Name: אינדוקציה של מדינת איזואלקטרית מוח כדי לחקור את ההשפעה של פעילות סינפטית אנדוגני על העצבית רגישה In vivo (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: חקור תכונות נוירונים בודדים במצב מוח איזואלקטרי כדי להבין את השפעת הפעילות הסינפטית על חישוב תאי עצב. שיטה זו מאפשרת בידוד תכונות נוירונים מהרשת בסביבה פיזיולוגית שלמה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי תרומות של צרפת Fondation de, ומהמכון הלאומי דה לה סנטה et de la משוכלל ונדיר Medicale, פייר &amp; מארי קירי אוניברסיטת והתוכנית &#39;Investissements d&#39;Avenir&#39; ANR-10-IAIHU-06.

כל הנהלים בוצעו בהתאם להנחיות של האיחוד האירופי (הנחיה 2010/63 / EU) ואושרה על ידי הוועדה האתית צ&#39;רלס דרווין על ניסויים בבעלי חיים. אנו מתארים כאן הליך אנו משתמשים באופן שגרתי במעבדה שלנו, אולם רוב הפעולות ניתן להתאים כדי להתאים לצרכים הספציפיים של כל אחד. 1. הכנת כירורגים הערה: כל נקודות החתך ולחץ צריכות להיות שחדר שוב ושוב עם הרדמה מקומית (לידוקאין או bupivacaine). ההליך הנוכחי חולה במחלה ממארת, אם הכנה ספטית נדרש מספר שינויים צריך להיות מיושם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים חולדה עם pentobarbital נתרן (40 מ&quot;ג / ק&quot;ג) ו קטמין (50 מ&quot;ג / ק&quot;ג) בשני מקומית מופרדים intraperitoneal זריקות (IP). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו חיה ללכת בהרדמה כללית שוב ושוב לוודא מטוס כירורגית של הרדמה מושגת (אין תגובת בוהן הצובטת). מניחים את החולדה על Feedback שמיכת חימום וכנס בדיקה רקטלית כדי לשמור על טמפרטורת ליבה סביב 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח קטטר בתוך חלל הבטן כדי להקל ההזרקה הבאה של סוכני הרדמה כדי למנוע ניקוב ובאיברי דקירות מחט חוזרת 30. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קליפ השיער על גבר קטן (~ 2 - 3 מ&quot;מ) אזור מעל אזור הממוקם בתוך ברבע ימינה או שמאלה התחתונים של הבטן. הערה: קרם מקריח יכול לשמש גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך 2 - חתך מ&quot;מ 3 על העור במספריים חדים או אזמל. באמצעות דיסקציה בוטה, להסיר שכבות שומן ושריר עד חלל הצפק הוא ציין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס על 1 - 2 ס&quot;מ של קטטר קטן בחלל ולסגור את הפצע עם דבק כירורגי. (. למשל, 2 צרפתית - מתאימה 0.043 מ&quot;מ קוטר פנימיים): הערת הקוטר ואת האורך הכולל של קטטר צריך להיות מינימאליים כדי להפחית כרכים מתים. פוליאוריתן צינורות המתאימים ביותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע t לולאת התפרהוא קטטר על העור כדי לאבטח אותו במקומו. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקן צינורית לקנה הנשימה לשלוט אוורור במהלך להנשמה מלאכותית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באשר לשלב הקודם, להכין את האזור של עניין (1 - 2 סנטימטרים מעל קנה הנשימה ממש מעל manubrium), להסיר את השיער לחתוך את העור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלאנט לנתח את שכבות שומן והשרירים הראשונות, ולאחר מכן להעביר את בלוטת הרוק הצידה ולחשוף את קנה הנשימה על ידי לנתח את השכבה האחרונה של שרירים בעדינות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות את הרקמות מעל קנה הנשימה וחלק חוט מתחתיה באמצעות מלקחיים קטנים. הפוך קשר של מנתח עם ההברגה אבל לא חזק זה עדיין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך את transversally קנה הנשימה בין שתי טבעות סחוסים. דם ספוגי בתוך קנה הנשימה אם בכלל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחדיר צינורית לקנה נשימה עם הקוטר המתאים להדק את הקשר של החוט כדי לאבטח את הצינור יציב. לקבלת יציבות נוספת החוט יכול להיות מחובר נוסף בנקודה גבוהה יותר של הצינור לקנה הנשימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Suturדואר הפצע קרוב או להשתמש סיכות כירורגיות. הימנע דבק כירורגים כאן אם הצינור לקנה הנשימה נועד לעשות בה שימוש חוזר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקן את החיה בתוך מסגרת stereotaxic ובזהירות לפקח על משתנים פיזיולוגים הבאים: ECOG, 2 SpO, 2 Etco, קצב הלב (דרך רל, ECG) ולאחר הטמפרטורה הפנימית. צג ולהתאים משתנה אלה כדי לשמור על עומק נאות של הרדמת מצב פיסיולוגי. באופן ספציפי, להשלים הרדמה עם מנה קטנה (10 מ&quot;ג / ק&quot;ג) של נתרן pentobarbital במידת הצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל משחה על שתי העיניים כדי למנוע התייבשות. קליפ השיער על הקרקפת, לעשות חתך אורכי (~ 2 ס&quot;מ) לכרות את רקמות החיבור המכסה את הגולגולת באמצעות אזמל או המגרדת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע (קוטר ~ 1.5 מ&quot;מ) קטן craniotomy מעל האזור של עניין עם מקדח שיניים. הערה: כאן, בשדה החבית של הקליפה החושית העיקרית הוא ממוקד (7 - 8 מ&quot;מ קדמי אל קו interaural, 4.5- 5.5 מ&quot;מ לרוחב קו האמצע 31). יש לשטוף מספר פעמים כדי לפזר חום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במלקחיים קנס נוסף לעשות חור קטן בעדינות הדורה. שמור לאזור ~ 0.5 מ&quot;מ בתוך הניקור גולגולתי למקם את האלקטרודה ECOG (ראה השלב הבא). לצמיתות לשמור על קליפת לחה עם פתרון 0.9% NaCl (או נוזל Cerebro-השדרה מלאכותית). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים עכבה נמוכה (~ 60 קילו-אוהם) אלקטרודה כסף (האלקטרודה ECOG) על הדורה, הימנעות באזור קליפת המוח מכוסה ולא על ידי קרומי המוח, ומקום אלקטרודה השוואתית על שריר הקרקפת בצד השני של הראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב זה (30 דקות לאחר ההזרקה pentobarbital נתרן האחרון), לשמור על ההרדמה על ידי זריקות חוזרות ונשנות של pentobarbital נתרן (10-15 מ&quot;ג / ק&quot;ג / שעה) או פנטניל (3-6 מיקרוגרם / ק&quot;ג / שעה) באמצעות קטטר IP. לשעבר יגרמו תנודתית איטי, שינה דמוית, דפוס ECOG ואילו האחרונים יגרמו פרופיל desynchronized, להעיר דמוי, קליפת המוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם נ המלאכותימערכת entilation כך תדיר ונפח הנשימה דומים לאלו של הנשימה הספונטנית של העכברוש (טווח רגיל 70 - 115 נשימה / min 32). לאחר מכן, לחבר את הנשמה המלאכותית אל הצינור לקנה הנשימה ולאמת את אינפלצית כלוב בית החזה התקינה (משני הצדדים). אם לא, להתאים את המיקום של צינורות אוורור בציר קנה הנשימה. במידת הצורך, להתחנף הפרשת נוכח קנה הנשימה עם קטטר מחובר מזרק או משאבת ואקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם כל המשתנים הפיזיולוגיים 32-35 ו ECOG 29,36 דפוסי לשקף מטוס כירורגית יציבה של הרדמה, לעשות זריקה תוך שרירית של triethiodide gallamine בכל רגל לשתק את החולדה, 40 מ&quot;ג / ק&quot;ג עבור הזריקה הראשונה ולאחר מכן 20 מ&quot;ג / ק&quot;ג , כל 19,29,36,50 2hr. </li></ol> 2. הקלטות תאיות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך micropipette כוס (microelectrode חדה) עם ~ 0.2 מיקרומטר קצה כגון עמידותו נע between 50 ו -80 MΩ פעם מלאים 2 אצטט M אשלגן (KAC). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את פיפטה בבעל ספציפי עם חוט כסף / כסף-כלורי (Ag / AgCl) להתחבר הפתרון פיפטה למגבר תאי (דרך שלב ראש). הבעל יצורף micromanipulator. מניחים אלקטרודה התייחסות Ag / AgCl על שרירי הצוואר של החולדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט להכניס את פיפטה במוח עד אזור של אינטרס ולאמת עמידותו ידי ניטור המתח יורד בתגובה השלבים הנוכחיים. השתמש באז (או zap) כפתור של המגבר כדי לנקות את פיפטה במידת הצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש צמר גפן או משולשי קליטה סינטטיים לייבש את craniotomy (היזהר שלא לגעת ECOG או אלקטרודות תאיים) לפני כיסויה עם אלסטומר סיליקון או 4% agarose להפחית תנועות המוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנמיכים את פיפטה ב 1 - 2 מיקרומטר צעדים עד מגדילה את ההתנגדות שלה כאשר מתקרבים תא. ואז להשתמש בפונקציה באז של המגבר כדי penetraטה לתוך הנוירון. </li></ol> 3. להשרות מדינת איזואלקטרית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את פרוטוקול הניסוי המתאים (למשל, ירי תגובות זרמים מוזרקים intracellularly, יחסים נוכחי מתח, תגובות גירויים חושיות) בשלב זה תוך מעקב אחר בו זמנית פוטנציאל הממברנה של נוירון, את ECOG והמשתנים הפיסיולוגיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא כי האלקטרודה התאי יציב בתא על ידי ניתוח היציבות של שניהם פוטנציאל הממברנה ופעולת נכסים פוטנציאליים לאורך כל פגישת ההקלטה. אם לא, לא לעבור לשלב הבא ומתן עד ההקלטה הופכת יציבה שוב או לחפש נוירון אחר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק מינון גבוה אך אינפרא קטלני של pentobarbital נתרן (~ 90 מ&quot;ג / ק&quot;ג, יכול להיות נמוך כמו 35 מ&quot;ג / ק&quot;ג מן המצב ההתחלתי פנטוברביטול ועד 155 מ&quot;ג / ק&quot;ג מהמצב פנטניל הראשונית) דרך שורת IP. הערה: בתוך 15 - 20 דק &#39;ווה התאי ECOGveforms צריך להאט עם שתיקות חשמל לסירוגין זמני להגיע שנקרא &quot;פרץ-הדיכוי&quot; פרופיל 37,38, אשר בהדרגה מתמוטט למצב איזואלקטרית מלא. צפוי כי קצב הלב באופן משמעותי מאיטה (על ידי ~ 10 - 20%) אך SpO 2 ו Etco 2 צריך להישאר יציב יחסית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם מדינת איזואלקטרית לא הגיעה, להזריק כמות קטנה של נתרן pentobarbital (~ 10% ממינון שלב 3.1). מתן 15 דקות לפני הוספת הרדמה יותר אם מדינת איזואלקטרית עדיין אינה מושגת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על פרוטוקול הניסוי להשוות את ההשפעה של דינמיקת הרשת על המאפיינים אינטגרטיבי של נוירון נרשם. הערה: לאחר הפסקת זריקות הרדמה, הפעילות המוחית החשמל חייבת להתאושש באופן מלא בתוך 3 עד 4 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסוף הניסוי, להזריק מנה קטלנית של pentobarbital נתרן (200 מ&quot;ג / ק&quot;ג, IP) כדי להרדים את העכברוש. </li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

