Name: Au-אינטראקציה של הפולימרים Slp1 וחד שכבתי מ Lysinibacillus sphaericus JG-B53 - QCM-D, ICP-MS וAFM ככלים לbiomolecule-מתכת לימודים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: חקור את ספיחת הזהב באמצעות חלבוני S-layer מ-Lysinibacillus sphaericus באמצעות QCM-D, ICP-MS ו-AFM. שיטות אלו מאפשרות זיהוי בזמן אמת של ספיחת מתכות ואדסורפציית ננו-חלקיקים לשיקוף סביבתי וטכנולוגי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

העבודה הנוכחית מומנה בחלקה על ידי IGF-הפרויקט &quot;S-המסננת&quot; (490 ZBG / 1) ממומן על ידי BMWi וBMBF-פרויקט &quot;Aptasens&quot; (BMBF / DLR 01RB0805A). תודה מיוחדת לטוביאס ג &#39;גינטר לעזרה הרבה ערכו במהלך לימודי AFM ואריק V. ג&#39;ונסטון לקריאת כתב היד כדובר אנגלית כשפה אם. יתר על כן, מחברו של מאמר זה מבקש להודות לאלין ריטר וסברינה Gurlit (ממכון לאקולוגית משאבים לסיוע במדידות ICP-MS), מניה פוגל, ננסי אונגר, קארן E. Viacava וביוטכנולוגיה הקבוצה של הלמהולץ-המכון פרייברג למשאבים וטכנולוגיה.

יש המחברים אין לחשוף.

בעבודה זו בחנה את הכריכה של Au לחלבוני S-שכבה נחקרה באמצעות שילוב של שיטות אנליטיות שונות. בפרט, מחייב Au הוא אטרקטיבי מאוד לא רק להתאוששות של Au ממי כרייה או פתרונות תהליך, אלא גם לבנייה של חומרים, למשל, משטחים חושיים. ללימודים של האינטראקציה Au (Au (III) וAu (0) -NPs) עם מושעה וrecrystallized monolayer של Slp1, היה לי החלבון להיות מבודד. לכן, מחקר זה הראה גידול המוצלח של זן חיידקי גרם חיובי ל sphaericus JG-B53 והבידוד של חלבון שכבת פני השטח Slp1. עם זאת, הטיפוח...

