Name: תרבויות יצירה ראשיות פיברובלסטים מרקמות אוזן וזנב עכבר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 35 s
Description: למדו ליצור תרביות פיברובלסטים ראשוניים מאוזן וזנב עכבר. שיטה זו מאפשרת שימוש ברקמות שנשמרו בטמפרטורת החדר עד עשרה ימים לפני בידוד התאים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענק ה-NRF HUJ-CREATE - מנגנונים תאיים ומולקולריים של דלקת.

עכברים שוכנו בתנאי הפתוגן ללא בעמידה בהנחיות המוסדית עד מתת חסד (המוסדי הטיפול בבעלי חיים והנחיות ועדת שימוש (IACUC) באוניברסיטה הלאומית של סינגפור והוועדה הלאומית המייעצת למחקר בבעלי חיים מעבדה (NACLAR) הנחיות). 1. עכברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזמין עכבר אחד הרקע הגנטי המתאים. פרוטוקול זה מבוסס על רקמה נובעת מC57BL אחד / 6 עכבר. </li></ol> 2. הכנת בינונית מלא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן בינוני מלא על ידי הוספת הרכיבים לרוזוול פרק זיכרון המכון (RPMI) מדיום 1640 הבאים: 10% בסרום עגל עוברי (FCS), 50 מיקרומטר 2-mercaptoethanol, 100 מיקרומטר asparagine, גלוטמין 2 מ&quot;מ, 1% פתרון פניצילין, סטרפטומיצין. </li></ol> 3. הכנת פתרונות אנזים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון collagenase D בצינור תחתון חרוטי 15 מיליליטר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוקל 10 מ&quot;ג של collagenase ד דיD ssolve collagenase ב 4 מיליליטר בינוני שלם. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון pronase בצינור 1.7 מיליליטר microcentrifuge. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול 10 מ&quot;ג של pronase. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 μl של 1 חיץ M טריס (pH 8.0). הוסף 1 μl של 0.5 M EDTA (pH 8.0). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראש עם 494 μl של מים סטריליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה פתרון pronase על 37 מעלות צלזיוס באמבט מים למשך 30 דקות. </li></ol></li></ol> 4. הכנת Collagenase D-pronase מיקס (≤2 זנבות) הערה: בצע את השלבים הבאים במכסת מנוע תרבית תאים סטריליים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 250 μl של פתרון pronase 4 מיליליטר של תמיסת collagenase D. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את תערובת D-pronase collagenase דרך פילטר מזרק 0.2 מיקרומטר לתוך צינור תחתון סטרילי 15 מיליליטר חרוטי. </li></ol> 5. הפקת פיברובלסטים מרקמות אוזן וזנב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכברים על פי ההנחיות מוסדיות המתאימות.</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום מכשירים (מספריים ומלקחיים) autoclaved כירורגית בשכונה תרבית תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 10 מיליליטר בינוני שלם לשתי מנות תרבות תא 10 סנטימטרים כל אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את האוזניים (~ רדיוס 1 סנטימטר) ו -5 סנטימטרים של זנב (מקצה הזנב) של עכבר עם מספריים ודגירה של 5 דקות ב 40 מיליליטר אתנול 70% בצינור תחתון סטרילי 50 מיליליטר חרוטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אוזני אוויר יבשות וזנב על ידי הצבת אותם בצלחת תרבית תאי 10 סנטימטרים פתוחות בשכונה במשך 5 דקות. ברגע שהתייבש, אוזן העברה וחתיכות זנב לשתי מנות התרבות שכותרתו &quot;אוזניים&quot; ו- &quot;זנב&quot; המכיל 10 מיליליטר בינוני שלם כמתואר בשלב 5.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת שיער מהאוזניים וזנב המספריים באמצעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את האוזניים וזנב לחתיכות קטנות יותר מ 3 מ&quot;מ בגודל באמצעות מספריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הרקמות לחתוך לתוך 1.8 מיליליטר בקבוקוני cryotube שכותרתו &quot;אוזניים&quot; ו- &quot;זנב&quot; ולהוסיף פתרון D-pronase collagenase מספיק לנפח להגיע הסימן 1.8 מיליליטר בבקבוקון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pתחרה בקבוקוני cryotube אופקית על שייקר ולנער את הדגימות ב 200 סל&quot;ד 90 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 90 דקות דגירה, להסיר