Au-אינטראקציה של הפולימרים Slp1 וחד שכבתי מ Lysinibacillus sphaericus JG-B53 - QCM-D, ICP-MS וAFM ככלים לbiomolecule-מתכת לימודים

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לחקור את התנהגות ספיגת הזהב על ידי חלבוני שכבת S של זן החיידקים המוצג מנקודת מבט אקולוגית וטכנולוגית. שיטות אלו יכולות לענות על שאלות מפתח במדע הקשור לסביבה בתחומים כאלה של תהליכי ספיגה והסרה והשבה של מתכות. היתרון העיקרי של טכניקות אלו הוא שניתן לזהות ספיגת מתכות וספיחת ננו-חלקיקים בטווח קנה מידה אחר.

על ידי שימוש ב-QCM-D ניתן לזהות זאת במדידה בזמן אמת. כדי להתחיל בהליך זה, ציידו את תאי הנוזל בבובות חיישנים. יש לשאוב לפחות 20 מיליליטר לכל מודול של חומר ניקוי נוזלי אלקליין 2% במים טהורים במיוחד דרך מערכת ה-QCM-D והצינורות.

לאחר מכן, יש לשאוב נפח פי חמישה לכל מודול של מים טהורים במיוחד דרך המערכת בקצב זרימה של עד 300 מיקרוליטר לדקה לפי פרוטוקול היצרן. נקה את חיישני הסיליקון הדו-חמצני מחוץ למודולי הזרימה על ידי דגירה בתמיסת נתרן דודציל סולפט 2% למשך 20 דקות לפחות. לאחר מכן, שטפו את החיישנים מספר פעמים במים טהורים במיוחד.

לאחר ייבוש הגבישים באוויר דחוס מסונן, הניחו אותם בתא ניקוי אוזון למשך 20 דקות. לאחר מכן, חזור על הליך הניקוי פעמיים כדי להסיר את כל התכולה האורגנית. כדי להסיר מתכות קשורות ממשטח החיישן, שטפו את החיישנים בחומצה חנקתית טוחנת אחת.

לאחר מכן שטפו את החיישנים מספר פעמים במים טהורים במיוחד. לאחר מכן, שנה את החיישנים עם שלושה גרם לליטר של שכבות מתחלפות של פוליאתילנימין ופוליסטירן סולפונאט באמצעות ציפוי טבילה באמצעות שכבה אחר שכבה או טכניקת LBL. הנח את החיישנים בתוך תמיסת הפוליאלקטרוליט המתאימה בצלחות באר עמוקות ודגר אותם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, הסר את החיישנים מתמיסת הפוליאלקטרוליטים ושטוף אותם בין כל שלב ציפוי טבילה באינטנסיביות במים טהורים במיוחד. לאחר השלמת השינוי החיצוני, הנח את החיישנים בתוך מודול הזרימה. אזנו את החיישנים על ידי שטיפתם במים טהורים במיוחד לפני תחילת הניסויים.

בשלב זה, ממיסים את Slp1 שבודד ומטוהר בעבר בפורמולה אוריאה להמרת הפולימרים למונומרים. צנטריפוגה של החלבונים המונומריים ב-15,000 פעמים גרם ו-4 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת כדי להסיר מצבורי חלבון גדולים יותר. מערבבים את הסופרנטנט Slp1 המסיס והצנטריפוגה עם מאגר התגבשות מחדש לריכוז חלבון סופי של 0.2 גרם לליטר.

לאחר התגבשות מחדש מוצלחת של חלבון על גבי החיישנים ששונו בפוליאלקטרוליט בתוך מודולי הזרימה, שטפו את החיישנים המצופים עם מאגר התגבשות מחדש באופן אינטנסיבי עם קצב זרימה של 125 מיקרוליטר לדקה עד לזיהוי ערכים יציבים של תזוזות תדר ופיזור. לאחר ציפוי Slp1 מוצלח במודולי הזרימה, שטפו את שכבת ה-Slp1 המתקבלת באינטנסיביות עם מאגר ציטראט 1.6 מילי-מולרי pH 5.0 עד לזיהוי ערכים יציבים של תזוזות תדר ופיזור. לאחר מכן, יש לשאוב תמיסת ננו-חלקיקים מילי-מולרית שהוכנה בעבר למודולי הזרימה בקצב זרימה של 125 מיקרוליטר לדקה.