בשל השימוש הגובר של זהב עבור מספר יישומים כמו אלקטרוניקה, זרזים, חיישנים, או מכשירים רפואיים, הביקוש של מתכת יקרה זו גדל במשך הזמן כמה השנים האחרונות 6-9. זהב, כמו גם רבות מתכות יקרות וכבדות אחרות משתחררים לסביבה באמצעות שפכים תעשייתיים בריכוזים לדלל, באמצעות פעילויות כרייה, וסילוק פסולת 7,8,10, למרות שרוב הזיהום סביבתי על ידי מתכות כבדות או יקרות הוא תהליך מתמשך נגרמים בעיקר על ידי פעילות טכנולוגית. זה מוביל להפרעה משמעותית של מערכות אקולוגיות טבעיות ועלול לאיים על בריאות אדם 9. ידיעת תוצאות השליליות אלה מקדם את החיפוש אחר שיטות חדשות להסרת מתכות ממערכות אקולוגיות ושיפורים מזוהמים במחזור מתכות משפכים תעשייתיים. שיטות פיסיקלי כימיות מבוססות היטב כמו משקעים או חילוף יונים הן לא כל כך יעילות, במיוחד בתחום ההייly מדולל פתרונות 7,8,11. Biosorption, גם עם חיים או מת ביומסה, היא חלופה אטרקטיבית לטיפול בשפכים 10,12. השימוש בחומרים ביולוגיים כזה יכול להפחית את הצריכה של כימיקלים רעילים. מיקרואורגניזמים רבים תוארו לצבור או לשתק מתכות. לדוגמא, תאים של sphaericus Lysinibacillus (L. sphaericus) JG-A12 הראו יכולות גבוהות מחייבות למתכות יקרות, למשל, פ&quot;ד (II), Pt (II), Au (III), ומתכות רעילות אחרות כמו Pb (II) או U (VI) 4,13, תאים של megaterium Bacillus לCr (VI) 14, תאים של שמר אפייה לPt (II) וPd (II) 15, ווולגרי כלורלה לAu (III) וU (VI) 16 , 17. הכריכה של מתכות קודמות כמו Au (III), פ&quot;ד (II), וPt (II) דווח גם לDesulfovibrio desulfuricans 18 ולL. sphaericus JG-B53 19,20. עם זאת, לא אלהחיידקים l לקשור כמויות גבוהות של מתכות ויישומם כחומר sorptive מוגבלים 12,21. יתר על כן, מחייבת קיבולת מתכת תלויה בפרמטרים שונים, למשל, הרכב תא, ביו-רכיב המשמש, או סביבתי ותנאי ניסוי (pH, כוח יוני, וכו &#39;טמפרטורה). המחקר של דופן תא שברים המבודדים 22,23, כמו שומני קרום, פפטידוגליקן, חלבונים, או רכיבים אחרים, מסייע להבין את המתכת מחייבת תהליכים של תאים שלמים נבנו מורכבים 8,21. מרכיבי התא התמקדו במחקר זה הם חלבוני S-שכבה. חלבוני S-שכבה הם חלקים של מעטפת התא החיצונית של חיידקים וחיידקים קדומים רבים, והם מהווים כ -15 - 20% ממסת החלבון הכוללת של אורגניזמים אלה. כממשק הראשון לסביבה, תרכובות תאים אלה משפיעות בחוזקה על תכונות ספיחת חיידקי 3. חלבוני S-שכבה עם משקולות מולקולריות הנעות בין ארבעיםלמאות kDa מיוצרים בתוך התא, אבל הם התאספו מחוץ בו הם יכולים ליצור שכבות על ממברנות שומנים בדם או מרכיבי דופן תא פולימרים. ברגע בודד, כמעט כל S-שכבת חלבונים הרכוש המהותי לאופן ספונטני עצמי להרכיב בהשעיה, בממשקים, או על משטחים ויוצרים מבנים מישוריים או כמו צינור-3. עובי monolayer החלבון תלוי בחיידקים והוא בטווח של 5-25 ננומטר 24. באופן כללי, מבני חלבון S-שכבה נוצרו יכולים להיות אלכסוני (P1 או P2), ריבוע (P4), או משושה (P3 או P6) סימטריה עם קבועי סריג של 2.5-35 3,24 ננומטר. נראה היווצרות הסריג להיות במקרים רבים תלויים בקטיונים דו ערכיים ובעיקר על Ca 2 + 25,26, רף, ג &#39;ואח&#39;. S-שכבת nanocomposites מבוסס עבור יישומים תעשייתיים הבמבוסס על החלבון מהונדס ננו. (עורכים Tijana ז גרוב ואיית&#39;יבר ל Cortajarena) (Springer, 2016 (שהוגש)). עם זאת, המפל מלא התגובה של קיפול מונומר, אינטראקציה מונומר-מונומר, ההיווצרות של סריג, והתפקיד של מתכות שונות, בעיקר של קטיונים דו ערכיים כגון Ca 2 + וMg 2 +, עדיין לא הבין באופן מלא. המתח גרם-חיובי ל sphaericus JG-B53 (שם מsphaericus Bacillus לאחר סיווג פילוגנטי החדש) 27 היה מבודד מערימת פסולת כריית אורניום &quot;Haberland&quot; (Johanngeorgenstadt, סקסוניה, גרמניה) 4,28,29. חלבון S-השכבה הפונקציונלית שלה (Slp1) בעל סריג מרובע, משקל מולקולרי של 116 kDa 30, ועובי של 10 ננומטר ≈ על תאי חיים חיידקים 31. במחקרים קודמים, ההיווצרות במבחנה של שכבת חלבון סגורה ויציבה בעובי של כ -10 ננומטר הושגה בפחות מ -10 דקות 19. הזן הקשורים ל sphaericus JG-A12, גם לבודד מהערימה &quot;Haberland&quot;, בעל יכולות גבוהה מחייבות מתכת וחלבון S-השכבה