את בקבוקוני cryotube מייקר ומניח את צלוחיות במכסת המנוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 10 מיליליטר בינוני שלם לשתי מנות תרבות תא 10 סנטימטר, &quot;אוזניים&quot; שכותרתו ו&quot; זנב &quot;כל אחד, ולשים את מסננת 70 מיקרומטר תא בכל מנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את רקמות אוזן וזנב מתעכלים במסננת 70 מיקרומטר התא במנות מסומנות בהתאם מוכנות בשלב 5.11 וכוח לטחון את הרקמות באמצעות בוכנת מזרק 10 מ&quot;ל ל&gt; 5 דקות. לנער את מסננת התא מדי פעם במדיום לשטוף תאים מתוך מסננת התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה ההשעיה תא מכל מאכל לתוך צינורות תחתון שני 15 מיליליטר חרוטי שכותרתו &quot;אוזניים&quot; ו- &quot;זנב&quot;. לשטוף את הצלחת ומסננת עם מדיום מלא נוסף 10 מ&quot;ל ולהוסיף הבינוני לצינורות תחתון חרוטי 15 מיליליטר המתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה התאהשעיה למשך 7 דקות ב~ 580 XG ו -4 מעלות צלזיוס באמצעות צנטריפוגות תא קירור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר supernatant, להוסיף 10 מיליליטר בינוני שלמה לתא גלולה בשפופרת 15 מיליליטר חרוטי תחתון וresuspend התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 5.14 ו5.15. </li></ol> 6. Culturing של תערובת תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר supernatant. ודא שהתא גלולה נשאר באין מפריע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשעות מחדש תאים ב 10 מיליליטר בינוני שלם ולהוסיף את התערובת המתאימה לשתי מנות תרבות תא 10 סנטימטרים שכותרתו &quot;אוזניים&quot; ו- &quot;זנב&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 amphotericin B פתרון μl (פתרון מניות: 250 מיקרוגרם / מיליליטר) לתרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים ב 37 מעלות צלזיוס ב5% CO 2 באינקובטור humidified. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום השלישי, להחליף בינוני עם בינוני 10 מיליליטר טרי שלם המכיל 10 μl של amphotericin B כדי להסיר שאריות (איורים 1 ו -2). </li></ol> 7. תת-תרבות של פיברובלסטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Wheתרבות n מגיעה סביב 70% confluency (יום 3-4 של תרבות) להסיר את המדיום ולשטוף את התאים עם מי מלח 5 מיליליטר סטרילי פוספט 1x שנאגרו (PBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר PBS ולהוסיף פתרון טריפסין-EDTA 1x סטרילי 2 מיליליטר לתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים למשך 5 דקות על 37 מעלות צלזיוס ב5% CO 2 באינקובטור humidified. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 5 דקות, לטפוח בעדינות את המנה התרבות ולהוסיף 6 מיליליטר בינוני שלמה לתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את ההשעיה תא צינור תחתון 15 מיליליטר חרוטי ולסובב את הצינור במשך 5 דקות ב~ 450 XG ו -4 מעלות צלזיוס באמצעות צנטריפוגות תא קירור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר supernatant, ובעדינות מחדש להשעות את התא גלולה ב 5 מיליליטר בינוני שלם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרע 2 x 10 5 תאים בצלחת תרבית תאי 10 סנטימטרים ודגירת התאים על 37 מעלות צלזיוס ב5% CO 2 באינקובטור humidified במשך 3-4 ימים לפני חזרה על שלבי 7.1-7.6. </li></ol> 8. הכנת אוזניים למשלוח הערה: בצע tהוא השלבים הבאים במכסת מנוע תרבית תאים סטריליים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכברים על פי ההנחיות מוסדיות המתאימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח מספריים ומלקחי autoclaved למכסה מנוע תרבית תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 מיליליטר בינוני שלם לתוך צינור תחתון חרוטי 50 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את האוזניים (~ רדיוס 1 סנטימטר) של עכבר עם מספריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את האוזניים לתוך הצינור התחתון חרוטי 50 מיליליטר (כפי שהוכן בשלב 3) מלקחיים באמצעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאטום את הצינור תחתון 50 מיליליטר חרוטי עם parafilm לפני המשלוח ב RT בתיבה מתאימה. </li></ol>

