Name: ההר שלם Dissection וImmunofluorescence של מבוגרי עכבר השבלול (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: למד שיטת ניתוח whole mount לשבלול מבוגר בעכבר לשימור מבנה תלת-ממדי של איבר קורטי. השיטה מאפשרת הדמיית תאי שיער ותומכים באמצעות אימונופלואורסצנציה ומיקרוסקופיה קונפוקלית לחקר מדעי השמיעה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענק מהמשרד למחקר ימי (N000141310569). ציוד מתקן ההדמיה המחקרי של בית הספר לרפואה של אוניברסיטת דרום אילינוי נתמך על ידי המרכז הלאומי למשאבי מחקר-בריאות (S10RR027716).

<ol><li>Robles, L., Ruggero, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanics+of+the+mammalian+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Mechanics of the mammalian cochlea.</a> Physiol Rev. 81 (3), 1305-1352 (2001).</li>
<li>Ehret, G., Frankenreiter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitattive+analysis+of+cochlear+structures+in+the+house+mouse+in+relation+to+mechanisms+of+acoustical+information+processing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Quantitattive analysis of cochlear structures in the house mouse in relation to mechanisms of acoustical information processing.</a> J Comp Physiol. 122, 65-85 (1977).</li>
<li>Ou, H. C., Bohne, B. A., Harding, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise+damage+in+the+C57BL%2FCBA+mouse+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Noise damage in the C57BL/CBA mouse cochlea.</a> Hear Res. 145 (1-2), 111-122 (2000).</li>
<li>Engstrom, H., Ades, H. W., Andersson, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEngstrom%2C+H+%22Structural+pattern+of+the+organ+of+Corti.+A+systematic+mapping+of+sensory+cells+and+neural+elements%22">Structural pattern of the organ of Corti. A systematic mapping of sensory cells and neural elements</a>. , Almqvist and Wiksell. (1966).</li>
<li>Grant, L., Yi, E., Goutman, J. D., Glowatzki, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postsynaptic+Recordings+at+Afferent+Dendrites+Contacting+Cochlear+Inner+Hair+Cells%3A+Monitoring+Multivesicular+Release+at+a+Ribbon+Synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Postsynaptic Recordings at Afferent Dendrites Contacting Cochlear Inner Hair Cells: Monitoring Multivesicular Release at a Ribbon Synapse.</a> J Vis Exp. (48), e2442(2011).</li>
<li>Bohne, B. A., Harding, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+and+analyzing+the+mouse+temporal+bone+to+identify+gross%2C+cellular+and+subcellular+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Processing and analyzing the mouse temporal bone to identify gross, cellular and subcellular pathology.</a> Hear Res. 109 (1-2), 34-45 (1997).</li>
<li>Bohne, B. A., Harding, G. W., Ou, H. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBohne%2C+BA+%22Handbook+of+Mouse+Auditory+Research%22">Handbook of Mouse Auditory Research</a>. Willott, J. , CRC Press. 171-187 (2001).</li>
<li>Eaton-Peabody Laboratories. Video Tutorial for Cochlear Dissection. , Massachusetts Eye and Ear. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.masseyeandear.org/research/otolaryngology/investigators/laboratories/eaton-peabody-laboratories/epl-histology-resources/video-tutorial-for-cochlear-dissection/">http://www.masseyeandear.org/research/otolaryngology/investigators/laboratories/eaton-peabody-laboratories/epl-histology-resources/video-tutorial-for-cochlear-dissection/</a> (2015).</li>
<li>Weber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+cell-cycle+reentry+and+cell+death+after+acute+inactivation+of+the+retinoblastoma+gene+product+in+postnatal+cochlear+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (2), 781-785 (2008).</li>
