ההר שלם Dissection וImmunofluorescence של מבוגרי עכבר השבלול

אנו מציגים שיטה לבודד את האיבר הבוגר של קורטי כשלושה סיבובים שלמים שבלול (קודקוד, אמצע, ובסיס). אנחנו גם מדגימים הליך immunostaining עם נוגדנים מתויגים fluorescently. יחד טכניקות אלה יאפשרו המחקר של תאי שיער, תאי תמיכה, וסוגי תאים אחרים הנמצא בשבלול.

המטרה הכוללת של כל שיטת דיסקציה זו היא לבודד את האזור החושי של השבלול הבוגר המסוייד כשלושה סיבובים שלמים: הקודקוד, האמצע והבסיס. שיטת דיסקציה זו משמרת את המבנה התלת מימדי של איבר קורטי, ומאפשרת הדמיה של כל התאים בשילוב עם צביעה חיסונית ומיקרוסקופיה קונפוקלית לתמונה במישורים שונים בציר Z. בהשוואה לשיטות דיסקציה קודמות, אנו משתמשים באסטרטגיה שונה שיוצרת שלושה סיבובי שבלול גדולים יותר ובעלי סיכוי נמוך יותר לאבד או להינזק בתהליך הצביעה החיסונית.

הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שקשה ללמוד את הנתיח. מכיוון שהאיבר של קורטי שביר, יש מרווח קטן לטעות בעת הסרת הרצועה הספירלית. לאחר המתת חסד של בעל החיים על פי נהלים מאושרים והסרת המוח, התחל בזיהוי העצמות הטמפורליות בבסיס גולגולת העכבר.

לאחר מכן מגרדים את עצבי הגולגולת באמצעות מלקחיים סטנדרטיים. הנח את המלקחיים בקצה הקפסולה האוטית והשתמש באגודל של היד הנגדית כדי ללחוץ כלפי מטה על התעלה החצי עגולה האחורית כדי לעקור את השבלול העטוף. שחרר את החצי התחתון של העצם הטמפורלית מהגולגולת באופן ידני עם האגודל והאצבע המורה או באמצעות מספריים עדינים של 10.5 סנטימטר, והניח במיקרוסקופ אלקטרונים נטול מתנול דרגה 4% פרפורמלדהיד לתיקון.

לאחר הקיבוע יש להסיר את העצמות הטמפורליות על פי ההוראות בחלק הכתוב של הפרוטוקול. כדי לקבוע אם הדגימה מסולקת כראוי, הניחו את העצמות הטמפורליות על צלחת חיתוך מצופה סיליקון-אלסטומר, ולחצו בעדינות על השבלול בצורת חילזון. אם הרקמה ספוגית, הסרת האבדן הושלמה.

הוסף PBS לצלחת הדיסקציה, ולאחר מכן תוך כדי עבודה תחת מיקרוסקופ דיסקציה סטריאו, השתמש במלקחיים מספר ארבע או מספר חמש כדי להחזיק את העצם הטמפורלית באזור שיווי המשקל וחמישה מיליליטר מספריים קפיציים של Vannas-Tubingen כדי לחתוך עודפי רקמת קפסולה אוטית לאורך הצדדים ומעל הקודקוד. בעזרת מספריים קפיציים של 2.5 מיליליטר Vannas, הכנס להב אחד לחלון הסגלגל ובצע מספר חתכים קטנים לאורך הרצועה הספירלית של סיבוב הבסיס. כעת, הכנס להב אחד מהמספריים הקפיציים של Vannas-Tubingen בנפח חמישה מיליליטר לאזור שזה עתה נחתך, והנח את הלהב השני בחלק החיצוני של העצם הטמפורלית, מדיאלית לחלון הסגלגל.

חתך זה מפריד בין הסיבוב הבסיסי לבין הסיבובים האמצעיים והאפיקליים. לאחר מכן, כדי להשלים את חיתוך הסיבוב הבסיסי, השתמש במספריים הקפיציים של 2.5 מיליליטר כדי לחתוך את סיבי העצב של הגנגליון הספירלי המתחברים למודיולוס כדי לשחרר מתח בסיבוב הבסיסי. חותכים מתחת לסיבוב הבסיסי כדי להיפרד מהאיברים הווסטיבולריים.