<ol><li>Fitzpatrick, L. E., McDevitt, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-derived+matrices+for+tissue+engineering+and+regenerative+medicine+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biomater+Sci%22%5BJournal%5D)">Cell-derived matrices for tissue engineering and regenerative medicine applications.</a> Biomater Sci. 3 (1), 12-24 (2015).</li>
<li>Elenbaas, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+breast+cancer+cells+generated+by+oncogenic+transformation+of+primary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Human breast cancer cells generated by oncogenic transformation of primary epithelial cells.</a> Genes Dev. 15 (1), 50-65 (2001).</li>
<li>Stansley, B., Post, J., Hensley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+review+of+cell+culture+systems+for+the+study+of+microglial+biology+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">A comparative review of cell culture systems for the study of microglial biology in Alzheimer's disease.</a> J Neuroinflammation. 9 (1), 115(2012).</li>
<li>Lim, J., Dobson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+transfection+of+HUVEC+and+MEF+cells+using+DNA+complexes+with+magnetic+nanoparticles+in+an+oscillating+field%5BTitle%5D)+AND+%22J+Genet%22%5BJournal%5D)">Improved transfection of HUVEC and MEF cells using DNA complexes with magnetic nanoparticles in an oscillating field.</a> J Genet. 91 (2), 223-227 (2012).</li>
<li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+transduction+of+fibroblasts+and+mesenchymal+stem+cells+by+tyrosine-mutant+AAV2+vectors+for+their+potential+use+in+cellular+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">High-efficiency transduction of fibroblasts and mesenchymal stem cells by tyrosine-mutant AAV2 vectors for their potential use in cellular therapy.</a> Hum Gene Ther. 21 (11), 1527-1543 (2010).</li>
<li>Patel, M., Yang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+reprogramming+somatic+cells+to+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev%22%5BJournal%5D)">Advances in reprogramming somatic cells to induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Rev. 6 (3), 367-380 (2010).</li>
<li>Newman, A. C., Nakatsu, M. N., Chou, W., Gershon, P. D., Hughes, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+requirement+for+fibroblasts+in+angiogenesis%3A+fibroblast-derived+matrix+proteins+are+essential+for+endothelial+cell+luman+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">The requirement for fibroblasts in angiogenesis: fibroblast-derived matrix proteins are essential for endothelial cell luman formation.</a> Mol Biol Cell. 22 (20), 3791-3800 (2011).</li>
<li>Ohlund, D., Elyada, E., Tuveson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+heterogeneity+in+the+cancer+wound%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Fibroblast heterogeneity in the cancer wound.</a> J Exp Med. 211 (8), 1503-1523 (2014).</li>
<li>Guo, S., Dipietro, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dent+Res%22%5BJournal%5D)">Factors affecting wound healing.</a> J Dent Res. 89 (3), 219-229 (2010).</li>
<li>Werner, S., Krieg, T., Smola, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratinocyte-fibroblast+interactions+in+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Keratinocyte-fibroblast interactions in wound healing.</a> J Invest Dermatol. 127 (5), 998-1008 (2007).</li>
<li>Shen, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-derived+cytosolic+DNA+mediates+type+I+interferon-dependent+rejection+of+B+cell+lymphoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Genome-derived cytosolic DNA mediates type I interferon-dependent rejection of B cell lymphoma cells.</a> Cell Rep. 11 (3), 460-473 (2015).</li>
<li>Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+primary+adult+fibroblast+cultures+from+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents.</a> J Vis Exp. (44), (2010).</li>
<li>Baglole, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+phenotypic+characterization+of+lung+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Isolation and phenotypic characterization of lung fibroblasts.</a> Methods Mol Med. 117, 115-127 (2005).</li>
<li>Alt, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts+share+mesenchymal+phenotypes+with+stem+cells%2C+but+lack+their+differentiation+and+colony-forming+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts share mesenchymal phenotypes with stem cells, but lack their differentiation and colony-forming potential.</a> Biol Cell. 103 (4), 197-208 (2011).</li>
<li>Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+essence+of+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The essence of senescence.</a> Genes Dev. 24 (22), 2463-2479 (2010).</li>
<li>Lander, M. R., Moll, B., Rowe, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+procedure+for+culture+of+cells+from+mouse+tail+biopsies%3A+brief+communication%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">A procedure for culture of cells from mouse tail biopsies: brief communication.</a> J Natl Cancer Inst. 60 (2), 477-478 (1978).</li>
<li>Moore, C. B., Allen, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+ear+fibroblast+derivation+from+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Primary ear fibroblast derivation from mice.</a> Methods Mol Biol. (1031), 65-70 (2013).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+stable+pluripotent+stem+cells+from+NOD+mouse+tail-tip+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Generation of stable pluripotent stem cells from NOD mouse tail-tip fibroblasts.</a> Diabetes. 60 (5), 1393-1398 (2011).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין ניגוד אינטרסים פיננסיים.