אנו מתארים כאן שיטה חדשה לדכא פעילות חשמלית מוחית ספונטנית vivo בשנייה רשת ורמות הסלולר. הליך זה מוביל למצב מוח קיצוני, המכונה בתרדמת איזואלקטרית 41. מנקודת מבט קליני, כזה חוסר פעילות electrocerebral היא הנורמליות החמורה ביותר, כי ניתן לראות על EEG. הוא בעיקר קשור הכרה בלתי הפיכה, עם כל המטופלים או למות או המתמשכת במצב וגטטיבי מתמשך 42, אבל יכול להיות לפחות הפוך חלקי כאשר נגרמו על ידי רעלת עם תרופות דיכאון מערכת עצבים מרכזיות (כגון thiopenta...

בהעדר כל גירויים סביבתיים או משימות התנהגותיות, המוח &quot;נח&quot; מייצר זרם רציף של הפעילות החשמלית כי ניתן להקליט מהקרקפת, כמו electroencephalographic גלים (EEG). שהמקבילה התאית של פעילות מוחית אנדוגני זה מאופיין בתנודות מתח הממברנה רקע (הידוע גם בשם &quot;רעש סינפטית&quot;), אשר מורכבות משילוב של פוטנציאלים סינפטיים מעוררים ו מעכבות המשקפים את הפעילות השוטפת של רשתות מביאות 1,2. פעילות ספונטנית זה משתנה תדירות אמפליטודה עם מצבים שונים של ערנות. הבהרת את ההשפעה של פעילות הרשת על רגישות והיענות של יחיד נוירונים הוא אחד האתגרים הגדולים של מדעי המוח 3,4. מחקרים ניסיוניים חישובית רבים בחנו את ההשפעה הפונקציונלית של פעילות סינפטית מתמשכת על propertie אינטגרטיביים של נוירונים. עם זאת, תפקידה של הפרמטרים העצביים השונים מושפעים רעשי הרקע הסינפטי נותר חמקמק. לדוגמה, הרמה הממוצעת של שלילת קוטביות הממברנה נמצאה חיובית 5,6 או לשלילה 7-9 בקורלציה עם היכולת של מסרים חושיים כדי לעורר פוטנציאל פעולה. יתר על כן, בעוד כמה חקירות מראות כי תנודות של פוטנציאל הממברנה, נובעות זרם משתנה ללא הרף של תשומות הסינפטי מביאות, מאוד משפיעות על התגובה של נוירונים בודדים על ידי ויסות הרווח של יחסי תשומה-התפוקה שלהם 3,10-13, אחרים מצביעים על כך שינויים במוליכות קלט קרום בתיווך מתגלגל על העיכוב מספיקים כדי לווסת את הרווח העצבי ללא קשר לעוצמת תנודות קרום 14,15. לבסוף, מחקרים שנעשו לאחרונה מתבצעות בעודם ערים הדגיש כיצד עיבוד המידע החושי ב נוירון בודד אנושות תלוי במצב של ערנותnd 16,17 הביקוש התנהגותיות הנוכחי. אסטרטגיה פשוטה כדי להבהיר את התפקיד הפונקציונלי של תהליך נתון במערכת זו בזו קשר הדוק היא לקבוע כיצד העדרו במיוחד משנה את תפקוד המערכת. שיטה זו נעשה שימוש נרחב במחקר מדעי המוח, למשל באמצעות נגעים ניסיוני או איון של אזורי מוח שונים 18-21, או מצור תרופתי של תעלות יונים ספציפיים 22,23. יש לציין, זה יושם vivo לחשוף כיצד דינמיקת קישוריות רשת פונקציונלית להשפיע חישוב תא בודד 24-27. עם זאת, עד כה מניפולציות מקומיות נועדו לחסום הירי של נוירונים ו / או להפריע מאפייני biophysical הבסיסיים שלהם יכולות להיות יעיל באופן חלקי מוגבלים נפחי מוח קטן יחסית 28. כדי להתגבר על המגבלות האלה, פיתחנו חדש גישה ניסויית vivo בהחולדה להשוות את התכונות אלקטרו של נוירונים בודדים רשמו במצב מוח נתון, כלומר, מוטבע ברשת מסוימת דינמית, לאלו שהושגו לאחר דיכוי מוחלט של פעילות סינפטית המוח כולו 29. בתנאים השליטים, שתי דינמיקת קליפת מוח מובהקת יכולה להיות שנוצרה. דפוסי שינה דמוי electrocorticographic (ECOG) היו המושרה על ידי הזרקה של מינון מתון של נתרן pentobarbital. לחלופין, גלי ECOG מהירים של משרעת קטנה השוואתיים לנעשה קליפת המוח הבסיסי המדינה הערה (דפוס ערות דמוית) יכולים להיות מיוצרים על ידי הזרקה של פנטניל. בהמשך לכך, תוך שמירה על אותה ECOG הקלטה תאית, השתקה מוחלטת של פעילות חשמלית במוח אנדוגני הושגה על ידי הזרקה מערכתית של מינון גבוה של נתרן pentobarbital, מאופיינת ECOG איזואלקטרית ופעילויות תאיות. מכיוון האינדוקציה של כזה בתרדמת קיצונית יכולה באופן פוטנציאלי consequen הקטלניתCES על תפקודים ביולוגיים, ניטור זהיר ומתמשך של משתנים פיזיולוגיים היה חיוני. לכן, אנו בקפדנות אחרת תדירויות פעימות לב, ריכוז הקצה גא CO 2 (Etco 2), רווית O 2 (SpO 2) חום ליבה של העכברוש ברחבי הניסויים. אנו מעריכים תכונות נוירונים בודדות במהלך מצבים שונים אלה באמצעות microelectrodes חדה, אשר מתאימות במיוחד להקלטות ארוכות ויציבות in vivo. ההליך המתואר כאן, ניתן לשלב עם גישות הדמיה אלקטרו ואחרים עם אפשרות להארכה עד במודלים של בעלי חיים אחרים.

<table><tbody><tr><td>נתרן Pentobarbital</td><td>Centravet</td><td>Pentobarbital</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine 500</td><td>Merial</td><td>Imalg&egrave; ne 500</td><td></td></tr><tr><td>פנטניל&nbsp;</td><td>Janssen-Cilag</td><td>פנטניל</td><td></td></tr><tr><td>Xylocaine</td><td>Centravet</td><td>Xylovet</td><td></td></tr><tr><td>Gallamine triethiodide</td><td>Sigma</td><td>G8134</td><td></td></tr><tr><td>מגבר ECoG</td> מגבר <td>AC של מערכות A-M Systems</td><td>, מגבר AC דגם 1700</td><td></td></tr> מכשירים <tr><td>מולקולריים</td><td>Axoclamp 900A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ממשק רכישת נתונים</td><td>קיימברידג' עיצוב אלקטרוני</td><td>הספק CED 1401-3&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת ניתוח נתונים</td><td>קיימברידג' עיצוב אלקטרוני</td><td>Spike2 גרסה 7</td><td></td></tr><tr><td>מיקרומניפולטור</td><td>Scientifica</td><td>IVM-3000</td><td></td></tr><tr><td>חולץ נימי</td><td>Narishige</td><td>PE-2</td><td></td></tr><tr><td>נימי זכוכית בורוסיליקט</td><td>מכשיר הרווארד</td><td>GC150F-10</td><td></td></tr><tr><td>חוט כסף 0.125 מ"מ (הקלטה תוך תאית)</td> <td>WPI</td><td>AGT0525</td><td></td></tr><tr><td>התייחסות Ag-AgCl</td><td>Phymep</td><td>E242</td><td></td></tr><tr><td>חוט כסף 0.25 מ"מ (הקלטת ECoG)</td><td>WPI</td><td>AGT1025</td><td></td></tr><tr><td>מערכת הנשמה מלאכותית</td><td>Minerve</td><td>Alpha Lab</td><td></td></tr><tr><td>ניטור פרמטרים פיזיולוגיים</td><td>Digicare</td><td>LifeWindow Lite</td><td></td></tr><tr><td>שמיכת חימום</td><td>מכשיר הרווארד</td><td>507215</td><td></td></tr><tr><td>סטריאומיקרוסקופ</td><td>Leica</td><td>M80</td><td></td></tr><tr><td>מספריים</td><td>FST</td><td>15005-08</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים דומונט #5</td><td>FST</td><td>11295-10</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים Dumont #5SF</td><td>FST</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>קטטר פוליאוריטן IP - 0.43x0.69 מ"מ&nbsp; &nbsp;</td><td>Instech</td><td>BTPU-027</td><td></td></tr><tr><td>סיליקון אלסטומר</td><td>WPI</td><td>KWIK-CAST</td> מקדחה דנטלית NSK <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>Y1001151 ו-P496</td><td></td></tr><tr><td>דבק כירורגי</td><td>3M</td><td>vetbond</td><td></td></tr></tbody></table>