השתמש במלקחיים כדי להנחות את הרקמה ולהצמיד את סיבי הגנגליון הספירלי לכלי המצופה סיליקון-אלסטומר. בצע סדרה של חתכים קטנים כדי להסיר את הרצועה הספירלית מעל ומתחת לאיבר קורטי. כאשר סיבי הגנגליון הספירליים מוצמדים לכלי המצופה סיליקון-אלסטומר, השתמש במלקחיים כדי להסיר את כל קרום רייסנר שנותר מהאיבר של קורטי.

בצע מספר חתכים כדי להפחית את עובי האקסונים של הגנגליון הספירלי. לאחר מכן תפסו את האקסונים הנותרים של הגנגליון הספירלי בעזרת מלקחיים והעבירו את סיבוב הבסיס המנותח לצלחת 48 בארות המכילה כ -500 מיקרוליטר PBS. כעת הפרד את הסיבובים האמצעיים והאפיקליים על ידי הנחת שני השלישים הנותרים של הצד האפיקלי של השבלול כלפי מטה.

לאחר מכן הכנס להב אחד מהמספריים של 2.5 מיליליטר למדיה של סקאלה, שם הסיבוב האמצעי היה מחובר בעבר לסיבוב הבסיסי, ובצע מספר חתכים לאורך הרצועה הספירלית של הסיבוב האמצעי. בעזרת המספריים של חמישה מיליליטר, הכנס להב אחד לאזור החיתוך, כאשר הסיבוב האמצעי מונח על גבי הלהב. הנח את הלהב השני בחלק החיצוני של המבוך הגרמי, בזווית של 90 מעלות מהקצה האפיקלי.

חתך זה מפריד בין הסיבוב האמצעי לסיבוב האפיקלי. לאחר מכן, השלם את דיסקציה של הסיבוב האמצעי על ידי הסרת הרצועה הספירלית מהאיבר של קורטי. מעבירים את הסיבוב המנותח לצלחת 48 באר, כמו קודם.

כעת, השתמש במספריים קפיציים של 2.5 מיליליטר Vannas כדי לפתוח את המכסה המכסה את הסיבוב האפיקלי, וחזור על ההליך כדי להסיר את הרצועה הספירלית של הסיבוב האפיקלי מהאיבר של קורטי. מעבירים את הסיבוב המנותח לצלחת 48 באר, כמו קודם. כדי להתחיל בהליך הצביעה החיסונית, יש לשאוב תחילה PBS מכל באר, ואז להחליף ב-200 עד 300 מיקרוליטר של תמיסת חסימה ולדגור למשך שעה בטמפרטורת החדר על מסובב תלת מימד.

לאחר שחלף זמן הדגירה, הסר את תמיסת החסימה והחלף ב-100 מיקרוליטר של נוגדן ראשוני, מדולל כראוי בתמיסת נשא. דגירה למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס על מסובב תלת מימד. למחרת, הסר את תמיסת הנוגדנים העיקרית ושטוף כל באר עם 500 מיקרוליטר PBS למשך חמש דקות לפחות בכל פעם, בטמפרטורת החדר.

חזור על הכביסה פעמיים. לאחר הכביסה האחרונה, שאפו את ה- PBS והקפידו לא למצוץ את הסיבוב המנותח בקצה הפיפטה. החלף ב-100 מיקרוליטר לבאר של נוגדן משני מתויג פלואורסצנטי מדולל בתמיסת נשא.

הנח את צלחת 48 הבארות בקופסה שחורה כדי להגן מפני אור, והנח על מסובב התלת מימד לדגירת שעתיים-שלוש בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה יש לשאוב את תמיסת הנוגדנים המשנית ולשטוף שלוש פעמים עם PBS כמו קודם. לאחר הסרת הכביסה האחרונה, הוסף 100 מיקרוליטר של Hoechst לתיוג גרעינים.

יש להגן מפני אור ולדגור במשך 15 עד 20 דקות בטמפרטורת החדר על מסובב תלת מימד. לבסוף, הסר את תמיסת Hoechst ושטוף שלוש פעמים עם PBS כמו קודם. לאחר תיוג כל שקופית, פיפטה 50 מיקרוליטר של מדיית הרכבה על כל שקופית.