כאן אנו מספקים הליך ניסוי פשוט, זול ומהיר להקמת תרבויות פיברובלסטים עיקריות מאוזניים וזנבות של עכברים. החילוץ צריך לגרום fibroblasts החלוקה חסיד ומהירות תוך 3 ימים לאחר בידוד של הרקמה. מגבלה חשובה של תאים ראשוניים היא הזדקנות, מעצר צמיחה קבוע 15. שימוש בפרוטוקול, ניתן passaged תרבויות פיברובלסטים במשך 5 עד 6 פעמים לפני fibroblasts הפך מזדקן, שצוין על ידי השטחה של תאים, להגדיל בגודל (2-3 פעמים עליה) וכישלון להרחיב. <p class="jove_content" style=";text-align:right;dir...

תאים ראשוניים נגזרים מרקמת חיה ותרבותית בתנאים במבחנה. מקובל להניח כי תאים ראשוניים דומים למצב הפיזיולוגי ורקע גנטי של הרקמה שממנו הם מקורו משורות תאים הונצחו או גידול 1 באופן הדוק יותר. מסיבה זו, תאים ראשוניים מייצגים מודל שימושי לחקר 2,3 שאלות ביולוגי. עם זאת, בניגוד לשורות תאים קבעו כי לגדול ללא הגבלת זמן, תאים ראשוניים סופו של דבר לעבור הזדקנות בתרבות ובצריכים להיות הוקמו מחדש בתדירות גבוהה. תאים ראשוניים נפוצים כוללים fibroblasts, תאי אפיתל, תאי אנדותל, תאי T, תאי B, מקרופאגים נגזר מח עצם (BMDM) ותאים דנדריטים נגזר מח עצם (BMDC). Fibroblasts לעתים קרובות מנוצלים כמודל תרבית תאים ראשוניים. הם מציעים יתרונות מרכזיים על פני תאים ראשוניים אחרים. תרביות תאים בקלות הוקמו, מתוחזק בקלות ולא דורשות purification של תאים לפני התרבות. יש להם תפוצה ראשונית מהירה ואין דרישה לפרוטוקולים בינוניים או הפעלה מיוחדות. Fibroblasts ניתן transfected ביעילות באמצעות ביולוגי, כימי, ופרוטוקולים פיזיים 4,5. יש אפשרות לאחסן את האוזניים של עד 10 ימים בRT לפני הקמת תרביות תאים. תרבויות פיברובלסטים הם תורמים להדמיה של תהליכי cytoplasmic ומתאימים לתכנות מחדש לתאי גזע pluripotent המושרה (iPS) 6. פיברובלסטים הם תאים חשובים של רקמת החיבור שמפרישים חלבוני קולגן ומטריקס 7. הם מספקים את המסגרת המבנית ברקמות רבות 8 ולשחק תפקיד חיוני בריפוי פצעים ו9,10 תיקון רקמות. כאן, אנו מתארים פרוטוקול פשוט ומהיר (&lt;4 שעות) להקים תרבויות פיברובלסטים מאוזניים וזנבות של עכברים 11. הפרוטוקול מחייב עכבר מינימאליניסיון לקצור את הרקמות (בניגוד לפרוטוקולים אחרים 12,13) ​​וניתן להשתמש בם כדי להקים תרבויות מאוזניים מאוחסנות במדיום ב RT לעד 10 ימים.