המבודדת שלה הוכיח כימי גבוהות ויציבות מכאנית ושיעורי ספיחה טובים למתכות יקרות כמו Au (III), Pt (II), וPd (II) 4,32,33. זה מחייב מתכות יקרות הוא פחות או יותר ספציפי לכמה מתכות ותלויות בזמינות של קבוצות פונקציונליות על פני החלבון החיצוני ופנימי של הפולימר ובנקבוביות שלה, כוח יוני, וערך ה- pH. קבוצות פונקציונליות רלוונטיות לאינטראקציה מתכת על ידי החלבונים הן COOH-, NH 2 -, OH-, PO 4 -, SO 4 -, וכך-. באופן עקרוני, יכולות מחייבות מתכת לפתוח ספקטרום רחב של יישומים, רף, ג &#39;ואח&#39;. S-שכבת nanocomposites מבוסס עבור יישומים תעשייתיים הבמבוסס על החלבון מהונדס ננו. (עורכים Tijana ז גרוב ואיית&#39;יבר ל Cortajarena) (Springer, 2016 (שהוגש)). לדוגמא, כרכיבי biosorptive להסרת או שחזורשל מתכות רעילות או בעל ערך מומס, תבניות לסינתזה או בתצהיר מוגדר של חלקיקים מובנים באופן קבוע מתכתיים (NPS) לקטליזה, וחומרים מהונדסים יו אחרים כמו שכבות ביו-חושי 3,5,18,33. מערכים מסודרים באופן קבוע NP כמו Au (0) -NPs יכולים לשמש ליישומים מרכזיים החל אלקטרוניקה מולקולרית וחיישנים, התקני אחסון צפיפות ultrahigh, וזרזים לCO-חמצון 34-37. הפיתוח של יישומים כגון ועיצוב חכם של חומרים אלה מחייב הבנה עמוקה יותר של המנגנונים המחייבים המתכת הבסיסית. תנאי מוקדם לפיתוח של חומרים מבוסס ביו כזה הוא היישום אמין של שכבת ממשק בין biomolecule והמשטח הטכני 38,39. לדוגמא, פוליאלקטרוליטים התאספו עם 40,41 טכניקת השכבה אחר שכבה (LBL) שימשו כשכבת ממשק לגיבוש מחדש של חלבוני S-שכבה 39 </sup&gt;. כגון ממשק מציע דרך קלה יחסית לביצוע ציפוי החלבון בדרך לשחזור וכמותיים. על ידי ביצוע ניסויים שונים עם וללא שינוי עם יזמי דבק, אפשר להצהיר הצהרות בנוגע לקינטיקה ציפוי, יציבות שכבה, ואינטראקציה של מתכות עם מולקולות ביולוגיות 19,42, רף, ג &#39;ואח&#39;. S-שכבת nanocomposites מבוסס עבור יישומים תעשייתיים הבמבוסס על החלבון מהונדס ננו. (עורכים Tijana ז גרוב ואיית&#39;יבר ל Cortajarena) (Springer, 2016 (שהוגש)). עם זאת, המנגנון המורכב של חלבון הספיחה והאינטראקציה חלבון-פני השטח אינו מובן לחלוטין. במיוחד מידע על קונפורמציה, אוריינטצית דפוס, וצפיפות ציפוי עדיין חסר. microbalance גביש קוורץ עם ניטור פיזור (QCM-D) טכניקה משך תשומת לב בשנים האחרונות ככלי ללימוד חלבון ספיחה, קינטיקה ציפוי, ופרו אינטראקציהcesses בקנה המידה ננומטרי 19,43-45. טכניקה זו מאפשרת לגילוי מפורט של ספיחה המונית בזמן אמת, ויכולה לשמש כאינדיקציה לתהליך חלבון הרכבה העצמית והצימוד של מולקולות תפקודיות ברשתות חלבון 19,20,42,46-48. בנוסף, מדידות QCM-D לפתוח את האפשרות ללמוד תהליכי אינטראקציה מתכת עם השכבה חלבוניים בתנאים ביולוגיים טבעיים. במחקר שנערך לאחרונה, את האינטראקציה של חלבון S-השכבה עם מתכות נבחרו כמו האיחוד האירופי (III), Au (III), פ&quot;ד (II), וPt (II) נחקר עם QCM-D 19,20. שכבת חלבון adsorbed יכולה לשמש כמודל מופשט של דופן תא של חיידקי גרם חיובי. המחקר של מרכיב אחד זה יכול לתרום להבנה עמוקה יותר של אינטראקציה מתכת. עם זאת, רק ניסויי QCM-D לא מאפשרים הצהרות לגבי מבני משטח והשפעות של מתכות לחלבון. טכניקות אחרות הן הכרחיות כדי להשיג מידע כזה. קופה אחתsibility ליו-ננו הדמיה ומידע על קבלת תכונות מבניות הוא במיקרוסקופ הכוח האטומי (AFM). מטרתו של המחקר שהוצג הייתה לחקור את הספיחה של זהב (Au (III) וAu (0) -NPs) לחלבוני S-שכבה, בSlp1 המסוים של ל &#39; sphaericus JG-B53. ניסויים נעשו עם חלבונים תלויים על קנה מידה אצווה בטווח pH של 2.0-5.0 באמצעות ICP-MS ועם S-שכבות משותקות באמצעות QCM-D. בנוסף, ההשפעה של תמיסת מלח מתכת על יציבות הסריג נחקרה במחקרים AFM שלאחר מכן. השילוב של טכניקות אלה תורם להבנה טובה יותר של תהליכים באינטראקצית מתכת מבחנה ככלי ללמידה נוסף על אירועים מחייבים בתאים שלמים של חיידקים לגבי זיקות מתכת ספציפיות. ידע זה הוא לא רק חיוני לפיתוח של חומרי מסנן ישימים עבור ההתאוששות של מתכות להגנה על סביבה ושימור מחדשמקורות 49, אלא גם לפיתוח של מערכים של צירופים ומתכתיים הורה מאוד עבור יישומים טכניים שונים.