<li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+proliferation+of+postmitotic+cochlear+supporting+cells+by+acute+ablation+of+the+retinoblastoma+protein+in+neonatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo proliferation of postmitotic cochlear supporting cells by acute ablation of the retinoblastoma protein in neonatal mice.</a> J Neurosci. 30 (17), 5927-5936 (2010).</li>
<li>Steigelman, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polycystin-1+Is+Required+for+Stereocilia+Structure+But+Not+for+Mechanotransduction+in+Inner+Ear+Hair+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Polycystin-1 Is Required for Stereocilia Structure But Not for Mechanotransduction in Inner Ear Hair Cells.</a> J Neurosci. 31 (34), 12241-12250 (2011).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+in+vivo+conversion+of+mouse+cochlear+pillar+and+Deiters%27+cells+to+immature+hair+cells+by+Atoh1+ectopic+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Age-dependent in vivo conversion of mouse cochlear pillar and Deiters' cells to immature hair cells by Atoh1 ectopic expression.</a> J Neurosci. 32 (19), 6600-6610 (2012).</li>
<li>Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+and+plasmid+electroporation+of+the+murine+organ+of+Corti%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of Corti.</a> J Vis Exp. (36), e1685(2010).</li>
<li>Burns, J. C., On, D., Baker, W., Collado, M. S., Corwin, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Over+half+the+hair+cells+in+the+mouse+utricle+first+appear+after+birth%2C+with+significant+numbers+originating+from+early+postnatal+mitotic+production+in+peripheral+and+striolar+growth+zones%5BTitle%5D)+AND+%22J+Assoc+Res+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Over half the hair cells in the mouse utricle first appear after birth, with significant numbers originating from early postnatal mitotic production in peripheral and striolar growth zones.</a> J Assoc Res Otolaryngol. 13 (5), 609-627 (2012).</li>
<li>Collado, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+postnatal+accumulation+of+junctional+E-cadherin+is+inversely+correlated+with+the+capacity+for+supporting+cells+to+convert+directly+into+sensory+hair+cells+in+mammalian+balance+organs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The postnatal accumulation of junctional E-cadherin is inversely correlated with the capacity for supporting cells to convert directly into sensory hair cells in mammalian balance organs.</a> J Neurosci. 31 (33), 11855-11866 (2011).</li>
<li>Meyers, J. R., Corwin, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shape+change+controls+supporting+cell+proliferation+in+lesioned+mammalian+balance+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Shape change controls supporting cell proliferation in lesioned mammalian balance epithelium.</a> J Neurosci. 27 (16), 4313-4325 (2007).</li>
<li>Gratton, M. A., Rao, V. H., Meehan, D. T., Askew, C., Cosgrove, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinase+dysregulation+in+the+stria+vascularis+of+mice+with+Alport+syndrome%3A+implications+for+capillary+basement+membrane+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinase dysregulation in the stria vascularis of mice with Alport syndrome: implications for capillary basement membrane pathology.</a> Am J Pathol. 166 (5), 1465-1474 (2005).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