<table><tbody><tr><td>RPMI-1640</td><td>HyClone</td><td>SH30027.01</td><td></td></tr><tr><td>סרום עגל עוברי</td><td>HyClone</td><td>SV30160.03</td><td></td></tr><tr><td>2-מרקפטואתנול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>אספרגין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A4159</td><td></td></tr><tr><td>גלוטמין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G8540</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>HyClone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>Merck Millipore</td><td>107017</td><td>אבסולוט לניתוח</td></tr><tr><td>קולגנאז D</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11088866001</td><td>מ-Clostridium histolyticum, פרוטאז פרונאז לא סטרילי, ליופיליזציה, לא סטרילי</td></tr><tr><td></td><td>Merck Millipore</td><td>53702</td><td>מ-Streptomyces griseus&nbsp; </td></tr><tr><td>Tris buffer (pH 8)</td><td>1st BASE</td><td>1415</td><td>Ultra טהור</td></tr><tr><td>כיתה 0.5M EDTA (pH 8)</td><td>1st BASE</td><td>BUF-1053</td><td>ביוטכנולוגיה דרגה</td></tr><tr><td>10X פוספט חוצץ מלח (PBS)</td><td>1st BASE</td><td>BUF-2040-10X4L</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת טריפסין-EDTA</td> בדרגה טהורה במיוחד 10X <td>Sigma-Aldrich</td><td>59418C-100ML</td><td>0.5% טריפסין, 0.2% EDTA, טריפסין גמא מוקרן בתהליך SER-TAIN, ללא פנול אדום, במי מלח</td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2492-20ml</td><td>250 &mu; גרם/מ"ל במים נטולי יונים, מספריים מסוננים סטריליים</td></tr><tr><td></td><td>Aesculap</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forcep</td><td>Aesculap</td><td>AE-BD312R</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &mu; מסנן מזרק M</td><td>Sartorius Stedim</td><td>16534</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; מסננת תאים</td><td>M SPL</td><td>93070</td><td></td></tr><tr><td>בוכנת מזרק</td><td>Terumo</td><td>SS+10L</td><td></td></tr><tr><td>צינור קריוביאלי</td><td>NUNC</td><td>368362</td><td></td></tr><tr><td>צינור מיקרוצנטריפוגה 1.7 מ"ל</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>10 ס"מ צלחת תרבית תאים</td><td>גריינר</td><td>664160</td><td>צלחת טיפול בתרבית תאים&nbsp;</td></tr><tr><td>צינור תחתון חרוטי 15 מ"ל</td><td>גריינר</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל צינור תחתון חרוטי</td> אמבט מים <td>גריינר</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>GFL</td><td></td><td>1002</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>אפנדורף</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>שייקר דגירה</td><td>Sartorius Stedim</td><td></td><td>Certomat-BS1</td></tr><tr><td>Zeiss Axiovert 25 מיקרוסקופ אור</td><td>Carl Zeiss AG</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

תרבויות יצירה ראשיות פיברובלסטים מרקמות אוזן וזנב עכבר

Generating Primary Fibroblast Cultures from Mouse Ear and Tail Tissues

תאים ראשוניים נגזרים ישירות מהרקמה ונחשבים לנציג נוסף של המצב הפיזיולוגי של תאים בגוף חי משורות תאים הוקמו. עם זאת, יש לי תרביות תאים ראשוניות בדרך כלל אורך חיים סופי וצריכה להיות הוקמו מחדש בתדירות גבוהה. פיברובלסטים הם מקור נגיש של תאים ראשוניים. כאן, אנו דנים בהליך ניסיוני פשוט ומהיר להקמת תרבויות פיברובלסטים עיקריות מאוזניים וזנבות של עכברים. הפרוטוקול ניתן להשתמש כדי להקים תרבויות עיקריות פיברובלסטים מאוזניים מאוחסנות על RT עד 10 ימים. כאשר הפרוטוקול ואחריו בזהירות, זיהומים צפויים להתרחש למרות השימוש ברקמות שאינן סטרילי מאוחסנות לזמן ממושך ובמקרים מסוימים. Fibroblasts להתרבות במהירות בתרבות ובניתן להרחיב למספרים משמעותיים לפני שעברנו הזדקנות replicative.

הפקה של fibroblasts מתוצאות רקמה בכמות משמעותית של רקמת פסולת (איור 1). בניגוד לפסולת רקמות, fibroblasts לדבוק משטחי פלסטיק בתרבית רקמה בין יום 1 ו -3 של התרבות. הבינוני של תרבויות פיברובלסטים ניתן לשנות בבטחה ביום 3 של תרבות, שאמור להקטין באופן משמעותי את הרמות של הווה פסולת בתרבות (איור 2). Fibroblasts להציג מורפולוגיה מוארכת והציטופלסמה נראית בבירור (איורים 1 ו -2). תאי mitotic צריכים להיות נוכחים מיום 3 של התרבות ואילך ותאים צ...