<table><tbody><tr><td><חזק>ציוד ותוכנה</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bioreactor, Steam In Place מערכת פיילוט 70L</td><td>Applikon Biotechnology, הולנד</td><td>Z6X</td><td>כולל dO2, חיישני pH של Applikon Biotechnology ותוכנת BioXpert V2</td></tr><tr><td>צג ביומסה לא פולשני BugEye 2100</td><td>BugLab, קונקורד (קליפורניה), ארה"ב</td><td>Z9X</td><td>---</td></tr><tr><td>ספקטרומטר Ultrospec 1000</td><td>Amersham Pharmacia Biotech, בריטניה</td><td>80-2109-10</td><td>החברה כעת GE Healthcare Life Sciences</td></tr><tr><td>MiniStar מיקרו צנטריפוגה</td><td>VWR, גרמניה</td><td>521-2844</td><td>לצנטריפוגה של דגימות גידול</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ מערכת מחקר BX-61</td><td>אולימפוס גרמניה LLC, גרמניה</td><td>037006</td><td>מיקרוסקופ בשילוב עם תוכנת הדמיה</td></tr><tr><td>Cell^P (גרסה 3.1)</td><td>אולימפוס פתרונות הדמיה רכה LLC, M&uuml; nster, גרמניה</td> <td>---</td><td>יחד עם מיקרוסקופ</td></tr><tr><td>Powerfuge מערכת הפרדת פיילוט סדרה 9010-S</td><td>Carr Centritech, פלורידה, ארה"ב</td><td>9010PLT</td><td>לקצירת ביומסה</td></tr><tr><td>T18 בסיסי Ultra Turrax</td><td>IKA Labortechnik, גרמניה</td><td>431-2601</td><td>להסרת דגלים והומוגניזציה של דגימה</td></tr><tr><td>Sorvall Evolution RC Superspeed Centrifuge</td><td>Thermo Fisher Scientific, ארה"ב</td><td>728411</td><td>בשימוש בבידוד חלבון</td></tr><tr><td>מעבד נוזל גזירה גבוה נייד, M-110EH-30 פיילוט</td><td>מיקרופלואידיקה, מסצ'וסטס, ארה"ב</td><td>M110EH30K</td><td>משמש לקרע תאים</td></tr><tr><td>אלפא 1-4 LSC מייבש הקפאה</td><td>Martin Christ Freeze dryers LLC, Osterode, גרמניה</td><td>102041</td><td>---</td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטריית UV-VIS (NanoDrop 2000c)</td><td>Thermo Fisher Scientific, ארה"ב</td><td>91-ND-2000C-L</td><td>לקביעת חלבון ריכוז</td></tr><tr><td>תא אלקטרופורזה אנכית Mini-PROTEAN</td><td>Bio-Rad Laboratories GmbH, מינכן, גרמניה</td><td>165-3322</td><td>עבור SDS-PAGE</td></tr><tr><td>VersaDoc Imaging System 3000</td><td>Bio-Rad Laboratories GmbH, מינכן, גרמניה</td><td>1708030</td><td>משמש להדמיה של ג'ל SDS-PAGE</td></tr><tr><td>ICP-MS Elan 9000</td><td>PerkinElmer, Waltham (MA), ארה"ב</td><td>N8120536</td><td>לקביעת ריכוז</td></tr> <tr><td>המתכתZetasizer Nano ZS</td><td>Malvern Instruments, ווסטרשייר בריטניה</td><td>ZEN3600</td><td>לקביעת גודל ננו-חלקיקים</td></tr><tr><td>התקן Q-Sense E4&nbsp;</td><td>Q-Sense AB, גטבורג, שוודיה</td><td>QS-E4</td><td>הוזמן באמצעות תכנון קוונטי LOT (תוכנה כלולה בפלטפורמת E4)</td></tr> <tr><td>Q-Soft 401 (הקלטת נתונים)</td> <td>Q-Sense AB, גטבורג, שוודיה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Q-Tools 3 (הערכת נתונים ומידול)</td><td>Q-Sense AB, גטבורג, שוודיה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מודולי זרימת QCM-D QFM&nbsp; 401&nbsp;</td><td>Q-Sense AB, גטבורג, שוודיה</td><td>QS-QFM401</td><td>הוזמן באמצעות עיצוב קוונטי LOT</td></tr><tr><td>QSX&nbsp; 303 SiO2 חיישני קוורץ פיזואלקטריים בחיתוך AT</td><td>Q-SENSE AB, גטבורג, שוודיה</td><td>QS-QSX303</td><td>הוזמן באמצעות LOT עיצוב קוונטי</td></tr><tr><td>תא ניקוי אוזון</td><td>Bioforce Nanoscience, איימס (IA), USA</td><td>QS-ESA006</td><td>הוזמן באמצעות LOT עיצוב קוונטי</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ כוח אטומי MFP-3D Bio AFM</td><td>Asylum Research, סנטה ברברה (קליפורניה), ארה"ב</td><td>MFP-3DBio</td><td>תוכנת מדידות והדמיה AFM</td></tr><tr><td>Asylum Research AFM Software AR גרסה 120804+1223</td><td>Asylum Research, סנטה ברברה (קליפורניה), ארה"</td><td></td><td>ב---תוכנת הדמיה הכלולה ב-Cat. לא. MFP-3DBio</td></tr><tr><td>Igor Version Pro 6.3.2.3 תוכנה</td><td>תוכנת WaveMetrics, Inc., ארה"</td><td></td><td>ב---הדמיה הכלולה ב-Cat. לא. MFP-3DBio</td></tr><tr><td>BioHeater</td><td>Asylum Research, סנטה ברברה (קליפורניה), ארה"ב</td><td>מחמם ביולוגי</td><td>לדוגמא למדידות AFM</td></tr><tr><td>ביוליוור מיני שלוחה,&nbsp; BL-AC40TS-C2</td><td>אולימפוס גרמניה LLC, גרמניה</td><td>&nbsp; BL-AC40TS-C2</td><td>שלוחה מועדפת למדידות AFM</td></tr><tr><td>WSxM 5.0 Develop 6.5 (2013)</td><td>Nanotec Electronica S.L., ספרד</td><td>תוכנה חופשית</td><td>תוכנה לניתוח AFM</td></tr><tr><td>שם<</td><td>strong>חברה</td><td>מספר קטלוגי</td><td>הערות</td></tr><tr><td>חומרי ניקוי וציוד אחר</חזק> </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>חומצה חומצית, 100%, p.A.</td><td>קארל רוט GmbH+CO. KG</td><td>3738.5</td><td>סכנה, נוזל ואדים דליקים וקורוזיביים. גורם לכוויות קשות בעור ולנזק לעיניים.</td></tr><tr><td>אנטי קצף 204</td><td>סיגמא-אולדריץ' ושות', LLC.</td><td>A6426</td><td>לדיכוי קצף</td></tr><tr><td>ברומופנול כחול, מלח נתרן</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>B5525</td><td></td></tr><tr><td>---Coomassie Brilliant Blue R (C45H44N3NaO7S2)</td><td>CARL ROTH GmbH+CO. KG</td><td>3862.1</td><td>---</td></tr><tr><td>Deoxyribonuclease II מטחול חזיר</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>D4138</td><td>טיפוסי IV , 2,000 - 6,000&nbsp; יחידות קוניץ/מ"ג חלבון</td></tr><tr><td>אתנול, 95%</td> <td>VWR, גרמניה</td><td>20827.467</td><td>סכנה,</td></tr><tr><td>גליצרין דליק, p.A.</td><td>קארל רוט GmbH+CO. KG</td><td>3783.1</td><td>---</td></tr><tr><td>גואנידין הידרוכלוריד (GuHCl)</td><td>CARL ROTH GmbH+CO. KG</td><td>0037.1</td><td>---</td></tr><tr><td>Hellmanex III</td><td>Hellma GmbH & Co. KG</td><td>9-307-011-4-507</td><td>---</td></tr><tr><td>חומצה הידרוכלורית (HCl) (37%)</td><td>CARL ROTH GmbH+CO. KG</td><td>4625.2</td><td>סכנה; מאכל, משמש להתאמת pH</td></tr><tr><td>Lysozyme מחלבון ביצת עוף</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>L6876&nbsp;</td><td>אבקה שעברה ליופיליזציה, חלבון = 90%, = 40,000 יחידות/מ"ג חלבון (סיגמא)&nbsp;</td></tr><tr><td>בוחש מגנטי עם חימום,&nbsp; MR 3000K</td><td>Heidolph Instruments GmbH & Co.KG, גרמניה</td><td>504.10100.00</td><td>בוחש סטנדרטי במסגרת ניסוי</td></tr><tr><td>NB-Media DM180</td><td>Mast Diagnostica GmbH</td><td>121800</td><td>---</td></tr><tr><td>חומצה חנקתית (HNO3)CARL</td> <td>ROTH GmbH+CO. KG</td><td>HN50.1</td><td>סכנה; מחמצן, קורוזיה</td></tr><tr><td>PageRuler סולם חלבון לא מוכתם</td><td>ThermoScientific-Pierce</td><td>26614</td><td>---</td></tr><tr><td>Poly (נתרן 4-סטירנסולפונאט) (PSS)</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>243051</td><td>מגה-וואט ממוצע ~ 70,000</td></tr><tr><td>פוליאתילנימין (PEI), מסועף</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>408727</td><td>אזהרה; מזיק, מגרה, מסוכן לסביבה; ממוצע Mw ~ 25,000</td></tr><tr><td>אשלגן פחמתי נטול מים (K2CO3)</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>אזהרה 60108</td><td>; </td></tr><tr><td>מזיק ריבונוקלאז A מלבלב בקר&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ' ושות', LLC.</td><td>R5503</td><td>סוג I-AS, 50 - 100 יחידות קוניץ/מ"ג חלבון&nbsp;</td></tr><tr><td>נתרן אזיד (NaN3)</td><td>Merck KGaA</td><td>106688</td><td>סכנה; רעיל מאוד ומסוכן לסביבה</td></tr><tr><td>נתרן כלורי (NaCl)</td><td>CARL ROTH GmbH+CO. KG</td><td>3957.2</td><td>---</td></tr><tr><td>נתרן דודציל סולפט (SDS)</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>L-5750</td><td>סכנה;</td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסיד רעיל (NaOH)</td><td>CARL ROTH GmbH+CO. KG</td><td>6771.1</td><td>סכנה; קורוזיבי, משמש לוויסות pH בגידול והתאמת pH</td></tr><tr><td>Spectra/Por 6, קרום דיאליזה, MWCO 50,000&nbsp;</td><td>קארל רוט GmbH+CO. KG</td><td>1893.1</td><td>---</td></tr><tr><td>חומצה גופרתית (H2SO4)</td><td>CARL ROTH GmbH+CO. KG</td><td>HN52.2</td><td>סכנה; קורוזיבי, משמש לוויסות pH בגידול</td></tr><tr><td>חומצה טאנית (C76H52O46)</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>16201</td><td>---</td></tr><tr><td>TRIS HCl (C4H11NO3HCl)</td><td>CARL ROTH GmbH+CO. ק"ג</td><td>9090.2</td><td>---</td></tr><tr><td>טריטון X-100</td><td>קארל רוט GmbH+CO. KG</td><td>3051.3</td><td>אזהרה; מזיק, מסוכן לסביבה</td></tr><tr><td>VIVASPIN 500, 50,000 MWCO צינורות אולטרה-סינון</td><td>Sartorius AG</td><td>VS0132</td><td>---</td></tr><tr><td>&beta;-מרקפטואתנול</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>M6250</td><td>סכנה, רעיל</td></tr></tbody></table>