אינדוקציה של מדינת איזואלקטרית מוח כדי לחקור את ההשפעה של פעילות סינפטית אנדוגני על העצבית רגישה<em&gt; in vivo</em

Induction of an Isoelectric Brain State to Investigate the Impact of Endogenous Synaptic Activity on Neuronal Excitability In Vivo

מידע תהליך נוירונים דרך תלוי הוא תכונות הממברנה הפנימיות שלהם ועל הדינמיקה של רשת הסינפטי מביא. בפרט, פעילות רשת שנוצרה באופן אנדוגני, אשר משתנית מאוד כפונקציה של מדינת ערנות, מודולציה חישוב עצבי משמעותי. כדי לחקור כיצד דינמיקת מוחות ספונטנית להשפיע נכסים אינטגרטיבית &#39;יחיד נוירונים, פתחנו אסטרטגיה ניסיונית חדשה בחולדה המורכבת בדיכוי in vivo כל הפעילות המוחית באמצעות הזרקה מערכתית של מינון גבוה של נתרן pentobarbital. פעילויות קורטיקלי, פיקוח רציף על ידי electrocorticogram המשולב (ECOG) והקלטות תאיות הם האטו בהדרגה, שמובילים פרופיל איזואלקטרית יציב. במצב המוח הקיצוני הזה, לשים את החולדה לתוך בתרדמת עמוקה, היה במעקב צמוד על ידי מדידה הקבועה הפיזיולוגית של החיה לאורך הניסויים. r התאיecordings אפשרה לנו לאפיין ולהשוות את המאפיינים אינטגרטיבי של אותו נוירון מוטבע לתוך הדינמיקה קליפת המוח רלוונטי מבחינה פיזיולוגית, כמו לאלה נתקל מחזור השינה והערות, וכאשר המוח שתק לגמרי.

התרמה ושמירת מדינת מוח איזואלקטרית הוא עדין הליך ניסיוני vivo. זה הוכח להיות כלי רב עצמה ישירות לחקור את ההשפעה של פעילות רשת קליפת מוח על רגישות עצבית והעברת פונקציה 29. איור 1 מציג את הניטור רב פרמטר, כולל ECOG וקבועים חיוניים, של המדינה הפיזיולוגית של בעלי החיים לפני (איור 1A ) ואחרי (אינדוקציה איור 1B) של המדינה איזואלקטרית. <p class="jove_content" fo:keep-toget...

הליך זה מבצע ארוך שנמשכות in vivo הקלטות תאיות מתא עצב אחד במצבי מוח רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית ואחרי ביטול מוחלט של פעילות חשמלית מתמשכת, וכתוצאה מכך במצב מוח איזואלקטרית. הקבועים הפיסיולוגיים של החיה מנוטרות בקפידה במהלך המעבר למצב בתרדמת המלאכותי.

אינדוקציה של מדינת איזואלקטרית מוח כדי לחקור את ההשפעה של פעילות סינפטית אנדוגני על העצבית רגישה<em&gt; In vivo</em

The way neurons process information depends both on their intrinsic membrane properties and on the dynamics of the afferent synaptic network. In ...

המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא להשרות מצב כללי של חוסר פעילות מוחית in vivo כדי לחקור תכונות משולבות של נוירונים בודדים בהיעדר קלטים סינפטיים. השיטה המוצגת כאן עשויה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בנורופיזיולוגיה, כגון הערכת ההשפעה של פעילות הרשת על חישובים של תאים בודדים או חקר התגובתיות של נוירונים במצבי תרדמה. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן לחקור תכונות נוירונליות בבידוד מהרשת בתוך תכשיר in vivo שלם.כדי להתחיל בפעולה זו, הנח חולדה המורדמת לחלוטין על שמיכת חימום. הכנס גשש רקטלי לגוף בעל החיים כדי לשמור על טמפרטורת הליבה סביב 37 מעלות צלזיוס. כדי להחדיר קטטר לחלל הפריטוניאל לצורך הזרקה עתידית של חומרי הרדמה, הסר תחילה את הפרווה מאזור קטן ברביע הימני או השמאלי התחתון של הבטן באמצעות קרם להסרת שיער.לאחר הזרקת חומר אלחוש מקומי, סטריליזרו את אזור הניתוח ובצעו חתך של שני עד שלושה מילימטרים בעור באמצעות מספריים חדות. בעזרת מספריים קהות, הסירו את שכבות השומן והשריר עד לחשיפת חלל הפריטונאום. לאחר מכן, הכניסו כמעט שני עד סנטימטר אחד של קטטר קטן לחלל וסגרו את הפצע באמצעות דבק כירורגי.צרו לולאה ותפרו את הקטטר לעור כדי לקבע אותו במקומו. כדי להתקין צינור קנה הנשימה לשליטה על ההוצאה למשך הנשמה מלאכותית, הסירו את השיער, סטריליזרו את האזור ובצעו חתך בעור מעל קנה הנשימה, ממש מעל למנובריום (manubrium). בצעו דיסקציה קהה לשכבה הראשונה של השומן והשרירים.הזיזו את בלוטת הרוק הצידה וחשפו את הקנה על ידי הפרדה עדינה של שכבת השרירים האחרונה. בדלו בזהירות את הקנה והחליקו חוט מתחתיו בעזרת פינצטה קטנה. לאחר מכן, קשרו קשר כירורגי רפוי בעזרת החוט.בצעו חיתוך רוחבי של הקנה בין שתי טבעות סחוס. לאחר מכן, הכניסו קנולה לקנה בקוטר המתאים והדקו את קשר החוט כדי להבטיח את קיבוע הקנולה. ליציבות נוספת, ניתן להצמיד את החוט לנקודה גבוהה יותר בקנולה של הקנה.יש לתפור או להשתמש בסיכות כירורגיות כדי לסגור את הפצע. לאחר מכן, העבירו את בעל החיים למסגרת סטריאוטקסית ומריחו משחת עיניים כדי למנוע התייבשות. לאחר מכן, מקמו גששים מתאימים לניטור המשתנים הפיזיולוגיים שלו, כגון an electrocardiogram, רוויית חמצן בדם ולחץ פחמן דו-חמצני בסוף הנשימה.לאחר מכן, הסירו את הפרווה מעל הקרקפת וסטריליזו את אתר הניתוח. בצעו חתך אורך של שני סנטימטרים והסירו את רקמות החיבור המכסות את הגולגולת באמצעות סקלפל. לאחר מכן, מרחו דבק כירורגי על הגולגולת והרקמות כדי לייצב את ההכנה.לאחר מכן, בצעו קרניאוטומיה קטנה בקוטר של 1.5 millimeter מעל האזור הרלוונטי באמצעות מקדח שיניים. לאחר מכן, השתמשו בפינצטה עדינה במיוחד ובמספרי ונה (vena scissors) כדי ליצור בעדינות חור קטן בעטיפת המוח (dura). השאירו אזור של 0.5 millimeter בתוך הטרפנציה הגולגולתית להצבת האלקטרודה האלקטרוקורטיקוגרפית.יש לוודא שהקורטקס נשאר לח באמצעות תמיסת נתרן כלוריד 0.9%, או aCSF. לאחר מכן, מקמי אלקטרודת ייחוס על שריר הקרקפת בצד הנגדי, והנח אלקטרודה אלקטרוקורטיקוגרפית בעלת התנגדות נמוכה על הדורה. כוונן את מערכת ההנשמה המלאכותית כך שתדר הנשימה ונפח הנשימה יהיו דומים לאלו של הנשימה הספונטנית של החולדה.