לאחר מכן, עקוב אחר ספיחת המסה לשכבת Slp1. לאחר השלמת האינטראקציה של ננו-חלקיקי מתכת, שטפו את השכבה עם מאגר נטול ננו-חלקיקים כדי להסיר מתכות או ננו-חלקיקים קשורים חלשים. באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי או AFM עם מיקרוסקופ אופטי הפוך, הקלט תמונות בנוזל באמצעות מים טהורים במיוחד ישירות על חיישני QCM-D המצופים.

שטפו את החיישנים במים טהורים במיוחד לאחר ניסויי QCM-D והניחו אותם בתוך תא הנוזל AFM. השתמש בשלוחה עם תדר תהודה של כ-25 קילו-הרץ במים וקשיחות של פחות מ-0.1 ניוטון למטר. כוונן את מהירות הסריקה בין 2.5 ל-10 מיקרומטר לשנייה.

צלם תמונות במצב מגע דינמי בזמן שהשלוחה מתרגשת מפייזו בתדר התהודה שלה. לבסוף, קבע את המרחק של השלוחה לפני השטח על ידי שיכוך התנודה. יכולות קשירת המתכת המקסימליות של זהב שלוש על ידי Slp1 תלוי מראות שהוא היה קשור באופן יציב במהלך הדגירה של 24 שעות בטווח ה-pH שנחקר.

הירידה המיידית בתדירות מעידה על ספיחה מהירה וזיקה גבוהה של החלבונים למשטח הפוליאלקטרוליט שהשתנה. הפיזור גם גדל מיד, מה שמעיד על ספיחה של מולקולות ויסקו-אלסטיות לפני השטח בגלל שיכוך מהיר וכתוצאה מכך ערכי פיזור גדלים. ננו-חלקיקי אפס זהב מסונתזים מראש הודגרו עם Slp1 ונותחו על ידי SDS-PAGE שאימת את נתוני QCM-D המראים כי ננו-חלקיקים אינם מפריעים למבנה Slp1.

הספיחה של ננו-חלקיקי אפס זהב מתכתיים מסונתזים מראש מוצגת עבור ניסויי QCM-D בחלקות דלתא F-דלתא D וכפרופילי עובי ומסה. סריג החלבון של Slp1 שהתגבש מחדש על חיישנים שעברו שינוי פוליאלקטרוליט מוצג כאן. קבוע הסריג נקבע כ-13 עד 14 ננומטר ועובי השכבה נמצא כ-10 פלוס מינוס שני ננומטר.

מחקרי AFM אימתו כי לאחר אינטראקציית שלושת הזהב, סריג Slp1 נותר שלם לחלוטין, מה שמאשר את תוצאות QCM-D שחזו את יציבות הציפוי. AFM מאמת את הספיחה של ננו-חלקיקי אפס זהב על סריג Slp1 אך בשל גודל החלקיקים, הם אינם עוקבים אחר סימטריית p4 של Slp1. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך יום עבודה אחד אם היא מבוצעת כראוי.

בעקבות שיטות אלה, ניתן לבצע טכניקות אחרות כמו ספקטרוסקופיה אינפרא אדום או מיקרוסקופ יון הליום כדי לענות על שאלות נוספות כמו כוונות קשירה ספציפיות או אינטראקציה עם ננו-חלקיקי זהב או זהב. הטכניקה שהוצגה סללה את הדרך לאוזרכם לחקור את האינטראקציות של ביומולקולות עם מתכות ולמשל את התנהגות הספיחה וההתפרקות על סוגים שונים של משטחים. לאחר צפייה בסרטון זה, כעת עליך להבין היטב כיצד לחקור אינטראקציות של מתכות עם ממיסים ביולוגיים ובבקשה כאשר אתה משתמש בשיטה זו אל תשכח להשתמש במשקפי מגן, מעיל מעבדה וכמובן גם כפפות.