au-אינטראקציה של הפולימרים slp1 וחד שכבתי מ<em&gt; lysinibacillus sphaericus</em&gt; jg-b53 - qcm-d, icp-ms וafm ככלים לbiomolecule-מתכת לימודים

Au-Interaction of Slp1 Polymers and Monolayer from Lysinibacillus sphaericus JG-B53 - QCM-D, ICP-MS and AFM as Tools for Biomolecule-metal Studies

בפרסום זה מתוארת התנהגות ספיגת הזהב של חלבוני שכבת פני השטח (שכבת S) (Slp1) של Lysinibacillus sphaericus JG-B53. ביומולקולות אלו מסודרות במערכים דו-ממדיים פרה-קריסטליים על משטחים, קושרות מתכות, ולכן הן מעניינות עבור מספר יישומים ביוטכניים, כגון חומרים ביו-סורפטיים להסרה או התאוששות של יסודות שונים מהסביבה ותהליכים תעשייתיים. התצהיר של ננו-חלקיקי Au(0) על שכבות S, בין אם על ידי סינתזה מכוונת של שכבת S 1 או ספיחה של ננו-חלקיקים, פותח אפשרויות חדשות ליישומים חושיים מגוונים. למרות שמחקרים רבים תיארו את התכונות הביו-ספיגה של שכבות S 2-5, הבנה מעמיקה יותר של אינטראקציה בין חלבון לחלבון וחלבון-מתכת עדיין נותרה מאתגרת. במחקר הבא, נעשה שימוש בספקטרומטריית מסה בצימוד אינדוקטיבי (ICP-MS) לזיהוי ספיגת מתכות על ידי שכבות S תלויות. זה היה מתואם למדידות של מיקרו-איזון גבישי קוורץ עם ניטור פיזור (QCM-D), המאפשר זיהוי מקוון של היווצרות חד-שכבתית חלבונית ושקיעת מתכות, ובכך הבנה מפורטת יותר על קשירת מתכות.
תוצאות ICP-MS הצביעו על כך שהקישור של Au(III) לפולימרים בשכבת S המרחפים תלוי ב-pH. הקישור המקסימלי של Au(III) הושג ב-pH 4.0. חקירות QCM-D אפשרו זיהוי של ספיגה של Au(III) כמו גם שקיעה של Au(0)-NPs בזמן אמת במהלך הניסויים באתרם. יתר על כן, שיטה זו אפשרה לחקור את השפעת קשירת המתכת על יציבות סריג החלבון של Slp1. ניתן היה לדמיין תכונות מבניות ויציבות שכבת החלבון ישירות לאחר ניסוי QCM-D באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM). לסיכום, השילוב של שיטות שונות אלו מספק הבנה מעמיקה יותר של קשירת מתכות על ידי חלבוני שכבת S חיידקים בתרחיף או כחד-שכבות על תאי חיידקים או משטחים מגובשים מחדש.