<html> ישנם מספר צעדים קריטיים לנתיחה מוצלחת כל ההר וimmunostaining. עם זאת, לפני אחת מהשיטות הבאות מבוצעות, יש צורך בקיבוע הנכון של רקמת השבלול. אנו ממליצים על שימוש בכיתה ללא תשלום, אולטרה-טהורה, EM PFA מתנול. PFA עשוי אבקה יכולה להיות עקבות של מתנול ו- pH יציב אשר מקטין את האיכות של immunofluorescence. גם קבוצות אחרות הראו כי ניתוחים דומים הם fixatives באמצעות אפשרי שאינו מכיל פורמלדהיד 14-16. אורכו של הקיבעון הוא גם חשוב וספציפי נוגדן. נוגדנים מסוימים יכולים לסבול O ...

השבלול בצורת הספירלה של האוזן הפנימית, בתוך העצם הטמפורלית, בתי האיבר של קורטי, איבר השמיעה החושי הסוף ביונקים. השבלול מאורגן tonotopically ומחולק בדרך כלל לפסגה, אמצע, ובסיס פונה מתאים לאזורים שונים בתדירות עם זיהוי קול בתדר גבוה בבסיס וזיהוי בתדר נמוך בקודקוד 1. תאי שיער, תאי mechanosensory של האיבר של קורטי, לאורכו של שבלול האוזן, שהם כ 6 מ&quot;מ ארוך בעכברי 2,3. תאים אלה להמיר את האנרגיה המכנית של גלי קול, שמועברים דרך המבוך הקרומי מלא הנוזל, לאותות עצביים המעובדים על ידי מבנים שמיעתיים מרכזיים. הטכניקה המתוארת כאן מספקת שיטה להכנת mounts של האיבר של קורטי כל אחרי ההסתיידות של השבלול היא מלאה (לדגימות החל שבוע בגיל אחת לבגרות). כמו כן, אנו מציגים שיטה לimmunostaining כל רכוב רקמת שבלול. mounts כל שבלול הם קריטיים להדמיה של כל תאי השיער ותאים המקיפים את תמיכה בסידורים מרחביים הטבעיים שלהם ולאפשר לניתוח בשלושה ממדים בשימוש במיקרוסקופ confocal. בני הזוג. האנס Engstrom והארלו עדס במקור תיארו שיטת הר שלמה שבלול נתיחה בשנת 1966. הם מפורטים טכניקה לתקן במהירות ולנתח cochleae המסויד שקוע בנוזל ממגוון רחב של יונקים, שמירת מגזרים שלמים קצרים של האיבר של קורטי לניתוח מיקרוסקופי 4. הנתיחה של שבלול עכברוש מבולבל, מסויד גם כבר מודגמת בסרטון הדרכה 5. בני הזוג. ברברה Bohne וגארי הרדינג באוניברסיטת וושינגטון עשו כמה שינויים חשובים בשיטה זו. בגרסתם של שיטת ההר השלמה השבלול, העצם הטמפורלית היה נטול הסידן, משובץ בפלסטיק, וחמישה וחצי או עשרה סיבובים רבע תור היו dissecטד 6,7. ד&quot;ר צ&#39;רלס ליברמן ועמיתיו באיטון מעבדות פיבודי, מסצ&#39;וסטס עין ואוזן המרפאה, השינוי בטכניקה זו, כך שהטבעת הפלסטיק לא נדרשה 8. שינוי נוסף של הטכניקה התרחש במעבדה של ד&quot;ר ג&#39;יאן זואו בבית החולים למחקר סנט ג&#39;וד 9-12 שהודיע ​​לשיטה לנתיחה שהוצגה כאן. אנו משתמשים באסטרטגיה שונה כדי לקבל גישה לאיבר של קורטי מאשר Bohne וליברמן, המאפשר בידוד של הפסגה מלאה, אמצע, וסיבובים בסיסיים. כך הרקמה גזור היא גדולה יותר ופחות סיכוי להיות אבד או ניזוק במהלך תהליכי הנתיחה או immunostaining. בנוסף, השיטה הנוכחית מאפשרת מדידה של המרחק מקצה הקודקוד או הוו בסיסי לזיהוי אזור תדר. למרות שמעבדות רבות לבצע immunostaining של רקמת שבלול, לא ברור היכן מקורו בשיטה זו. כתוצאה מכך יש מתכונים שונים לחסימת buffeRS ומאגרי דגירה נוגדן שעשוי להשפיע על הביצועים של נוגדנים ראשוניים בודדים. כאן, אנו מציגים שיטה אחת לimmunostaining עם נוגדנים מתויגים fluorescently שחל על נוגדנים הנפוצים ביותר בתחום השמיעתי. הצורה המורכבת של השבלול, המבנה עדין של האיבר של קורטי, וההסגר גרמי לספק אתגר לניתוח היסטולוגית וביוכימיים. מגוון של טכניקות משמש כיום בתחום השמיעה להתגבר על התכונות קשות האלה ולדמיין את התאים בתוך האיבר של קורטי, כל טכניקה עם יתרונות משלה וחסרונות. הפרוטוקול שהוצג כאן מאפשר לנתיחה הר שלמה של שבלול העכבר הבוגר ו, עם שינוי קל, עלול לשמש כדי לבחון מבנים הקריטיים בתוך cochleae ממגוון רחב של אורגניזמים מודל אחרים המשמשים בתחום.