אנו מתארים הליך ניסוי פשוט ומהיר ליצירת fibroblasts העיקרי מהאוזניים והזנבות של עכברים. ההליך אינו דורש הכשרה מיוחדת ובעלי חיים יכול לשמש לדור של תרבויות פיברובלסטים מאוזניים מאוחסנות על RT עד 10 ימים.

Primary cells are derived directly from tissue and are thought to be more representative of the physiological state of cells in vivo than established cell ...

המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא להקים תרביות ראשוניות של פיברובלסטים מאוזניו ומזנבו של עכבר. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הביולוגיה של התא, כגון ההבדלים בין תאים בריאים לתאי סרטן. היתרון המרכזי של מחקר זה הוא היכולת להפיק פיברובלסטים מאוזניים שנשמרו במצע בטמפרטורת החדר למשך עד 10 ימים לפני בידוד התאים.למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי ביולוגיה של עכברים, ניתן להחיל אותה גם על אורגניזמים של יונקים אחרים, כגון חולדות וארנבות. לפני איסוף הרקמות, מלאו צלחות תרבית של 10 centimeter ב-10 milliliters של מצע גידול מלא. לאחר מכן, לאחר שהעכבר הומת (euthanized), המשיכו לאסוף את דגימות הרקמה באמצעות מכשירים סטריליים.אספו רקמות מאוזן ברדיוס של כסנטימטר אחד, ואספו כחמישה סנטימטרים של רקמת זנב. העבירו את הרקמות לשפופרת קונית המכילה 40 milliliters של 70% ethanol. השאירו אותן להשריה למשך חמש דקות, ולאחר מכן ייבשו אותן באוויר בתוך צלחת תרבית פתוחה של 10 סנטימטרים למשך חמש דקות במנדף תרביות.לאחר התייבשות הרקמות, העבר אותן אל הצלחת הטעונה במצע. כעת, גזור את השיער מכל הרקמות באמצעות מספריים, ולאחר מכן חתוך את הרקמות לחתיכות קטנות מ-3 מילימטרים. העבר את הרקמה החתוכה לשפופרות קריו (cryotube), ומלא את השפופרות בתמיסת collagenase D pronase עד לסימון של 1.8 מיליליטר.כעת הדגרי את הרקמות בטמפרטורה של 37 °C, תוך ניעור במהירות של 200 rpm למשך 90 דקות. במטעי, מלאי צלחת ב-10 milliliters של מצע גידול מלא. הניחי מעל הצלחת מסננת תאים של 70 micron, ולאחר ההדגרה, העבירי את תוצר עיכול הרקמה אל תוך המסננת.כעת, גרסו את הרקמות במסננת באמצעות בוכנה. בצעו זאת למשך חמש דקות לפחות. מדי פעם נערו את המסננת לתוך התווך כדי לשטוף תאים שהופרדו.חשוב לגרס היטב את רקמות האוזן והזנב שעברו עיכול כדי להפיק מספר רב של תאים. כמו כן, יש להקפיד לנער את מסננת התאים לאחר גרס הרקמות; פעולה זו תשטוף תאים נוספים מתוך המסננת.בשלב הבא, אספו את תרחיף התאים לשפופרת קונית של 15 milliliter. לאחר מכן, שטפו את המסננת עם 10 milliliters של מצע, והוסיפו את תמיסת השטיפה לאספוף. כעת, שטפו את התאים.ראשית, סובב את התאים במערבולת (centrifuge) מקוררת. שנית, הסר את העלייה (supernatant). ושלישית, השהה את התאים ב-10 milliliters של מצע גידול מלא.חזור על השטיפה פעם נוספת, וסיים את הפרוצדורה כאשר התאים נמצאים במדיום מלא, מוכנים לתרבית. כדי לגדל את התאים, העבר תחילה את תרחיפי התאים לצלוחיות תרבית של 10 milliliter. לאחר מכן, הוסף 10 µL של תמיסת amphotericin B לכל תרבית.כעת, דגרו את התאים למשך שלושה ימים. ביום השלישי, החליפו את המצע במצע מלא טרי עם amphrotericin B. זמן קצר לאחר מכן, התרביות יגיעו ל-70% confluency. בנקודה זו, הסירו את המצע ושטפו את התרבית עם 5 mL של 1X PBS.לאחר מכן, החליפו את ה-PBS בשני מיליליטר של תמיסת 1X trypsin EDTA, והדגירו את התאים למשך חמש דקות. לאחר הדגירה הקצרה, הקשקו בעדינות על הצלחות והוסיפו ששה מיליליטר של מצע גידול מלא ורענן לכל צלחת. כעת, העבירו באמצעות פיפט את התאים ששוחררו מהצלחת לשתי מבחנות קוניות של 15 מיליליטר.לאחר מכן, סובבו את המבחנות למשך חמש דקות ב-450 Gs בצנטריפוגה מקוררת. השביו את המשקעים בחמישה מיליליטר של מצע מלא ומדדו את צפיפות התאים של התמיסות. כעת, זרעו את התאים בצלחונות של 10 סנטימטר בריכוז של 200,000 תאים לצלחון.דגרו תאים אלו במשך שלושה עד ארבעה ימים עד שיגיעו ל-70% confluency, ולאחר מכן חזרו על תהליך האיסוף וההזרעה מחדש של התאים בצפיפות ספציפית. ניתן לגדלם בדרך זו למשך עד 25 ימים. שלושה ימים לאחר הפקת התאים, נצפתה כמות משמעותית של פסולת (debris) בתרבית לפני החלפת המדיום.שיירי התאים מסומנים בחצים לבנים. סרגל המقياس מייצג 100 microns. מצע גידול חדש הפחית באופן משמעותי את שיירי התאים.תרביות בנות שלושה ימים שהופקו מרקמה שנשמרה בטמפרטורת החדר למשך 10 ימים הדגימו כי הפיברובלסטים עמידים למדי. מרקמות אלו הושגה התכנסות (confluency) של פיברובלסטים בשיעור של 70% עד 80% לאחר חמישה עד שישה ימים. התאים סומנו באמצעות סמן לפיברובלסטים, vimentin, הנראה בצבע אדום.DAPI שימש לסמימון הגרעינים, הנראים בכחול. סרגל המقياس הוא 10 microns. הצביעה האחידה מעידה על כך שתרבית הפיברובלסטים היא טהורה.הפרוטוקול המתואר השיג תוצאה זו באופן עקבי. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להגיע לסיום זה של הדרך להקמה מהירה ואמינה של תרביות פיברובלסטים ראשוניות. בעת ביצוע הליך זה, יש להקדיש תשומת לב מיוחדת לשלב הפקת הפיברובלסטים מהרקמות, שכן ריסוק לא מספיק של הרקמה יוביל למספר תאים נמוך יותר.

