הערכת פנוטיפים מישורים-Cell-קוטביות ב Ciliopathy עכבר Mutant שבלול

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לבחון שבלול עכבר מוטנטי ריסני עבור פנוטיפים של קוטביות תאים מישוריים. טכניקות אלו מאפשרות פירוט נרחב של הפנוטיפ השבלול, מה שיוביל להבנה מדויקת יותר של המעורבות הרירית בביסוס איתות PCP של בעלי חוליות. היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא שלאחר השליטה, ניתן להשתמש באפיתל השבלול המנותח למגוון סוגים שונים של ניתוח פנוטיפי.

לאחר הכנת ריאגנטים ורקמות מחיות ניסוי, בשלב ההתפתחותי E16.5 עד p3, השתמש בלהב אזמל או במספריים קטנים כדי לנתח את הראש לאורך קו האמצע הסגיטלי המתחיל באף ומאריך את הקוטיל. הסר את המוח מכל מחצית של הגולגולת בעזרת זוג מלקחיים. לאחר מכן, זהה את העצמות הטמפורליות המכילות את המבוך הגרמי המתפתח של האוזן הפנימית.

בזמן העבודה עם הדגימה תחת מיקרוסקופ דיסקציה, השתמש בזוג מלקחיים כדי להרחיק את המבוך הגרמי מהגולגולת על ידי העברת המלקחיים בעדינות מתחת למבוכים הגרמיים. לאחר הדיסקציה, השתמש בקצה מלקחיים כדי לנקות את החלונות הסגלגלים והעגולים וליצור חור קטן בקודקוד ספירלת השבלול. לאחר מכן, יש לתקן את המבוך הגרמי ב-1.5 מיליליטר של 4% פרפורמלדהיד למשך חמש דקות על קרח כדי לאפשר הסרה קלה של הממברנה הטקטוריאלית.

כעת, הניחו את המבוך הגרמי בכלי חיתוך מצופה אלסטומר סיליקון שחור המכיל PBS כדי להקל על הדיסקציה. השתמש במלקחיים מספר חמש כדי להסיר את הסחוס החיצוני, וחשוף את צינור השבלול. התחל בחלון הסגלגל, הכנס את הקצה התחתון של המלקחיים לחלון הסגלגל, ופתח בעדינות את הסחוס, נע לאט כלפי מעלה לכיוון הקודקוד.

לאחר מכן, השתמשו בזוג מלקחיים עדינים כדי לצבוט את קרום רייסנר בבסיס צינור השבלול, ולקלף אותו בתנועה כלפי מעלה. דמיין את ההיבט הגבי של צינור השבלול, כולל האפיתל החושי. לאחר מכן, השתמש במלקחיים מספר 55 כדי לצבוט את הממברנה הטקטוריאלית בבסיס השבלול, ולקלף כלפי מעלה לכיוון הקודקוד.

הסרה מלאה של הממברנה הטקטוריאלית נדרשת כדי להשיג את התמונות הטובות ביותר עם אימונוהיסטוכימיה, והיא חיונית לסריקת מיקרוסקופ אלקטרונים. לאחר חשיפת איבר קורטי, יש לתקן את הרקמה ולבצע אימונוהיסטוכימיה, או להתכונן לסריקת מיקרוסקופ אלקטרונים, כמפורט בחלק הכתוב של הפרוטוקול. לאחר צביעת הרקמה, הניחו את הדגימה בצלחת אלסטומר סיליקון שחורה, המכילה PBS.

בעזרת מלקחיים עדינים, הסר את אזור שיווי המשקל מספירלת השבלול. לאחר מכן, הסר בזהירות רבה את הסחוס והמזנכימה הבסיסיים מספירלת השבלול. ספירלת השבלול הנותרת מכילה את החריץ הפנימי, איבר קורטי והחריץ החיצוני.

העבירו את ספירלת השבלול לטיפת PBS המונחת על שקופית מיקרוסקופ. נדפו את ה-PBS עם טישו סופג או פיסת נייר פילטר, ומקמו מחדש בעדינות את ספירלת השבלול אם האפיתל זז וחופף לעצמו. הוסף טיפה של מדיית הרכבה ישירות על דגימת השבלול, והנח בעדינות פתק כיסוי ישירות על הדגימה, תוך הקפדה על הימנעות מבועות אוויר.

השתמש במיקרוסקופ קונפוקלי אפיפלואורסצנטי או לייזר המצויד בהגדלה גבוהה ובמטרות צמצם מספריות גבוהות, כדי ללכוד תמונות של פני השטח האפיקליים של תא השיער השבלול. השתמש במטרות נמוכות יותר כדי לצלם תמונות חופפות של ספירלת השבלול כדי לכמת את אורך צינור השבלול. התמונות הבאות מראות צביעה אימונו-פלואורסצנטית של סיבוב בסיסי, שבלול מסוג יום ראשון לאחר הלידה.

פלואידין מסמן אקטין חוטי בסטריאוציליה, ואקטין קליפת המוח בפריפריה של התא. מיוזין VIIA הוא סמן לתאי שיער פנימיים וחיצוניים. ZO_1 מסמן את הצמתים ההדוקים בין התאים, מה שהופך אותו לסמן נהדר להבחנה בין גבולות התא.

אלפא-טובולין אצטיל משמש כסמן לקינוציליום בקודקוד הצרור, כפי שמצוין על ידי החץ הלבן. מיקרו-צינורות פנימיים מסומנים גם על ידי אלפא-טובולין אצטיל, הנמצאים בשפע במיוחד בתאי עמוד, כפי שמצוין על ידי הכוכביות הלבנות. תמונה זו של צינורות שבלול מנותחים ב-E18.5, מוכתמים בטובולין אצטיל, מדגימה קיצור ניכר של צינורות השבלול המותנים של IFT20 בהשוואה לביקורת.

התמונה הבאה היא הכנה שלמה של סיבוב שבלול בסיסי, בעכברי נוקאאוט BBS8, ביום האפס שלאחר הלידה. צרורות סטריאוציליאריים בשבלול נוקאאוט BBS8 מסובבים באופן משתנה, כפי שמצוין על ידי החץ ימינה, או שטוחים וממוקמים בצורה שגויה, כפי שמצוין החץ האמצעי. הקינוציליה ממוקמת בצורה שגויה, או שחסרים אקסונמים, כפי שמצוין על ידי החץ שמאלה.

בעת הכנת פנוטיפ השבלול לניתוח, חשוב לזכור שהבדלים ברקע הגנטי יכולים לשנות את הפנוטיפ של השבלול. לכן, חשוב להשתמש בבקרות המלטה לניתוח. ניתוחים נוספים כוללים בדיקות אודיומטריות ותרבית של צמחי שבלול, המאפשרים טיפול במפעילי איתות או מעכבים שונים, ובכך תורמים להבנה מכניסטית של תהליכי התפתחות מעורבים.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להכין רקמת שבלול לניתוח תפקידם של רכיבי הריסים והשפעותיהם הייחודיות על איתות PCP.