אם כל המשתנים הפיזיולוגיים והדפוסים האלקטרוקורטיקוגרפיים הם בטווח הערכים הנורמליים, יש להזריק gallamine triethiodide לכל רגל כדי לשתק את בעל החיים. לאחר מכן, חברו את ההנשמה המכנית לצינור הקנה וודאו את הניפוח התקין של כלוב בית החזה בשני הצדדים. בשלב זה, משכו מיקרופיפטה מזכוכית עם קצה של 0.2 micrometer ומלאו אותה בתמיסת potassium acetate בריכוז two molar.הנח את הפיפטה במחזיק ייעודי עם חוט כסף/כלוריד כסף כדי לחבר את תמיסת הפיפטה למגבר תו-תאי. לאחר מכן, הנח אלקטרודת ייחוס של כסף/כלוריד כסף על שרירי צווארו של החולדה. הנח את הפיפטה מעל האזור המבוקש.החדירו לאט את הפיפטה אל תוך המוח עד לעומק הרצוי, תוך שימוש בכפתור ה-buzz של המגבר כדי לנקות את הפיפטה במידת הצורך. פקו על התנגדות הפיפטה על ידי איפוס מfalls המתח בתגובה למדרגות זרם באמצעות מעגל הגשר של המגבר. לאחר מכן, השתמשו במקלוני צמר גפן או במשולשי ספיגה סינתטיים כדי לייבש את אזור הקרניוטומיה, וכסו אותו באלסטומר סיליקון או ב-4% agarose כדי להפחית תנועות של המוח.לאחר מכן, הנמיכו את הפיפטה בצעדים של מיקרומטר אחד או שניים עד שההתנגדות שלה תעלה בעת ההגעה לתא. השתמשו בפונקציית ה-buzz של המגבר כדי לחדור אל הנוירון. ברגע שההקלטה תהיה יציבה, פצו על התנגדות האלקטרודה על ידי כיוון פרמטר ה-bridge בזמן שזרמי פולס קטנים מוזרקים אל הנוירון.לאחר מכן בצע את הפרוטוקול הניסויי המתאים, כגון הזרקת זרם לתא (intracellularly) כדי לחלץ תכונות אינהרינטיות של הנוירון או ביצוע גירויים חושיים. לאחר מכן, הזרק מנה גבוהה אך תת-קטלנית של sodium pentobarbital דרך הקו האינטraperitoneum. בתוך 15 עד 20 דקות, הפעילות התוך-תאית והפעילות האלקטרוקורטיקוגרפית אמורות להאט עם שתיקות חשמליות לסירוגין, עד להגעה זמנית לפרופיל ה-burst suppression, שיתכווץ בהדרגה למצב איזואלקטרי מלא.מצופה שקצב הלב יואט באופן משמעותי, אך ה-SPO2 וה-EtCO2 צריכים להישאר יציבים יחסית. לאחר מכן, חזור על פרוטוקול הגירוי כדי להשוות את השפעת דינמיקת הרשת על התכונות האינטגרטיביות של הנוירונים שהוקלטו. לאחר הפסקת הזרקות ההרדמה, הפעילות החשמלית של המוח אמורה להתאושש במלואה בתוך שלוש עד ארבע שעות.איור זה מציג פעילות תאיית ופעילות אלקטרוקורטיקוגרמה ספונטנית בשני מצבים של הרדמה, המדמים את הדינמיקה הקורטיקלית הנוצרת אנדוגנית במהלך השלבים המוקדמים של השינה, או בזמן ערות. המצב הדמוי-שינה משרה על ידי הזרקת sodium pentobarbital, והמצב הדמוי-ערות על ידי fentanyl. בשני המקרים, הזרקה עוקבת של מינון גבוה של sodium pentobarbital הובילה לביטול מוחלט של הפעילות הספונטנית ב-ECOG ובנוירונים שהוקלטו בו-זמנית, ומכאן המונח איזואלקטרי.דיכוי הפעילות הסינפטית השוטפת הוביל להיפר-פולריזציה משמעותית של פוטנציאל ממבנה התא העצבי. ניתן להפיק תגובות הנגרמות על ידי זרם לפני ואחרי השראת המצב האיזואלקטרי. הדבר מאפשר השוואה של פעילויות מוחיות שונות על פונקציית המעבר של קלט-פלט של נוירונים, המתבטאת כקצב הירי המעורר העיקרי בתגובה למדרגות זרם בעוצמה עולה.במהלך ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להשאיר את בעל החיים בתנאים פיזיולוגיים מיטביים כדי להשיג הקלטה באיכות טובה הקשורה לדינמיקה מוחית אמינה. גישה זו יכולה לשמש בהמשך כמודל למחקר תגובתיות נוירונים במצבי תרדמה עמוקה, הפיכים או בלתי הפיכים.