generating-primary-fibroblast-cultures-from-mouse-ear-and-tail-tissues

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

מאמר זה מתאר פרוטוקול עבור בידוד ותחזוקה של תרבויות פיברובלסטים העיקרי של העור, רקמת הריאות של מכרסמים בר.

הקמת ראשיים פיברובלסטים תרבויות למבוגרים מאת מכרסמים

איכות של fibroblasts העכבר עובריים (MEFs) מוכתב על ידי זן הימני של העכבר כגון CF-1. Pluripotency, תומכת MEFs ומדיה ממוזגים (ס"מ) המתקבל אלה יכילו ריכוזים אופטימליים של Activin, שד ו Tgfβ1 הדרושים Activin / קטרי ו מסלולים FGF לשתף operatively לשמור על עצמי התחדשות pluripotency.

הכנת עובריים של עכברים תאים פיברובלסטים מתאים האדם culturing תאים עובריים pluripotent המושרה בתאי גזע

תאי גזע pluripotent מושרה קווים מניבים (iPSC) מייצרים שורות של פוטנציאל ההתפתחותי שונים גם כאשר הם עוברים בדיקות תקן לpluripotency. כאן אנו מתארים פרוטוקול לייצר עכברים נגזרים לחלוטין מiPSCs, המגדיר את קווי iPSC כבעל pluripotency...

דור של עכברים שמקורם בתאי גזע pluripotent מושרים

סרטון זה מתאר את השיטה המהירה לבודד ולגדל את המלנוציטים והפיברובלסטים בו זמנית מעורו של גור העכבר לאחר הלידה. תאים אלה יכולים להישמר ולתפעל במבחנה כדי לחקור ביולוגיה של תאי העור, ריפוי פצעים ומלנומה.