<html> טיפוח של מיקרואורגניזמים וSlp1 אפיון הנתונים שנרשמו צמיחת חיידקים מציין את סוף שלב הצמיחה המעריכית בסביבות 5 שעות. חקירות קודמות הראו כי Slp1 יכול להיות מבודדת מנקודה זו של קציר (4.36 גר &#39;/ ביומסה הרטובה L (≈ 1.45 L / g (BDW)) עם תשואה מרבי 19. אף על פי כן, אופטימיזציה של טיפוח באמצעות רכיבי תקשורת מוגדרים או ס...

כדי לקבל מידע בסיסי על ספיגה ומיחזור של זהב ממערכות מימיות, נחקרה האינטראקציה של ננו-חלקיקי Au(III) ו-Au(0) על חלבוני שכבת S. הספיגה של פולימרים חלבונים נחקרה על ידי ICP-MS וזו של חד-שכבות חלבון על ידי QCM-D. AFM עוקב מאפשר הדמיה של הננו-מבנים.

Au-אינטראקציה של הפולימרים Slp1 וחד שכבתי מ<em&gt; Lysinibacillus sphaericus</em&gt; JG-B53 - QCM-D, ICP-MS וAFM ככלים לbiomolecule-מתכת לימודים

In this publication the gold sorption behavior of surface layer (S-layer) proteins (Slp1) of Lysinibacillus sphaericus JG-B53 is described. These ...