<table><tbody><tr><td>מלקחיים סטנדרטיים&nbsp; דפוס</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-12</td><td>ניתן לרכוש מספקים אחרים</td></tr><tr><td>מספריים עדינים 10.5 ס"מ</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-11</td><td>ניתן לרכוש מספקים אחרים</td></tr><tr><td>2 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה</td><td>MidSci</td><td>AVSS2000</td><td>מספקים אחרים</td></tr><tr><td>16% פורמלדהיד, ללא מתנול, טהור במיוחד, Polysciences בדרגת EM</td><td></td><td>18814</td><td>רעיל - ללבוש כפפות ולא ניתן להשליך אותו לכיור. ניתן לרכוש מספקים אחרים.&nbsp;</td></tr><tr><td>PBS pH 7.4&nbsp;</td>ניתן לרכוש את <td>Sigma</td><td>P3813-10PAK</td><td>מספקים אחרים</td></tr><tr>ניתן לרכוש את<td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>BP118-500</td><td>מספקים אחרים</td></tr><tr><td>ניתן לרכוש מסובב צינור קצה</td> קצה <td>Fisher</td><td>05-450-127</td><td>מספקים אחרים</td></tr><tr><td>צלחת פטרי 60 מ"מ</td><td>ניתן לרכוש את</td><td>Fisher</td><td>50-202-037</td> מספקים אחרים</tr> ערכת <tr><td>מעטפת סיליקון Dow Corning Sylgard 184</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5 ק"ג</td><td></td></tr><tr><td>פחם פעיל</td><td>Fisher</td><td>AC134372500</td><td>ניתן לרכוש מספקים אחרים</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ דיסקציה סטריאו</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td>ניתן לרכוש מספקים אחרים</td></tr><tr><td>Dumont #4 מלקחיים של תכשיטן</td><td>Fine Science Tools</td><td>11241-30</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 מלקחיים של תכשיטן</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>2.5 מ"מ Vannas מספריים קפיציים</td><td>Fine Science Tools</td><td>15001-08</td><td>מעוקל&nbsp;</td></tr><tr><td>מספריים קפיציים 5 מ"מ Vannas-Tubingen</td><td>Fine Science</td><td>Tools 15003-08</td><td>צלחות ישרות</td></tr><tr><td>48 בארות</td><td>ניתן לרכוש את</td><td>פישר</td><td>08-772-52</td> מספקים אחרים</tr><tr><td>מגלשות קאמריות 8 בארות</td> ניתן לרכוש את <td>1256518 פישר</td><td></td><td>מספקים אחרים</td></tr><tr>ניתן לרכוש את<td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100-500</td><td>מספקים אחרים</td></tr><tr><td>BSA, שבר V</td><td>ניתן לרכוש את Fisher</td><td>BP1605</td><td>מספקים אחרים ניתן לרכוש</td></tr><tr><td>מעבדות NGS</td><td>Vector</td><td>S-1000</td><td>מספקים אחרים</td></tr><tr>ניתן לרכוש<td>מעבדות NHS</td><td>Vector</td><td>S-2000</td><td>מספקים אחרים</td></tr><tr><td>ניתן לרכוש מסובב תלת מימד</td><td>Midsci</td><td>R3D-710</td><td>מספקים אחרים</td></tr><tr><td>תיבת דגירה של כתמים מערביים XL</td><td>Licor</td><td>929-97401</td><td></td></tr><tr><td>ניתן לרכוש את Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H3570</td><td>מספקים אחרים</td></tr><tr>ניתן לרכוש<td>את Prolong gold antifade הרכבה מדיה</td> Life <td></td><td>Technologies P36930</td><td>מספקים אחרים, אך מדיות הרכבה משתנות ביכולתן להגן מפני הלבנת פוטו</td></tr><tr><td>Superfrost Plus Slides</td><td>Fisher</td><td>12-550-15</td><td>ניתן לרכוש מספקים אחרים</td></tr><tr><td>כיסויים 22 x 22 x 1</td><td>Fisher</td><td>ניתן לרכוש 12-548-B</td><td>מספקים אחרים</td></tr><tr><td>לק שקוף</td> ניתן לרכוש <td>בבית מרקחת</td><td></td> מקומי <td>מספקים אחרים</td></tr><tr><td>תיקיית שקופיות קרטון</td><td>פישר</td><td>12-587-10</td> ניתן <td>לרכוש מספקים אחרים</td></tr><tr><td>קופסת שקופיות מפלסטיק</td><td>פישר</td><td>03-448-10</td><td>ניתן לרכוש מספקים אחרים</td></tr></tbody></table>

ההר שלם dissection וimmunofluorescence של מבוגרי עכבר השבלול

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

האיבר של קורטי, השוכן בשבלול של האוזן הפנימית, מכיל תאי שיער מכניים-סנסוריים ותאים תומכים המאורגנים בצורה ספירלית ובעלי שיפוע טונוטופי לזיהוי קול. שבלול העכבר הוא באורך של כ-6 מ"מ ולעתים קרובות מחולק לשלושה סיבובים (קודקוד, אמצע ובסיס) לצורך ניתוח. כדי לחקור אובדן תאים, חלוקת תאים או ביטוי גנים בפסיפס, כל ההכנה של השבלול שימושית. שיטת דיסקציה זו מאפשרת הדמיה של כל התאים בתוך האיבר של קורטי בשילוב עם צביעה חיסונית ומיקרוסקופיה קונפוקלית כדי לדמות תאים במישורים שונים בציר ה-z. ניתן להשיג חתכים אופטיים מרובים גם מתמונות z-stack אלה. בנוסף, ניתן להשתמש בכל שיטת חיתוך ההרכבה לסריקת מיקרוסקופ אלקטרונים, אם כי יש צורך בשיטת קיבוע שונה. כאן, אנו מציגים שיטה לבודד את איבר קורטי כשלושה סיבובי שבלול שלמים (קודקוד, אמצע ובסיס). ניתן להשתמש בשיטה זו עבור עכברים מגיל שבוע ועד לבגרות ושונה מהטכניקה המשמשת לדגימות יילודים בהן הסתיידות השבלול אינה שלמה. ניתן להשתמש בגרסה מעט שונה לדיסקציה של שבלול החולדה. אנו גם מדגימים הליך לצביעה חיסונית עם נוגדנים מתויגים פלואורסצנטיים.

