחושה של המנו (meno) או בהתפתחות של נוירוני החישה של המנו.

a-behavioral-assay-for-mechanosensation-marcm-based-clones-drosophila

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

תסיסנית melanogaster היא מערכת גנטית התנהגותית מודל צייתן, שבו נעשה שימוש כדי להבין את הבסיס המולקולרי התאי של תהליכים ביולוגיים רבים חשובים יותר ממאה שנים 1. תסיסנית נוצלה היטב כדי לקבל תובנות לתוך הבסיס הגנטי של ההתנהגות במהירות הבזק.

שיטות Assay תסיסנית התנהגות

סרטון זה מתאר שיטה פשוטה לכימות תנועת הזבובים ומציג את בדיקת הטיפוס שבוצעה. מבחן טיפוס הזבובים הוא מבחן כללי של תפקוד מוטורי המסתמך על תגובת גיאוטקסיס שלילית.

בדיקת טיפוס זבובים: שיטה לבדיקת תנועה כללית בדרוזופילה מלנוגסטר

במאמר זה וידאו, אנו מתארים assay אוטומטי כדי למדוד את ההשפעה של רעב או שובע על התנהגות חיפוש מזון תלויה בריח הפירות המבוגרים לעוף melanogaster דרוזופילה.

יחיד לטוס Assay עבור התנהגות שיחור מזון ב דרוזופילה

אנו מציגים מבחן אמריקאי כדי לחשוף את ההשפעה של ניחוחי על התנהגות דרוזופילה באמצעות assay Y-מבוך.

בדיקה<em&gt; דרוזופילה</em&gt; Olfaction עם Assay Y-מבוך

אנו מתארים כאן הגדרה התנהגותית ושיטת ניתוח נתונים לבדיקת תגובות הריח של עד 100 זבובי חומץ (Drosophila melanogaster). ניתן להשתמש במערכת זו עם גירוי ריח יחיד או מרובה, וניתנת להתאמה להפעלה אופטוגנטית או להשתקה של תת-קבוצות עצביות.

התנהגויות חוש הריח assayed ידי מעקב ממוחשב של<em&gt; תסיסנית</em&gt; בתוך אולפקטומטר ארבעה-רביע

כאן אנו מדגימים assay הרומן ללמוד nociception קר הזחלים תסיסנית. assay זה מנצל בדיקה שהותקנה פלטייה מסוגל ליישם גירוי קור מוקד רעיל וכתוצאה מכך התנהגויות קרות ספציפיות הניתנות לכימות. טכניקה זו תאפשר דיסקציה תאית ומולקולרית נוספת של nociception הקר.

Assay רומן עבור הקרה Nociception ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; זחלים

מטרת פרוטוקול זה היא להראות כיצד לבצע בדיקה משופרת עבור nociception מכני בזחלים Drosophila. אנו משתמשים בהסמכה כאן כדי להדגים כי רגישות יתר מכנית (allodynia והיפרלגזיה) קיימת בזחלים דרוזופילה.

מבחנים וכלים משופרים למדידת תפיסה מכנית בזחלי דרוזופילה

הפרוטוקול הנוכחי מעריך את הפעילות המוטורית של דרוזופילה על ידי מעקב וניתוח תנועת הזבובים בזירה בעבודת יד באמצעות תוכנת קוד פתוח פיג'י, התואמת לתוספים לפלח פיקסלים של כל פריים בהתבסס על הקלטת וידאו בחדות גבוהה כדי לחשב פרמטרים של מהירות, מרחק וכו '.

טכניקה פשוטה להערכת פעילות לוקומוטורית בדרוזופילה

מאמר זה מציג שיטות למניפולציה אופטוגנטית ב-Drosophila melanogaster, תוך שימוש ב-CsChrimson ו-GtACR2 כדי להפעיל ולהשתיק נוירונים ספציפיים. ארבעה ניסויים מתוארים לשימוש באופטוגנטיקה כדי לחקור התנהגויות תרמוטקטיות וטעמיות, ומספקים תובנות לגבי המנגנונים העצביים הבסיסיים השולטים בתהליכים אלה.

מבחנים התנהגותיים למניפולציה אופטוגנטית של מעגלים עצביים בדרוזופילה מלנוגסטר

הפרוטוקול מציג שיטה בעלת תפוקה גבוהה וחסכונית להערכת רעילות עצבית בזבוב הפירות באמצעות כימות תפקוד לקומוטורי כחלופה למודלים מסורתיים של יונקים. מטרתו להעריך את ההשפעות הנוירוטוקסיות של תרכובות פרמצבטיות, גורמים סביבתיים או שינויים גנטיים באמצעות מודל רגיש, ניתן לשחזור וחיובי מבחינה אתית.

ניתוח התנהגותי של תפקוד לקומוטורי ב-Drosophila melanogaster כקריאה לרעילות עצבית

פרוטוקול זה מספק מסגרת להערכת שינויים התנהגותיים הנגרמים מלחץ ב-Drosophila melanogaster. שילוב בדיקות משלימות מאפשר כימות של פעילות, חקר וקבלת החלטות עבור זבובים בודדים. הגישה גמישה וניתנת להתאמה למגוון רחב של מחקרים החוקרים ביולוגיה של לחץ, חילוף חומרים ותפקוד נוירו-התנהגותי.

פנוטיפ התנהגותי רב-מודלי של מצבים דמויי דיכאון הנגרם מלחץ בדרוזופילה מלנגסטר

למדו שיטת MARCM לזיהוי מוטציות המשפיעות על מכנוסנסציה ב-Drosophila melanogaster. שיטת הסקר המוזאיקית מאפשרת לבחון מוטציות קטלניות באמצעות שיבוטים גנטיים ומדידת תגובות התנהגותיות לגירוי מישוש.

התנהגות Assay עבור Mechanosensation של MARCM מבוסס משובט ב

גלה סרטונים נוספים