המטרה הכללית של ניסוי זה היא לבחון את התנהגות הספיחה של זהב על ידי חלבוני S-layer של זן החיידקים המוצג, מנקודת מבט אקולוגית וטכנולוגית. שיטות אלו יכולות לספק תשובה לשאלות מפתח במדעים הקשורים לסביבה, כגון תחומים של תהליכי ספיחה, הסרה והשבה של מתכות. היתרון העיקרי של טכניקות אלו הוא שניתן לזהות ספיחת מתכות ואדסורבציה של ננו-חלקיקים בטווח סדרי גודל שונים.באמצעות שימוש ב-QCM-D ניתן לזהות זאת במדידה בזמן אמת. כדי להתחיל בהליך זה, ציידו את תאי הנוזלים בבובות חיישן (sensor dummies). הזרים לפחות 20 milliliters לכל מודול של חומר ניקוי נוזלי בסיסי בריכוז 2% במים אולטרה-טהורים דרך מערכת ה-QCM-D והצינורות.לאחר מכן, השאיבו דרך המערכת מים מזוקקים (ultrapure water) בנפח של פי חמישה לנפח המודול, בקצב זרימה של עד 300 microliters לדקה, בהתאם לפרוטוקול היצרן. נקו את חיישני הסיליקה (silicon dioxide) מחוץ למודולי הזרימה על ידי הדגרה בתמיסת 2% sodium dodecyl sulfate למשך 20 דקות לפחות. לאחר מכן, שטפו את החיישנים מספר פעמים במים מזוקקים.לאחר ייבוש הגבישים באמצעות אוויר דחוס מסונן, הניחו אותם בתא ניקוי באוזון למשך 20 דקות. לאחר מכן, חזרו על הליך הניקוי פעמיים כדי להסיר את כל התכנים האורגניים. כדי להסיר מתכות קשורות מפני השטח של החיישן, שטפו את החיישנים בחומצה חנקתית בריכוז one molar.לאחר מכן, שטפו את החיישנים מספר פעמים במים אולטרא-טהורים. לאחר מכן, שנו את החיישנים באמצעות שלוש גרם לליטר של שכבות לסירוגין של polyethylenimine ו-polystyrene sulfonate בשיטת ציפוי טבילה (dip coating) באמצעות טכניקת שכבה על שכבה (layer by layer או LBL). הניחו את החיישנים בתוך תמיסת הפוליאלקטרוליט המתאימה בפלטות בעלות בארות עמוקות (deep-well plates) והדגירו אותם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.לאחר מכן, הוציאו את החיישנים מהתמיסה הפוליאלקטרוליטית ושטפו אותם במים אולטרה-טהורים באופן אינטנסיבי בין כל שלב של ציפוי טבילה. עם השלמת המודיפיקציה החיצונית, הכניסו את החיישנים לתוך מודול הזרימה. ייצבו את החיישנים על ידי שטיפה במים אולטרה-טהורים לפני תחילת הניסויים.בשלב זה, המיסו את חלבון ה-Slp1 שבודד וטוהר קודם לכן בתמיסת urea כדי להפוך את הפולימרים למונומרים. סובבו במערבל צנטריפוגי את החלבונים שהפכו למונומרים ב-15,000 ×g ובטמפרטורה של 4 °C למשך שעה אחת, כדי להסיר אגלומרטים גדולים של חלבון. ערבבו את תסננת ה-Slp1 המומסת והצנטריפוגית עם בופר לגבש מחדש (recrystallization buffer) עד לריכוז חלבון סופי של 0.2 g/L.לאחר גביש חוזר מוצלח של החלבון מעל החיישנים המ модиפיקציה פוליאלקטרוליט בתוך מודולי הזרימה, שטפו את החיישנים המצופים באינטנסיביות עם תמיסת גביש חוזר בקצב זרימה של 125 microliters per minute עד לזיהוי ערכים יציבים של הסטות בתדר ובדיספציה. לאחר ציפוי מוצלח של Slp1 במודולי הזרימה, שטפו את שכבת ה-Slp1 שהתקבלה באינטנסיביות עם תמיסת בופר ציטראט 1.6 millimolar pH 5.0 עד לזיהוי ערכים יציבים של הסטות בתדר ובדיספציה. לאחר מכן, הזרים תמיסת ננו-חלקיקים אחת millimolar שהוכנה מראש למודולי הזרימה בקצב זרימה של 125 microliters per minute.לאחר מכן, עקבו אחר ספיחת המסה לשכבת ה-Slp1. לאחר השלמת האינטראקציה עם ננו-חלקיקי המתכת, שטפו את השכבה עם בופר נטול ננו-חלקיקים כדי להסיר מתכות או ננו-חלקיקים הקשורים באופן חלש. באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי או AFM עם מיקרוסקופ אופטי הפוך, רשמו תמונות בנוזל תוך שימוש במים אולטרה-טהורים ישירות על חיישני ה-QCM-D המצופים.שטפו את החיישנים במים אולטרה-טהורים לאחר ניסויי ה-QCM-D והניחו אותם בתוך תא הנוזלים של ה-AFM. השתמשו בקוביה (cantilever) בעלת תדר תהודה של כ-25 kHz במים וקשיחות של פחות מ-0.1 N/m. כוון את מהירות הסריקה לטווח שבין 2.5 ל-10 µm/s.בצעו דגימה של תמונות במצב מגע דינמי (dynamic contact mode) בעוד הקנטילבר מעורר על ידי פיאזו (Piezo) בתדר התהודה שלו. לבסוף, קבעו את המרחק של הקנטילבר מהמשטח על ידי שיכוך התנודה. קיבולות הקישור המקסימליות למתכת של Slp1 תלוי על זהב הראו כי הוא נקשר באופן יציב במהלך דגירה של 24 שעות בטווח ה-pH שנבדק.הירידה המיידית בתדר מעידה על ספיחה מהירה ועל זיקה גבוהה של החלבונים לפני השטח המשופרים בפוליאלקטרוליט. גם הפיזור עולה באופן מיידי, מה שמעיד על ספיחה של מולקולות ויסקו-אלסטיות לפני השטח עקב שיכוך מהיר הגורם לעלייה בערכי הפיזור. ננו-חלקיקי זהב שסונתזו מראש הודגרו עם Slp1 ונאחרו באמצעות SDS-PAGE, מה שאישש את נתוני ה-QCM-D המראים כי הננו-חלקיקים אינם משבשים את מבנה ה-Slp1.הספיחה של ננו-חלקיקי זהב מתכתיים שהוכנו מראש מוצגת עבור ניסויי QCM-D בגרפים של delta F-delta D וכפרופילי עובי ומסה. סריג החלבון של Slp1 שהגביש מחדש על גבי חיישנים שעברו שינוי באמצעות פוליאלקטרוליט מוצג כאן. קבוע הסריג נקבע כ-13 עד 14 nanometers ועובי השכבה נמצא להיות 10 פלוס או מינוס שני nanometers.בדיקות AFM אישרו כי לאחר האינטראקציה עם זהב III, סריג ה-Slp1 נשאר שלם לחלוטין, דבר המאשש את תוצאות ה-QCM-D שחזו את יציבות הציפוי. AFM מאשר את הספיחה של ננו-חלקיקי זהב 0 על סריג ה-Slp1, אך בשל גודל החלקיקים, הם אינם עוקבים אחר הסימטריה p4 של Slp1. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו בתוך יום עבודה אחד אם היא מבוצעת כראוי.בעקבות שיטות אלו, ניתן לבצע טכניקות אחרות כגון ספקטרוסקופיה באינפרא-אדום או מיקרוסקופיית יוני הליום כדי לענות על שאלות נוספות, כגון אתרי קישור ספציפיים או אינטראקציה עם זהב או ננו-חלקיקי זהב. הטכניקה המוצגת סללה את הדרך עבור uzrachem לחקור אינטראקציות של ביו-מולקולות עם מתכות, ולמשל, את התנהגות הספיחה והדסורבציה על סוגים שונים של משטחים. לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה טובה של האופן שבו חוקרים אינטראקציות של מתכות עם ממסים ביולוגיים, וכשאתם משתמשים בשיטה זו, אנא אל תשכחו להשתמש במשקפי מגן, חלוק מעבדה וכמובן גם בכפפות.

au-interaction-slp1-polymers-monolayer-from-lysinibacillus-sphaericus

Research

JoVE Journal

Chemistry

כימיה

צלולוזומים הם קומפלקסים מולטי-אנזימים המיועדים לעיכול תאית. SMFS מבוסס AFM שימש לחקר התכונות המכניות ותצורת הקיפול של מכלולי חלבון הקשורים לתאית. אנו מציגים זרימת עבודה מלאה לקיבוע חלבונים, רכישת נתונים וניתוח נתונים כדי לחקור את האינטראקציות של קומפלקסים בודדים של קולטנים-ליגנדים המעורבים בהרכבת תאית.