אנו מציגים שיטה לבודד את האיבר של קורטי כשלושה סיבובים שלמים שבלול (קודקוד, אמצע, ובסיס) מרקמת שבלול שהוא מסויד, בצעדים לנתיחה מפתח מוצגים באיור 1. בשבוע הראשון לאחר הלידה של פיתוח, ההסתיידות של שבלול העכבר אינו שלם ושיטה לנתיחה פשוטה יותר ניתן להשתמש 13. שימוש בשיטה בילוד ההר שלמה לנתיחה עם שבלול מP7 ותוצאות עכברים מבוגרים בדמעות ורטוש של האיבר של קורטי. רצועת ספירלה / הקיר לרוחב כעת מחובר היטב יותר ולא ניתן התקלף מהאפי...

אנו מציגים שיטה לבודד את האיבר הבוגר של קורטי כשלושה סיבובים שלמים שבלול (קודקוד, אמצע, ובסיס). אנחנו גם מדגימים הליך immunostaining עם נוגדנים מתויגים fluorescently. יחד טכניקות אלה יאפשרו המחקר של תאי שיער, תאי תמיכה, וסוגי תאים אחרים הנמצא בשבלול.

ההר שלם Dissection וImmunofluorescence של מבוגרי עכבר השבלול

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

המטרה הכללית של שיטת נתיחה זו של דגימה שלמה (whole mount) היא לבודד את האזור התחושתי של השבלול המג化ר בבוגרים כשלוש סיבובים שלמים: השיא (apex), האמצע והבסיס. שיטת נתיחה זו משמרת את המבנה התלת-ממדי של איבר קורטי (organ of Corti), ומאפשרת ויזואליזציה של כל התאים כאשר היא משולבת עם צביעה אימונוהיסטוכימית ומיקרוסקופיה קונפוקלית כדי לדמות מישורים שונים בציר Z. בהשוואה לשיטות נתיחה קודמות, אנו משתמשים באסטרטגיה שונה המייצרת שלושה סיבובים של השבלול שהם גדולים יותר ובעלי סבירות נמוכה יותר לאבד או להיפגע במהלך תהליך הצביעה האימונוהיסטוכימית.הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן קשה ללמוד את תהליך הדיסקציה. מאחר שאיבר קורטי (organ of Corti) הוא שבריר, קיים מרווח טעות קטן בעת הסרת הרצועה השבלולית (spiral ligament). לאחר קטילת בעל החיים בהתאם לנוהלים המאושרים והסרת המוח, התחילו בזיהוי עצמות הרקה בבסיס גולגולת העכבר.לאחר מכן, גרדו את העצבים הגולגולתיים באמצעות פינצטה סטנדרטית. מקמו את הפינצטה בקצה הקפסולה האוטיקה והשתמשו באגודל של היד השנייה כדי ללחוץ על התעלה החצי-מעגלית האחורית כדי לשחרר את השבלול העטוף. שחררו את החצי התחתון של עצם הרקה מהגולגולת, באופן ידני באמצעות האגודל והאצבע או באמצעות מספריים עדינים של 10.5 centimeter, והניחו ב-4% paraformaldehyde בדרגת מיקרוסקופיה אלקטרונית ללא מתנול לצורך קיבוע.לאחר הקיבוע, יש לבצע דקלציפיקציה לעצמות הרקה בהתאם להוראות בחלק הכתוב של הפרוטוקול. כדי לקבוע אם הדגימה עברה דקלציפיקציה מספקת, הניחו את עצמות הרקה על צלחת ניתוח מצופה בסיליקון-אלסטומר, ולחצו בעדינות עם פינצטה על הקוכלא (השבלול). אם הרקמה ספוגית, הדקלציפיקציה הושלמה.הוסף PBS לכלי הנתיחה, ולאחר מכן, בעבודה תחת מיקרוסקופ סטריאורטבי, השתמש בפינצטה מספר 4 או 5 כדי להחזיק את עצב הרקה באזור הוותיבולרי, ובמספרי קפיץ Vannas-Tubingen של 5 מיליליטר כדי לגזור רקמות עודפות של הקפסולה האוטיקה לאורך הצדדים ומעל השיא (apex).חתך זה מפריד בין התפתול הבסיסי (basal turn) לבין התפתולים האמצעי והאפיקלי (apical turns). לאחר מכן, כדי להשלים את הניתוח של התפתול הבסיסי, השתמש במספרי קפיץ בנפח 2.5 מיליליטר כדי לחתוך את סיבי עצב הגנגליון הספירלי המתחברים למודיולוס (modiolus) כדי לשחרר את המתח בתפתול הבסיסי. חתוך מתחת לתפתול הבסיסי כדי להפרידו מהאיברים הווסטיבולריים.