גידול מהיר של מלנוציטים ופיברובלסטים ראשוניים של מורין: בידוד מלנוציטים ופיברובלסטים מדגימת עור מורין שלם

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לייצר שתלי כלי רקמה מהונדסת, כי הם פונקציונליים להשתלה לעכברים על ידי זריעה כפולה תאי גזע pluripotent מושרה באופן חלקי (PiPSC) - נגזר תאי שריר חלק וPiPSC - תאי האנדותל נגזרו על bioreactor פיגום כלי decellularized.

דור והארכת כלי רקמות מהונדסות במודל עכבר

אנו מתארים כאן פרוטוקול ליצירת iCMs באמצעות מסירה בתיווך רטרו-וירוס של Gata4, Tbx5 ו-Mef2c במבנה פוליציסטרוני. פרוטוקול זה מניב אוכלוסייה הומוגנית יחסית של תאים מתוכנתים מחדש עם יעילות ואיכות משופרים והוא בעל ערך למחקרים עתידיים של תכנות מחדש של iCM.

דור משופר של המושרה cardiomyocytes שימוש Construct Polycistronic הבעת יחס אופטימלי של Gata4, Mef2c וTbx5

התנהגות פיברובלסטים עומדת בבסיס ספקטרום של ישויות קליניות, אך הן נשארות מאופיינות בצורה גרועה, בעיקר בשל ההטרוגניות הטבועה בהן. מחקר פיברובלסטים מסורתי מסתמך על מניפולציה במבחנה, המסווה התנהגות פיברובלסטים in vivo. אנו מתארים פרוטוקול מבוסס FACS לבידוד פיברובלסטים של עור עכבר שאינו דורש תרבית תאים.

עכברי Dermal פיברובלסטים בידוד על ידי FACS

כאן אנו מציגים שלנו פרוטוקול עבור הפקת המושרה אבות erythroid (iEPs) מן העכבר fibroblasts למבוגרים באמצעות מונחי-פקטור שעתוק ישיר לשושלת התכנות (DLR).

ישיר לשושלת התכנות של העכבר למבוגרים פיברובלסט Erythroid אבות

פרוטוקול זה מתאר שיטה מהירה לייצר בו תרבויות מלנוציט ופיברובלסט מן העור של 0-4 העכברים הישנים של היום. התרבויות העיקריות הללו ניתן לשמור ומניפולציות בתוך מבחנה כדי ללמוד מגוון של תהליכים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית, כולל ביולוגיה של תאי העור, פיגמנטציה, ריפוי פצעים ומלנומה.

הדור המהיר של משפחת מלנוציט הראשית והתרבויות בפיברובלסט

אנו מציגים פרוטוקול כדי לבודד את הפיברוטים הראשוניים העיקריים באופן קל, מהיר ואמין, performable על ידי למתחילים (למשל, סטודנטים). הליך זה משלב את העיכול ברקמה אנזימטית ועצבנות מכנית עם גלי אולטרה סאונד כדי להשיג פיברוהטיות ראשונית. ניתן להתאים את הפרוטוקול בקלות לדרישות נסיוניות ספציפיות (לדוגמה, רקמת אדם).

אולטרה סאונד-מוגבר למבוגרים בידוד פיברוהפיצוץ

מוצג כאן פרוטוקול ליצירת רקמות חיבור מהונדסות לתרבות מקבילה של 48 רקמות בלוח רב-בארות עם מוטות כפולים, המתאימים למחקרים מכאניסטיים, מידול מחלות ויישומי סינון. הפרוטוקול תואם פיברובלסטים מאיברים ומינים שונים ומודגם כאן עם פיברובלסטים לב ראשוניים אנושיים.

פיברובלסט נגזר רקמת חיבור מהונדסת אנושית עבור יישומי הקרנה

למדו ליצור תרביות פיברובלסטים ראשוניים מאוזן וזנב עכבר. שיטה זו מאפשרת שימוש ברקמות שנשמרו בטמפרטורת החדר עד עשרה ימים לפני בידוד התאים.

תרבויות יצירה ראשיות פיברובלסטים מרקמות אוזן וזנב עכבר

גלה סרטונים נוספים