induction-an-isoelectric-brain-state-to-investigate-impact-endogenous

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

סרטון זה מדגים הקלטה של אותות חשמליים מתאי עצב במוח יחיד באמצעות מיקרופיפטה מזכוכית עדינה ומערך מיוחד. המיקרופיפטה מוחדרת בזהירות למוחה של החולדה ומזמזמת כדי לחדור לתא העצב כדי לרשום אותות חשמליים פנימיים של תאי עצב.

הקלטה ב-Vivo של אותות תוך-תאיים מתא עצב יחיד

כאן, אנו יוצרים פיפטה מזכוכית עם פונקציות כפולות: עיכוב מבני מוח עמוקים על ידי הזרקות מיקרו של תרופות וניטור בזמן אמת של השפעותיהן באמצעות הקלטות אלקטרופיזיולוגיות בו זמנית.

אלקטרו הקלטה בו זמנית ומייקרו-הזרקות של סוכנים מעכבים במוח מכרסם

מחקרים הראו שגירוי זרם ישר טרנס-גולגולתי קתודלי יכול לייצר השפעות מדכאות על התקפים עמידים לתרופות. במחקר זה, תוכנן מערך ניסוי במבחנה שבו הוערכו גירוי הזרם הישר ורישום מערך מרובה אלקטרודות של פעילות דמוית התקף בהכנת פרוסות מוח של עכברים. פרמטרי הגירוי בזרם ישר הוערכו.