השתמשו בפינצטה כדי להנחות את הרקמה ולהצמיד את סיבי הגנגליון הספירלי (spiral ganglion) לצלחת המצופה בסיליקון-אלסטומר. בצעו סדרה של חתכים קטנים כדי להסיר את הרצועה הספירלית (spiral ligament) הן מעל והן מתחת לאיבר קורטי (organ of Corti). כאשר סיבי הגנגליון הספירלי מוצמדים לצלחת המצופה בסיליקון-אלסטומר, השתמשו בפינצטה כדי להסיר את שאריות קרומי רייסנר (Reissner's membrane) מאיבר קורטי.בצע מספר חתכים כדי להפחית את עוביהם של אקסוני הגנגליון הספירלי. לאחר מכן, אחוז את האקסונים שנותרו של הגנגליון הספירלי בעזרת פינצטה והעבר את התפנית הבסיסלית שחולקה ללוחית עם 48 בארות המכילה כ-500 µL של PBS. כעת הפר את התפניות האמצעית והאפיקלית על ידי הנחת שני השלישים הנותרים של השבלול כאשר הצד האפיקלי פונה כלפי מטה.לאחר מכן, הכניסו להב אחד של מספרי ה-2.5 milliliter אל ה-scala media, בנקודה שבה הלולאה האמצעית הייתה מחוברת קודם לכן ללולאה הבסיסית, ובצעו מספר חיתוכים לאורך הרצועה הספירלית של הלולאה האמצעית. בעזרת מספרי ה-five milliliter, הכניסו להב אחד לאזור החתך, כאשר הלולאה האמצעית מונחת מעל להב. הניחו את ההלהב השני בצדו החיצוני של המבוך הגרמי, בזווית של 90 מעלות מהקצה האפיקלי.חתך זה מפריד בין התפיון האמצעי לתפיון האפיקלי. לאחר מכן, השלימו את הדיסקציה של התפיון האמצעי על ידי הסרת הרצועה הספירלית מאיבר קורטי. העבירו את התפיון המודחק לפלטה בעלת 48 בארות, כפי שנעשה קודם לכן.כעת, השתמשו במספרי Vannas בגידול של 2.5 מילימטר כדי לפתוח את המכסה המכסה את התפתול האפיקלי (apical turn), וחזרו על הפרוצדורה כדי להסיר את הרצועה הספירלית של התפתול האפיקלי מאיבר קורטי (organ of Corti). העבירו את התפתול שבוצעה בו הניתוח לפלטה של 48 בארות, כפי שנעשה קודם לכן. כדי להתחיל בתהליך הצביעה האימונוהיסטוכימית, שאבו תחילה PBS מכל באר, ולאחר מכן החליפו אותו ב-200 עד 300 microliters של תמיסת חסימה (blocking solution) והדגירו למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר על גבי מסובב תלת-ממדי (3D rotator).עם סיום זמן הדגירה, הסיר את תמיסת החסימה והחלף אותה ב-100 µL של נוגדן ראשוני, המדולל באופן מתאים בתמיסת נשיאה. דגירה תתבצע למשך לילה בטמפרטורה של 4 °C על גבי רוטטור תלת-ממדי. למחרת, הסר את תמיסת הנוגדן הראשוני ושטוף כל באר עם 500 µL של PBS למשך חמש דקות לפחות בכל פעם, בטמפרטורת החדר.חזור על השטיפה פעמיים. לאחר השטיפה האחרונה, שאב את ה-PBS והקפד לא לשאוב את הרקמה המנותחת לתוך קצה הפיפטה. החלף ב-100 microliters לכל באר של נוגדן שני מסומן פלואורסצנטית המדולל בתמיסת נשא.הניחו את הפלטה בעלת 48 הבארים בתוך קופסה שחורה להגנה מאור, והניחו אותה על מערבל תלת-ממדי (3D rotator) לדגירה למשך שעתיים עד שלוש בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה, שאבו את תמיסת הנוגדן המשני ושטפו שלוש פעמים עם PBS כפי שבוצע קודם לכן. לאחר הסרת השטיפה האחרונה, הוסיפו 100 µL של Hoechst לסומון הגרעינים.הגנו מאור ודגרו למשך 15 עד 20 דקות בטמפרטורת החדר על רוטטור תלת-ממדי. לבסוף, הסירו את תמיסת ה-Hoechst ושטפו שלוש פעמים עם PBS כפי שבוצע קודם לכן. לאחר סימון כל סרטית, טפטפו 50 µL של מדיום קיבוע (mounting media) על כל סרטית.