לאחר מכן השתמש במלקחיים ישרים של תכשיטן מספר ארבע או חמש, אחוז באקסונים של הגנגליון הספירלי והעביר בעדינות סיבוב שבלול אחד מלוח 48 הבאר לאמצעי ההרכבה. השתמש במיקרוסקופ כדי לוודא שהסיבוב המנותח אינו מקופל או מעוות. הנח קצה אחד של החלקת כיסוי על שקופית, ושחרר בעדינות כדי לתת לכיסוי להחליק ליפול.

השתמש במיקרוסקופ דיסקציה סטריאו כדי לוודא שסיבוב השבלול אינו ממוקם ליד בועת אוויר. במקרה כזה, הזיזו בעדינות את החלקת הכיסוי קדימה ואחורה כדי למקם מחדש את סיבוב השבלול. חזור על ההליך עבור סיבובי השבלול האחרים.

הרכיבו סיבוב שבלול אחד בכל שקופית כדי למנוע חשיפה לאור והלבנת תמונות במהלך תהליך ההדמיה. מקם שקופיות בתיקיית שקופיות כך שהן יהיו שטוחות. הגן מפני אור ואפשר למדיית ההרכבה להתרפא למשך הלילה בטמפרטורת החדר.

למחרת, כיסוי האיטום מחליק עם לק שקוף, ושומר בטמפרטורת החדר או 20 מעלות צלזיוס עד לצילום. תמונת פרוסה קונפוקלית זו מציגה את הסיבוב האמצעי של השבלול מבודד מעכבר p15. תמונות 420X הוצבו כדי לשחזר את כל הפנייה האמצעית.

תאי השיער, המסומנים בנוגדנים ראשוניים נגד מיוזין VIIa של ארנב ונוגדנים משניים מצומדים של Alexa 647 נראים מג'נטה. תאים תומכים, המסומנים בנוגדנים ראשוניים נגד SOX2 עז ונוגדנים משניים מצומדים Alexa 568 נראים ירוקים. הגרעינים נראים כחולים בגלל כתם הוכסט.

סרגל קנה המידה מייצג 100 מיקרון. תמונה זו מציגה חתך אופטי של הסיבוב האמצעי מבודד מעכבר בן שישה שבועות במישור X, Z. שוב, תאי השיער מסומנים עם פלואורופור מג'נטה והתאים התומכים עם פלואורופור שנראה ירוק.

זוהי הגדלה מוגברת של התמונה הקודמת, כאשר הכוונת הוסרה סרגל קנה המידה מייצג 20 מיקרון. ארבע התמונות הבאות מציגות כמה מהבעיות שעלולות להתרחש במהלך חיתוך תושבת שלם, או בעת הרכבת סיבובי שבלול על שקופיות.

כאן, בצד שמאל של התמונה, רקמת השבלול נחתכה ליד השורה האחרונה של תאי השיער החיצוניים, מה שגרם לרבים מהתאים האלה להיות מורכבים בזוויות שונות. בתמונה זו, חלק מהאיבר של קורטי בצד שמאל נחתך. יש חור מנוקב באזור תא השיער החיצוני במרכז התמונה.

כאן האיבר של קורטי מקופל בכמה מקומות. לאחר השליטה, ניתן להשלים את כל טכניקת חיתוך ההרכבה תוך 20 עד 30 דקות. בעת ביצוע הליך זה, חשוב להימנע מהנחת המלקחיים על איבר קורטי ולהימנע ממשיכה או אחיזה ברצועה הספירלית.

במקום זאת, סגור את המלקחיים והצמד את סיבי הגנגליון הספירלי לצלחת המצופה סיליקון-אלסטומר. דגימות מעכברים בני שבוע עד שלושה שבועות סלחניות יותר ושימושיות יותר ללימוד שיטת הדיסקציה. בנוסף, דגימות עם נזק לתאי שיער קשות יותר לניתוח, כאשר רקמה חשופה לרעש קשה ושברירית במיוחד.

בעקבות הליך דיסקציה זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון מיקרוסקופ אלקטרונים סורק. עם זאת, יש צורך בקיבוע אחר. נוסף על כך, ביצענו שינויים קלים בפרוטוקול הזה לדיסקציה של רקמת שבלול של חולדות, ובעתיד אנו מקווים לבצע שינויים נוספים לדיסקציה של שבלול מצ'ינצ'ילה, גרביל ושרקנים.