חוקר מערכות קולטן ליגנד של Cellulosome עם המולקולה בודדת מבוססת AFM חיל ספקטרוסקופיה

מוצג פרוטוקול לחיבור מגוון גדול של מולקולות בודדות באופן קוולנטי לקצה AFM. ניתנים נהלים ודוגמאות לקביעת כוח ההדבקה והאנרגיה החופשית של מולקולות אלה על תומכים מוצקים וממשקים ביולוגיים.

חוקר מולקולה בודדת הדבקה על ידי הכוח האטומי ספקטרוסקופיה

אנו מתארים את הייצור והאפיון של מערכות ננו-ביולוגיות המממשקות מצעים ננו-מובנים עם חלבונים ואפטמרים משותקים. מדווחים על השלבים הניסויים הרלוונטיים הכוללים ייצור ליטוגרפי של מצעים ננו-מבניים, ביו-פונקציונליזציה ואפיון ספקטרוסקופיה רמאן משופרת פני השטח (SERS). זיהוי SERS של חלבונים משותקים על פני השטח, ובדיקה של קשירת חלבון-ליגנד ואפטאמר-ליגנד מודגמת.

משטח משופר ראמאן ספקטרוסקופיה איתור של מולקולות ביולוגיות באמצעות EBL מצעי Nanostructured המפוברק

הכנת שכבות דו-שכבתיות של שומנים מישוריים הנתמכים בזכוכית מתפקדת בחלבון, קביעת ניידות החלבון בפנים ומדידת צפיפות החלבון מוצגת כאן. מתוארת מפת דרכים לבניית מיקרוסקופ השתקפות פנימית כוללת מופחת רעש, המאפשרת הדמיה של פלואורוכרומים דו-שכבתיים בודדים ברזולוציה מרחבית-זמנית גבוהה.

המולקולה בודדת מיקרוסקופ פלואורסצנטי במישורים נתמך bilayers

עבודה זו מציג פרוטוקול טיפול נוזל וההכנסה מדגם על microchannel עבור באתרו זמן של טיסת ניתוח ספקטרומטריית משני יון המוני של ביומולקולות חלבון בתמיסה מימית.

באפיון באתרו של חלבונים מימה במים על ידי Salvi ו TOF-SIMS

אנו מציגים פרוטוקול functionalize זכוכית עם טלאי חלבון ננומטריים המוקפים bilayer שומנים נוזל. מצעים אלו עולים בקנה אחד עם מיקרוסקופיה אופטית מתקדמת וצפויים להוות פלטפורמה ללימודי הדבקה ו נדידת תאים.

מערכי ננו-אשכול ליגנד בתוך bilayer שומנים נתמך

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי לנטר את הרכבה ופירוק של הרעלן גחלת באמצעות biolayer אינטרפרומטריה (בלי). בעקבות הרכבה/פירוק על פני ביוסנסור, משתחררים את מתחמי חלבון גדולה מפני השטח עבור פריט חזותי וזיהוי של רכיבי מתחמי באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני ו ספקטרומטר מסה, בהתאמה.

ניתוח דינאמי חלבון מתחמי נאסף בנושא ושוחרר מן Biolayer אינטרפרומטריה ביוסנסור באמצעות ספקטרומטר מסה ואלקטרון

פרוטוקול זה מתאר את הנייח קוולנטיות של חלבונים עם heterobifunctional silane זיווג סוכן תחמוצת סיליקון משטחים המיועדים ספקטרוסקופיה בכוח כוח אטומי מבוסס מיקרוסקופיה מולקולה בודדת אשר הוא כשניסחתי האינטראקציה של RrgA (pilus-1 עצה adhesin של ס pneumoniae) עם fibronectin.

קיבעון קוולנטיות של חלבונים על ספקטרוסקופיה כוח מולקולה בודדת

כאן, אנו מציגים פרוטוקול המשלים מונומר חלבון על ידי אנזימים היוצרים פולימר פולימרי עם רצף מבוקר ומשתק אותו על פני השטח עבור לימודי מולקולה בודדת של כוח ספקטרוסקופיית.

OaAEP1-תיווך אנזימטית והשתק של חלבון פלסטריזציה לספקטרוסקופיית מולקולות יחיד

שומנים חד-שכבתיים שימשו כבסיס ליצירת גבישי חלבון דו-ממדיים (דו-ממדיים) למחקרים מבניים במשך עשרות שנים. הם יציבים בממשק מי האוויר ויכולים לשמש כחומר תומך דק להדמיית אלקטרונים. כאן אנו מציגים את הצעדים המוכחים על הכנת monolayers השומנים למחקרים ביולוגיים.

הכנה לדוגמה באמצעות שיטת חד שכבתית שומנים למחקרים קריסטלוגרפיים אלקטרונים

חקור את ספיחת הזהב באמצעות חלבוני S-layer מ-Lysinibacillus sphaericus באמצעות QCM-D, ICP-MS ו-AFM. שיטות אלו מאפשרות זיהוי בזמן אמת של ספיחת מתכות ואדסורפציית ננו-חלקיקים לשיקוף סביבתי וטכנולוגי.

Au-אינטראקציה של הפולימרים Slp1 וחד שכבתי מ Lysinibacillus sphaericus JG-B53 - QCM-D, ICP-MS וAFM ככלים לbiomolecule-מתכת לימודים (וידאו) | JoVE Journal

Au-אינטראקציה של הפולימרים Slp1 וחד שכבתי מ

גלה סרטונים נוספים