לאחר מכן, באמצעות פינצטה של תכשיטנים ישרה (מספר 4 או 5), אחזו באקסונים של הגנגליון הספירלי והעבירו בעדינות תסבוב אחד של הקוכלא מהפלטה בעלת 48 הבארים אל תוך מדיום הקיבוע. השתמשו במיקרוסקופ כדי לוודא שהתסבוב שחו dissection אינו מקופל או מסובב. הניחו קצה אחד של זכוכית כיסוי על עלית, ושחררו בעדינות כדי לאפשר לזכוכית הכיסוי ליפול.השתמשו במיקרוסקופ סטריאו לדיסקציה כדי לוודא שתפנית השבלול אינה ממוקמת ליד בועת אוויר. אם הדבר קורה, הזיזו בעדינות את כיסוי הזכוכית קדימה ואחורה כדי למקם מחדש את תפנית השבלול. חזרו על הפרוצדורה עבור תפניות השבלול האחרות.הצמידו תפתול שבלול אחד לכל תבנית כדי למנוע חשיפה לאור והבהרה פוטוכימית (photo bleaching) במהלך תהליך הדימוי. הניחו את התבניות בתיקיית תבניות כך שישכבו בצורה שטוחה. הגנו מהאור ואפשרו למצע ההצמדה להתקשות במהלך הלילה בטמפרטורת החדר.ביום למחרת, אטמו את כיסויי הזכוכית בעזרת לק שקוף, ואחסנו בטמפרטורת החדר או ב-20 degrees Celsius עד לצילום. תמונת פרוסה קונפוקלית זו מציגה את התהפכות האמצע (middle turn) של השבלול שבודדה מעכבר p15. תמונות בהגדלה של 420X הונחו אחת על השנייה כדי לשחזר את התהפכות האמצע השלמה.תאי השערה, שסומנו באמצעות נוגדן ראשוני rabbit anti-myosin VIIa ונוגדן שני המשורשר ל-Alexa 647, מופיעים בצבע מגנטה. תאי תמיכה, שסומנו באמצעות נוגדן ראשוני goat anti-SOX2 ונוגדן שני המשורשר ל-Alexa 568, מופיעים בצבע ירוק. גרעינים מופיעים בצבע כחול הודות לצביעת Hoechst.סרגל המقياس מייצג 100 microns. תמונה זו מציגה חתך אופטי של התפתל האמצעי שבודד מעכבר בן שישה שבועות במישור X, Z. שוב, תאי השערה מסומנים עם פלואורופור במגנטה והתאים התומכים עם פלואורופור הנראה בירוק.זוהי הגדלה של התמונה הקודמת, כאשר סימני הכוונות הוסרו. סרגל המقياس מייצג 20 microns. ארבע התמונות הבאות מציגות חלק מהבעיות שעלולות להתרחש במהלך נתיחה של דגימה שלמה (whole mount), או בעת הרכבת סיבובים של השבלול (cochlear turns) על שקופיות.כאן, בצד שמאל של התמונה, רקמת השבלול נחתכה לצד השורה האחרונה של תאי השערה החיצוניים, מה שגרם לרבים מתאים להיות מקובעים בזוויות שונות. בתמונה זו, חלק מאיבר קורטי (organ of Corti) בצד שמאל נחתך. במרכז התמונה קיים חור שנפער באזור תאי השערה החיצוניים.כאן איבר קורטי (organ of Corti) מקופל במספר מקומות. לאחר רכישת מיומנות, ניתן להשלים את טכניקת הדיסקציה של ה-whole mount תוך 20 עד 30 דקות. במהלך ביצוע הליך זה, חשוב להימנע מהנחת הפינצטה על איבר קורטי ולהימנע ממשיכה או תפיסה של הרצועה השבלולית (spiral ligament).במקום זאת, סגרו את הפינצטה והצמידו את סיבי הגנגליון הספירלי (spiral ganglion) לצלחת המצופה באלסטומר סיליקון. דגימות מעכברים בני שבוע עד שלושה שבועות הן סלחניות יותר ומועילות יותר ללימוד שיטת הדיסקציה. בנוסף, דגימות עם נזק לתאי השערה הן קשות יותר לדיסקציה, כאשר רקמה חשופה לרעש היא קשה ושבירה במיוחד.בעקבות הליך ניתוח זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון מיקרוסקופיה אלקטרונית סורקת. עם זאת, נדרש מקבע שונה. בנוסף, ביצענו שינויים קלים בפרוטוקול זה עבור ניתוח של רקמת שבלול חולדה, ובעתיד אנו מקווים לבצע התאמות נוספות עבור ניתוח של שבלול מארנב-סלע, גרביל וחזיר גינאה.