גירוי ישיר שוטף הקלטת מערך רבה-אלקטרודה של פעילות כמו-תפיסת עכברי הכנת פרוסת המוח

אנו מציגים שיטות לבניית אלקטרודות לרישום בו זמנית של פעילות עצבית חוץ-תאית ולשחרור חומרים נוירואקטיביים מרובים בקרבת אתרי ההקלטה בעכברים ערים. טכניקה זו מאפשרת ניתוח מפורט של קלטים סינפטיים מקומיים משוערים לנוירון המעניין.

הקלטה תאית של העצבית פעילות משולבת עם Microiontophoretic יישום של חומרי Neuroactive עכברי Awake

אנו מדגימים כיצד לבצע הקלטה וחשמליים מודולציה של פעילות אפילפטית 4-aminopyridine-induced פרוסות המוח מכרסמים באמצעות מערכי microelectrode. חדר הקלטה מותאמת אישית שומר על רקמות הכדאיות ברחבי מישיבות ניסיוני. חיים מיפוי אלקטרודה, מבחר זוגות מגרה מבוצעות על ידי ממשק משתמש גרפי מותאם אישית.

הקלטה של אפנון של הפעילות פרוסות המוח מכרסמים מצמידים מערכים Microelectrode

מודלים התקף אקוטי חשובים ללמוד המנגנונים אפילפטית אירועים. יתר על כן, היכולת להפיק אפילפטית אירועים לפי-דרישה מספק שיטה יעילה במיוחד ללמוד רצף האירועים שבבסיס בהכנסתם המדויק. כאן, אנו מתארים את הדגמים פרכוס קורטיקלית פמפרידין חריפה נוסדה בשנת רקמה אנושית של עכבר.

חניכה הדור, על פי דרישה חריפה פעילות התקפי. מכרסם, רקמה אנושית

גזע המוח מעורר תגובה audiometry הוא כלי חשוב נוירופיזיולוגיה קלינית. כיום, גזע המוח התגובה עורר מאומטריה הוא גם מיושם במדע הבסיסי מחקרים טרום קלינית מעורבים הן מודלים תרופתי וגנטי בעלי חיים. כאן אנו מספקים תיאור מפורט של איך התגובות שמיעתי גזע המוח ניתן להקליט וניתח בהצלחה בעכברים.

רכישת נתונים וניתוח בברטומטריה תגובה מעורר בעכברים

ניתן להשתמש בפרוסות מוח Ex vivo כדי לחקור את ההשפעות של חומרי הרדמה נדיפים על תגובות מעוררות לתשומות אפרינטיות. אופטוגנטיקה משמשת להפעלה עצמאית של אפרנטים תלמוקורטיים וקורטיקוקורטיקליים לניאוקורטקס שאינו ראשוני, ותגובות סינפטיות ורשתיות מווסתות עם איזופלורן.

הפעלה אופטוגנטית של מסלולים אפרנטיים בפרוסות מוח וויסות תגובות על ידי הרדמה נדיפה

כאן אנו מציגים פרוטוקול המתאר התמרה ויראלית של אזורי מוח בדידים עם מבנים אופטוגנטיים כדי לאפשר אפיון אלקטרופיזיולוגי ספציפי לסינפסה בפרוסות מוח של מכרסמים חריפים.

אקס ויוו חקירה אופטוגנטית של העברה סינפטית ארוכת טווח ופלסטיות מקליפת המוח הקדם-מצחית האמצעית ועד קליפת המוח האנטורינלית הלטרלית

אנו מתארים פרוטוקול להערכת עקומות מנה-תגובה לגירוי חוץ-גולגולתי במונחים של מדידות שדה חשמלי במוח וזרימת דם רלוונטית של סמן ביולוגי-מוחי. מכיוון שפרוטוקול זה כולל החדרת אלקטרודות פולשניות למוח, יש צורך בהרדמה כללית, כאשר נשימה ספונטנית עדיפה על פני נשימה מבוקרת.

מיקום אלקטרודות מעוררות חוץ-גולגולתיות ומדידת זרימת דם מוחית ושדות חשמליים תוך גולגולתיים בעכברים מורדמים

כאן, אנו מתארים פרוטוקול להשראת פלסטיות ארוכת טווח של ריגוש פנימי עצבי בנוירוני ממסר מגרעין הגניקולט הצדדי הגבי הנשמר בפרוסות מוח ex vivo.

השראת פלסטיות לטווח ארוך של ריגוש עצבי פנימי בתאי עצב של גרעין הגניקולט הצדדי הגבי

חקור תכונות נוירונים בודדים במצב מוח איזואלקטרי כדי להבין את השפעת הפעילות הסינפטית על חישוב תאי עצב. שיטה זו מאפשרת בידוד תכונות נוירונים מהרשת בסביבה פיזיולוגית שלמה.

אינדוקציה של מדינת איזואלקטרית מוח כדי לחקור את ההשפעה של פעילות סינפטית אנדוגני על העצבית רגישה

גלה סרטונים נוספים