whole-mount-dissection-immunofluorescence-adult-mouse

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

הליך פשוט של vibratome חתך את האיבר של קורטי, ואחריו מיקרוסקופיה אימונוהיסטוכימיה ו confocal מתואר. הליך זה מאפשר שימור משופר של cytoarchitecture את הקנס של האיבר של קורטי יונקים, וכתוצאה מכך מאפשר כימות מדויק של סוגי תאים.

Vibratome חתך לשימור משופרת של Cytoarchitecture של איברים של יונקים של קורטי

ריסים ראשוניים משפיעים על מסלולי איתות שונים. שבלול היונקים אידיאלי לבחינת איתות קוטביות תאים מישוריים (PCP). תפקוד לקוי של ריסים משפיע על צמיחת השבלול, דפוס התאים וכיוון תאי השערה, קריאות של PCP. מטרתנו היא לנתח איתות PCP בשבלול עכבר באמצעות ניתוח פנוטיפי, אימונוהיסטוכימיה ומיקרוסקופ אלקטרונים סורק.

הערכת פנוטיפים מישורים-Cell-קוטביות ב Ciliopathy עכבר Mutant שבלול

המטרה של פרוטוקול זה היא להפגין שיטה יעילה decellularize, decalcify cochleae העכבר עבור ניצול כמו פיגומים עבור יישומי הנדסת רקמות.

פרוטוקול עבור Decellularizing Cochleae העכבר עבור הנדסת רקמות האוזן הפנימית

כתב יד זה מתאר פרוטוקול ניסיוני להערכת מאפיינים מורפולוגיים ומעמד פונקציונלי של הסינפסות של רצועת הכלים בעכברים נורמליים. המודל הנוכחי מתאים גם לרעש המושרה והקשורות לגיל synaptopathy מודלים מוגבלים. גם התוצאות של לימודי העכבר הקודמים נדונו.

מורפולוגית ופונקציונלית הערכה של הסרט סינפסות בתדר ספציפי אזורים של העכבר שבלול

מאמר זה מציג משטח שונה הכנה שבלול שיטה הדורשת decalcification ושימוש של תא ודבק רקמה לדבוק פיסות של epithelia לכסות 10 מ"מ כיסוי עגול עבור אימונוהיסטוכימיה העכבר למבוגרים כנימת.

הכנה לפני שבלול בעכבר למבוגרים

במחקר זה, אנו מציגים שיטת הדמיה בזמן אמת באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית כדי להתבונן בתאים הנעים לכיוון רקמה פגומה על ידי דגירה ex vivo עם אפיתל שבלול המכיל את האיבר של קורטי.

הפריה זמן לשגות הדמיה תא חי כדי לחקור את העברת תאים לכיוון האיבר של קורטי

מוצג פרוטוקול לעיבוד שבלול גרביל צעיר ומזדקן על ידי סימון חיסוני של המבנים הסינפטיים ותאי השערה האפרנטיים, מרווה אוטופלואורסצנטיות ברקמה מזדקנת, ניתוח והערכת אורך השבלול, וכימות הסינפסות בערימות תמונה המתקבלות בהדמיה קונפוקלית.

סינפסות סרט אימונו-לבלים וספירתם בשבלול גרביל הצעיר והזקן

כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור מודל עכבר של ליקוי שמיעה הנגרם על ידי רעש (NIHL). כדי ליצור את NIHL, פיתחנו מכשיר חדש ופשוט העשוי מפלסטיק גלי, כלוב מלכודת חולדות ורמקול. תגובת גזע המוח השמיעתי והדמיית אימונופלואורסצנטיות שימשו להערכת תפקוד השמיעה והנזק לתאי השערה החיצוניים, בהתאמה.

תנאי ניסוי מותאמים לאובדן שמיעה כתוצאה מרעש בעכברים והערכת תפקוד השמיעה ונזק לתאי השערה החיצוניים

מיקרוסקופ יריעות אור פותח כדי לצלם ולהפוך שבלול שלם לדיגיטלי.

הדמיה של השבלול המזדקן באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי של יריעות אור

הסטריה וסקולריס חיונית ליצירת הפוטנציאל האנדוקוכליארי. כאן, אנו מציגים את הדיסקציה של העכבר הבוגר stria vascularis עבור ריצוף גרעין יחיד או immunostaining.

דיסקציה של Stria vascularis עכבר בוגר עבור ריצוף גרעין יחיד או immunostaining

פרוטוקול זה, המיועד למשתמשים מתחילים ברקמת האוזן הפנימית של העכבר, מפרט באופן מקיף שלבים לעיבוד אוזניים פנימיות של עכבר בשלבי התפתחות שונים לצביעה חיסונית של חתך.

הקפאה וצביעה חיסונית של רקמת האוזן הפנימית של עכבר: משלב עוברי לשלב בוגר

למד שיטת ניתוח whole mount לשבלול מבוגר בעכבר לשימור מבנה תלת-ממדי של איבר קורטי. השיטה מאפשרת הדמיית תאי שיער ותומכים באמצעות אימונופלואורסצנציה ומיקרוסקופיה קונפוקלית לחקר מדעי השמיעה.

ההר שלם Dissection וImmunofluorescence של מבוגרי עכבר השבלול

גלה סרטונים נוספים